副豬嗜血桿菌實驗室診斷方法研究進展

馬樹芳 趙小勇 程志偉

（山東省濱州市濱城區(qū)北鎮(zhèn)獸醫(yī)站 256600）

副豬嗜血桿菌實驗室診斷方法研究進展

馬樹芳 趙小勇 程志偉

（山東省濱州市濱城區(qū)北鎮(zhèn)獸醫(yī)站 256600）

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的呼吸道傳染病，主要感染斷奶前后仔豬，引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，已嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，因此早期診斷有助于防控該病。本文對副豬嗜血桿菌病實驗室診斷方法及其研究現(xiàn)狀進行了綜述。

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis，HPS)引起豬的以纖維素性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的傳染病。該病在全世界均有發(fā)生，通常見于5-8周齡的豬，發(fā)病率一般在10%-15%，嚴重時死亡率可達50%。隨著規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌的發(fā)病率呈現(xiàn)遞增趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大的經(jīng)濟損失。因此，有必要對副豬嗜血桿菌病的診斷方法做全面的了解。及時、準確地診斷出該病并采取相應(yīng)的措施是成功防制副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵。臨床上可根據(jù)該病的流行特點、臨床特征和病理剖檢變化做出初步診斷，但確診需要進行實驗室檢驗。目前，常用的實驗室診斷方法包括細菌分離與鑒定、血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。

1 細菌分離與鑒定

（1）細菌的分離鑒定對副豬嗜血桿菌病的確診很有必要，也是當前最準確有效的診斷方法。但該菌的分離是很困難的，對病料、采集時間、培養(yǎng)基都有很高要求。一般應(yīng)選取臨床癥狀典型且最好未經(jīng)抗生素治療的病豬，采取人工致死的方法，從全身各個部位采取新鮮病料，且從采集病料到送檢一般不超過24h。同時應(yīng)注意的是，僅從鼻腔、扁桃體或氣管等組織臟器中分離細菌，對于評估是否由HPS引起的致病是沒有意義的，應(yīng)從全身多個部位如心包、關(guān)節(jié)、心血、腦脊液等處進行病原分離。（2）副豬嗜血桿菌對生長環(huán)境的要求極為苛刻，且生長依賴外源NAD(V-因子)(Kielstein等，2001)?，F(xiàn)在常用馬、綿羊或者牛的鮮血做成巧克力培養(yǎng)基，但菌落仍然生長很差，形成大約0.5mm的灰白色透明的菌落。但在含有V因子的TSA或者TM/SN上生長較好。葡萄球菌可產(chǎn)生V因子，需V因子的副豬嗜血桿菌可在其周圍生長呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”。本菌可分解蔗糖和尿素，不分解乳糖、甘露醇和麥芽糖，對葡萄糖發(fā)酵不穩(wěn)定；醋酸鉛試驗呈陰性，硝酸鹽還原試驗呈陽性。

2 血清學(xué)方法

（1）臨床上用于檢測HPS抗體的方法有補體結(jié)合試驗(CF)、間接血凝試驗(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。CF和IHA存在檢測特異性不強，敏感性較低、穩(wěn)定性較差。ELISA方法檢測HPS較為敏感和特異，因而在HPS的臨床檢測上優(yōu)于前者。（2）王艷等(2006)選用全菌作為包被抗原建立HPS抗體間接ELISA方法，具有較好的試驗效果。石碧等(2007)提取HPS細菌的莢膜多糖(CPS)，并以其為抗原分別建立了間接ELISA和間接血凝試驗(IHA)兩種抗體診斷技術(shù)，兩種檢測方法均有很好的特異性，但ELISA是IHA檢測方法敏感性的5-10倍。馮小明等(2009)將HPS菌體超聲裂解，取上清作ELISA包被抗原，建立了HPS抗體間接ELISA方法。賈愛卿等(2011)將HPS外膜蛋白omp P2基因插入表達載體pET-32a，轉(zhuǎn)化BL21進行誘導(dǎo)表達，以純化的omp P2蛋白作抗原，建立了間接ELISA方法。李鵬等(2011)將HPSP2蛋白基因亞克隆到原核表達載體pET-32a構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-P2，在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達了可溶性融合蛋白P2-His；利用純化融合蛋白為抗原，建立了抗HpsP2蛋白抗體的間接ELISA方法。李淼等(2011)將重組表達的omp P2純化后作為抗原，建立了HPS間接ELISA方法。鄭念廣等(2011)高溫高壓處理HPS 4型和5型耐熱蛋白混合作為包被抗原，建立了檢測副豬嗜血桿菌抗體的間接ELISA方法，該方法特異性和重復(fù)性良好，檢測結(jié)果與國外試劑盒一致。陳善真等(2011)利用表達純化的HPS外膜蛋白也建立了間接方法，應(yīng)用結(jié)果與HPS臨床分離率接近。

3 分子生物學(xué)方法

臨床病原分離的諸多不確定性需要一種新的技術(shù)來代替，而分子生物學(xué)技術(shù)的引入就是一個突破，其中PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便等優(yōu)點，同時克服了培養(yǎng)困難、血清學(xué)檢測易發(fā)生交叉反應(yīng)的缺點，在診斷HPS病時具有明顯的優(yōu)勢，并得到了廣泛的應(yīng)用。

3.1 普通PCR法 （1）Oliveira等(2001)建立一種PCR方法最低檢測量為102CFU/mL，其敏感性遠遠高于常規(guī)的細菌分離法，24h內(nèi)可報告檢測結(jié)果，并具有高度特異性。以從豬器官中經(jīng)常分離到的15種細菌和A.nidohucs抽提的DNA為模板利用該方法進行檢測，前者全為陰性后者觀察到一個弱的條帶。由于A.nidolcius主要存在于正常豬的上呼吸道，因此該法可以全身系統(tǒng)收集的樣本作為模板，用于發(fā)病豬場全身感染情況的確定。del Rio等(2003)以PCR-RFLP法對15種副豬嗜血桿菌標準菌株和101株副豬嗜血桿菌臨床分離株的tbpA基因進行分析，結(jié)果前者產(chǎn)生12種不同的圖譜，血清型5、12、14和15具有共同的酶切圖譜;后者表現(xiàn)出33種RFLP圖譜，其中有10株細菌與標準菌株產(chǎn)生的圖譜一致。林雪玲等(2006)在細菌學(xué)鑒定基礎(chǔ)上，設(shè)計合成3對引物，分別以分離菌株的DNA為模板進行PCR擴增，結(jié)果均擴增出副豬嗜血桿菌的822bp、824bp和1.9kb的預(yù)期特異性條帶。該方法特異性與敏感性高、適用性強，不僅可從初代分離培養(yǎng)物中對HPS進行鑒定和感染確診，而且可以直接對病料進行HPSPCR檢測。李鵬等(2010)設(shè)計了能擴增HPS OMP P2基因的1080bp片段的引物，并證明用該法可有效地鑒定或診斷HPS，這種PCR的敏感性達到了1000個HPS。劉建奎等(2012)針對HPS 16S rRNA序列設(shè)計1對特異性引物，建立了快速準確鑒定HPS的PCR方法，臨床試驗證明該方法具有很好的特異性和敏感性。（2）周勇岐等(2007)以HPS的16SrRNA基因為模板設(shè)計合成引物，建立了HPS-PCR檢測方法。利用該方法可以有效區(qū)分胸膜肺炎放線桿菌、副雞嗜血桿菌等與HPS同源性較高的細菌。尹秀鳳等(2007)用建立的豬嗜血桿菌PCR方法檢測人工感染發(fā)病仔豬及自然感染仔豬肺組織，并結(jié)合細菌分離培養(yǎng)，證明以肺臟組織為病料，通過細菌分離培養(yǎng)，再用PCR法鑒定分離菌體，可有效地用于HPS的診斷。米豐泉等(2005)在已經(jīng)建立的豬胸膜肺炎放線桿菌(APP)、豬多殺性巴氏桿菌(PM)、副豬嗜血桿菌的單項PCR診斷方法的基礎(chǔ)上，通過對擴增條件的篩選，成功地建立了APP、PM、HPS復(fù)合PCR診斷方法，并應(yīng)用臨床診斷。利用一次PCR反應(yīng)，即可同時擴增APP的342bp、PM的457bp和HPS的821bp的特異性片段，該方法的建立對臨床上進行這3種疾病的鑒別診斷和混合感染的檢測都具有重要意義。張盼鋒等(2009)針對HPS 16S rRNA基因特異性PCR引物序列，合成1對PCR引物，建立相應(yīng)的PCR檢測方法。結(jié)果顯示可檢測出濃度為2.8×103CFU/mL的HPS，表明該方法靈敏度高；對大腸桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、沙門氏桿菌、金黃色葡萄球菌進行PCR擴增均不獲得任何條帶，表明該方法特異性較強。所以該方法對于臨床快速檢測Hps具有重要意義。萬世平等(2009)設(shè)計了1對針對HPS 16S rRNA基因的引物，建立了能特異性檢測Hps的PCR檢測方法。對傳染性胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等均無交叉反應(yīng)，擴增的目的條帶的大小為821bp。

3.2 實時熒光定量PCR方法 （1）實時熒光定量PCR法是將光譜技術(shù)和 PCR技術(shù)相結(jié)合的一種核酸定量檢測技術(shù)，與常規(guī)PCR方法比有很多優(yōu)點，如反應(yīng)時間短，擴增產(chǎn)物不需用瓊脂糖凝膠電泳檢測，全封閉反應(yīng)，更高的檢測特異性與敏感性。（2）于江等(2010)建立了HPS SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法，建立的檢測方法不與其它豬源性病原菌發(fā)生交叉反應(yīng)，有很好的特異性，敏感性是常規(guī)PCR的100倍，批內(nèi)、批間重復(fù)試驗變異系數(shù)均不大于2.5%，穩(wěn)定性好。李軍等(2011)建立了快速定量檢測HPS的實時熒光定量PCR方法，其變異系數(shù)均小于2%，檢測的最低限度是50copies/μl。苗立中等(2012)建立了HPS SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法。建立了標準曲線，線性關(guān)系在102～108copies/μL非常好；敏感性為10copies/μL，是常規(guī)PCR的100倍；變異系數(shù)均不大于2.5%，并且對HPS檢測的特異性很好。李富祥等(2013)根據(jù)HPS 16S rRNA基因的保守序列設(shè)計特異性引物和TaqMan探針，建立了HPS TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。該方法與巴氏桿菌、沙門氏菌、乳桿菌鏈球菌、腸球菌、葡萄球菌、豬肺炎支原體等很多細菌無交叉反應(yīng)；標準品濃度在6.92×108-6.92×103copies/μl范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低可檢測到6.92×101copies/μl的標準品陽性質(zhì)粒；批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于3%。臨床樣品檢測結(jié)果表明，該方法具有敏感性高、特異性好、穩(wěn)定性強和快速的優(yōu)點，可用于HPS感染的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查以及HPS的定量分析。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù) （1）環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)技術(shù)是一種核酸等溫擴增技術(shù)，具有操作簡單、成本低、檢測效率高等特點，非常適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。但是，實際操作中，由于其靈敏度高，一旦開蓋容易形成氣溶膠污染，結(jié)果出現(xiàn)假陽性，采用實時渾濁儀可以有效避免這個問題，另外LAMP對引物設(shè)計要求高，因此對HPS的引物仍需進行進一步改善，確保結(jié)果穩(wěn)定性。（2）吳詩敏等(2010)根據(jù)HPS 16S rRNA基因設(shè)計引物，使用Bst大片段聚合酶，以提取的細菌基因組DNA為模板進行等溫擴增。結(jié)果表明，建立的方法能在65min完成檢測全過程，檢測到HPS DNA的最小量為0.2pg，是常規(guī)PCR的1000倍。朱杰儀等(2010)建立的HPS環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法在恒溫(63℃)條件下特異性強，靈敏度高，最低檢測量達到0.3pg DNA，檢測敏感性是常規(guī)PCR的100倍。車勇良等(2013)建立了HPS可視化LAMP檢測方法，在55℃水浴1h即可對HPS基因組DNA進行擴增，在反應(yīng)后的體系中加入SYBR Green I，即可對結(jié)果直接觀察做出判斷。該方法具有很強的特異性，其對DNA核酸的最低檢測限為40fg，是常規(guī)PCR檢測最低限的100倍，顯示出較高的敏感性。用建立的LAMP方法對8株不同血清型HPS進行檢測，結(jié)果均為陽性。

4 小結(jié)

伴隨我國養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，該病的流行越來越廣泛，已經(jīng)成為呼吸道疾病綜合癥中的重要疾病，對豬的危害日趨嚴重，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，快速、準確地診斷出該病并采取相應(yīng)的措施是成功防治該病的關(guān)鍵，還能及早發(fā)現(xiàn)新菌株，鑒別最危險的病原菌并開發(fā)相關(guān)疫苗，在防控疫情時掌握主動權(quán)。隨著各種靈敏度高、專屬性強的實驗室檢測方法的不斷改進，對于該病的診斷已更加客觀和迅速，尤其是對疫苗免疫后抗體水平的檢測及HPS的流行病學(xué)調(diào)查更加重要，對于指導(dǎo)副豬嗜血桿菌病的防控具有重要意義。

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