馬鈴薯瘡痂病高效拮抗菌的篩選及鑒定

高同國++姜軍坡++郭曉軍++張冬冬++朱寶成

摘要：為獲得對馬鈴薯瘡痂?。╬otato scab）病原菌具有較強拮抗作用的優(yōu)良菌株，以筆者所在實驗室保存的237株細菌為出發(fā)菌株，采用十字交叉劃線法和平板擴散法進行初篩和復篩。經(jīng)篩選后得到1株拮抗活性明顯的菌株 12-82，其抑菌圈直徑達26.2 mm。經(jīng)菌落菌體形態(tài)觀察、16S rRNA基因序列分析及生理生化試驗，將菌株12-82初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），該研究為開發(fā)防治馬鈴薯瘡痂病的生物菌劑奠定了基礎。

關鍵詞：馬鈴薯瘡痂??；生物防治；解淀粉芽孢桿菌；菌種鑒定；生物菌劑

中圖分類號： S435.32文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0157-03

收稿日期：2015-11-17

基金項目：河北省自然科學基金（編號：C2015204031）。

作者簡介：高同國（1984—），男，河北邢臺人，博士，講師，主要從事植物真菌病害及生物防治研究。E-mail：gtgrxf@163.com。

通信作者：朱寶成，博士，教授，博士生導師，主要從事微生物發(fā)酵秸稈飼料研究。E-mail：baochengzhu@126.com。

馬鈴薯種植區(qū)域廣泛，僅次于水稻、小麥和玉米。近年來，馬鈴薯瘡痂?。╬otato scab）的發(fā)生逐漸加重，已成為馬鈴薯主要病害之一。該病主要由鏈霉菌引起，可危害馬鈴薯塊莖，感病的薯塊表面形成痂狀病斑，影響馬鈴薯的外觀品質(zhì)，從而降低薯塊的商品價值[1-2]，嚴重時還會延遲馬鈴薯出苗，甚至減少產(chǎn)量[3]。在我國，引起瘡痂病的病原菌有瘡痂鏈霉菌（Streptomyces scabies）、酸性瘡痂鏈霉菌（S. acidiscabies）、腫痂鏈霉菌（S. turgidiscabies）和加利利鏈霉菌（S. galilaeus）等多種病原菌[4-5]。

目前缺乏有效手段防治馬鈴薯瘡痂病，而利用生物防治方法越來越多地引起人們的重視。Beauséjour等利用生物制劑與殼聚糖結合用于防治瘡痂病取得良好效果[6]。Neeno-Eckwall等在田間試驗中使用S.diastatochromogenes PonSSII防治瘡痂病，癥狀明顯減輕[7]。Hiltunen等報道利用非致病性鏈霉菌也可以防治瘡痂鏈霉菌[8-10]。劉大群等采用生防拮抗鏈霉菌防治馬鈴薯瘡痂病，結果表明，不同的菌系有明顯的防效差異，單個拮抗菌的防效優(yōu)于2個拮抗菌的混合使用效果[11]。另外，利用微生物代謝產(chǎn)物防治瘡痂病也是有效手段之一，Han等報道利用芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝物macrolactin A有效地防治馬鈴薯瘡痂病，使瘡痂病的發(fā)病率降低了40%[12]。

本研究以瘡痂病病原菌瘡痂鏈霉菌作為指示菌，從筆者所在實驗室保存的237株細菌中篩選對瘡痂病有拮抗作用的菌種，并通過菌落菌體形態(tài)特征、16S rRNA基因序列和生理生化特性對拮抗活性較強的菌株進行鑒定，該研究以期為馬鈴薯瘡痂病的生物防治提供理論基礎。

[BT1#]1材料與方法

1.1試驗菌株

馬鈴薯瘡痂病病原菌：瘡痂鏈霉菌，來源于河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理實驗室。237株細菌來源于河北農(nóng)業(yè)大學生命科學院制藥工程系。

1.2供試培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂15.0～20.0 g，加H2O至1 L，pH值7.0～7.2；NA培養(yǎng)基中不添加瓊脂為NB培養(yǎng)基；燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）：瓊脂18.0 g，加2%燕麥汁至1 L，調(diào)pH值至7.2。以上培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌30 min。

1.3方法

1.3.1制備病原菌孢子懸浮液

將病原菌接種于OMA固體培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。取10 mL無菌水于長滿瘡痂病病原菌的培養(yǎng)皿中，用玻璃棒輕刮培養(yǎng)物表面的孢子，再用裝有脫脂棉的5 mL無菌注射器筒過濾除去菌絲團，濾液倒入離心管中，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，使孢子沉淀，離心完畢后倒掉上清，將離心管在漩渦混合器上振蕩，使孢子沉淀物分散于殘存的無菌水中。在無菌條件下，將制備好的菌種用無菌水稀釋，孢子懸浮液的濃度不低于 107 CFU/mL。

1.3.2拮抗菌篩選

初篩：取100 μL孢子懸浮液均勻涂抹在OMA平板上，將已活化的待篩選菌種以十字劃線方式接種于培養(yǎng)皿中。28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察抑菌圈的大小。

復篩：將NA培養(yǎng)基上活化好的待篩選細菌接種于NB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min發(fā)酵48 h，10 000 r/min離心10 min，收集上清液，并經(jīng)細菌濾器（0.22 μm）過濾，即得無菌發(fā)酵液，待用。取100 μL孢子懸浮液均勻涂抹在OMA平板上，將培養(yǎng)皿平均分為4個扇形區(qū)域，在扇形中央用打孔器打1個直徑6.0 mm的孔，用移液器取50 μL無菌發(fā)酵液滴于孔內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)7 d，測量抑菌圈的直徑（mm）。每處理重復3次。

1.3.316S rRNA基因PCR擴增

用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）提取菌株的總DNA[13]，選用16S rRNA基因通用引物進行PCR擴增。正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物為1492R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。25 μL PCR反應體系：DNA模板2 μL，10×緩沖液2.5 μL，正向引物與反向引物各0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.25 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR結束后，采用1%瓊脂糖凝膠對PCR結果進行檢測，并交華大基因進行序列測定。將菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中已知的核酸序列進行BLAST比對，獲得相近屬種菌株序列，利用ClustalX 1.83、MEGA 5軟件構建 Neighbour-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4形態(tài)學與生理生化鑒定

將優(yōu)良拮抗細菌菌株接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)并經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[14]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[15]，采用細菌微量生化反應管對硝酸鹽還原、大分子利用、酶類利用以及耐鹽性等生理生化指標進行測定。

2結果與分析

2.1對馬鈴薯瘡痂病菌的抑菌效果

從237株細菌中篩選得到4株對病原菌抑制效果較好的菌株，分別為3011、Z-6、12-82、12-34（圖1），其中菌株 12-82抑菌活性最強，抑菌圈直徑達26.2 mm。

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2.2菌落、菌體形態(tài)

拮抗菌株12-82在NA培養(yǎng)基平皿上生長良好，菌落形態(tài)呈圓形或近圓形，略隆起，乳白色，不透明，表面光滑，無色素產(chǎn)生，延長培養(yǎng)時間發(fā)現(xiàn)，菌落干燥，有褶皺及突起，邊緣不整齊（圖2-A）。在光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)革蘭氏染色后的拮抗細菌12-82菌株的菌體呈桿狀（圖2-B）。

2.3總DNA提取和16S rRNA基因擴增結果

進一步采用16S rRNA基因?qū)卓辜毦?2-82進行分子水平鑒定。首先采用CTAB法提取細菌的總DNA（圖3），表明該DNA可用于PCR擴增。

用16S rRNA基因通用引物27F、1492R對菌株12-82總DNA進行PCR擴增，擴增結果具有單一特異性條帶（圖4），可直接將PCR產(chǎn)物送華大基因進行測序。

以菌株12-82的總DNA為模板，PCR 擴增得到該菌株1.5 kb左右的基因片段，測序后提交GenBank獲取登錄號（KT247502），經(jīng)BLAST比對獲取若干同源序列。用 MEGA 5 構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），可見菌株12-82與Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42的親緣關系最近（9778%）。

2.4生理生化試驗結果

根據(jù)菌落菌體形態(tài)及16S rRNA基因鑒定結果，對菌株12-82的生理生化性質(zhì)進行測定。從表1可見，菌株12-82經(jīng)動力試驗、伏-普反應（Voges-Proskauer reaction，簡稱 V-P反應）、接觸酶、糖類發(fā)酵、硝酸鹽還原、酪素水解、檸檬酸鹽利用、明膠水解、淀粉水解等反應均為陽性，甲基紅、丙二酸鹽反應均為陰性，與已報道的解淀粉芽孢桿菌性質(zhì)一致。

綜合菌株12-82的形態(tài)特征、16S rRNA基因序列及菌株[CM（25]的生理生化特性，對照《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，鑒定拮抗菌12-82菌株屬于解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

3討論

馬鈴薯瘡痂病是難以防治的世界性土傳病害，目前缺乏防治該病害的有效手段，而生物防治已成為防治植物病害的有效手段，芽孢桿菌因營養(yǎng)簡單、繁殖速度快、可產(chǎn)生內(nèi)生芽孢、抗逆能力強、易定殖等優(yōu)點而逐漸成為世界生物防治的重點。郭鳳柳等對從土壤中分離的對瘡痂病病原菌具有拮抗活性的菌株B1進行了鑒定，菌株B1屬于枯草芽孢桿菌[16]。李勇篩選出1株對瘡痂病有抑制作用的枯草芽孢桿菌ZWQ-1，其抑菌帶寬度最高為18.75 mm[17]。除上述報道外，國內(nèi)關于瘡痂病生物防治的報道較少。

本研究從筆者所在實驗室保存的237株細菌中篩選獲得1株對瘡痂病病原菌瘡痂鏈霉菌具有較強拮抗作用的菌株 12-82，其抑菌圈直徑達26.2 mm。經(jīng)形態(tài)觀察、16S rRNA基因序列分析及生理生化試驗，初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本研究增加了國內(nèi)研究馬鈴薯瘡痂病生防菌株資源，為菌株12-82抑菌機制研究及應用奠定了基礎。

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