水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法研究與應(yīng)用進(jìn)展

許惠濱，朱永生，連 玲，蔣家煥，江敏榕，謝華安*，張建福*

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，福建福州 350019；2.農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福州（國(guó)家）水稻改良分中心/福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南研究基地/福建省作物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室/福建省水稻分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350003）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為植物分子生物學(xué)研究的有效手段，更是研究基因克隆和功能基因組不可或缺的工具。近年來，遺傳轉(zhuǎn)化方法不斷創(chuàng)新、增多。早在20世紀(jì)80年代末和90年代初，人們就利用聚乙二醇（PEG）法、脂質(zhì)體法、電擊法、基因槍法以及花粉管通道法等DNA直接導(dǎo)入基因轉(zhuǎn)化法進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化［1-4］。直到20世紀(jì)90年代中期，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法才開始被應(yīng)用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化［5］。雖然直接轉(zhuǎn)化法有許多優(yōu)點(diǎn)，但因其操作繁瑣、外源基因插入多拷貝性、不完整性、轉(zhuǎn)化率較低以及外源DNA的整合機(jī)制、表達(dá)調(diào)控和遺傳規(guī)律等理論問題還不清楚等等一系列缺點(diǎn)，而不被廣泛采用。與直接轉(zhuǎn)化法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短、能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，而且在理論上和技術(shù)上操作都比較成熟，因此倍受青睞。文章現(xiàn)對(duì)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的幾種方法進(jìn)行簡(jiǎn)單綜述，對(duì)比它們的優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用情況。

1 PEG法

PEG法是植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中較早建立且應(yīng)用廣泛的一個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。其主要原理是化合物聚乙二醇（PEG）、多聚L-鳥氨酸（pLO）和磷酸鈣在高pH值條件下誘導(dǎo)原生質(zhì)體攝取外源DNA分子。具有對(duì)細(xì)胞傷害少、避免嵌合體產(chǎn)生、受體不受限等優(yōu)點(diǎn)?？偟膩碚f，PEG直接轉(zhuǎn)化法在目前具有一定的應(yīng)用價(jià)值，特別是禾本科植物的遺傳轉(zhuǎn)化，利用該法已使許多禾本科植物成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，如水稻。但是由于它以原生質(zhì)體為受體，易產(chǎn)生白化苗，轉(zhuǎn)化率低，而且建立原生質(zhì)體的再生系統(tǒng)比較困難［6］，所以沒有被廣泛推廣。

2 脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體（Liposome）法是根據(jù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能特征，用脂類物質(zhì)合成的雙層膜囊將DNA 或RNA 包裹成球狀，導(dǎo)入原生質(zhì)體或細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化的目的。根據(jù)操作方法的不同，把脂質(zhì)體法分為兩種：a.脂質(zhì)體融合法（liposome fusion），即先將脂質(zhì)體與原生質(zhì)體共培養(yǎng)，使它們發(fā)生膜融合，然后利用原生質(zhì)體的吞噬作用，使其將脂質(zhì)體內(nèi)的外源DNA或RNA分子轉(zhuǎn)入其內(nèi)，最后通過原生質(zhì)體的再生培養(yǎng)，產(chǎn)生新的植株；b.脂質(zhì)體注射法（liposome injection），即通過顯微注射把含有外源DNA或RNA分子的脂質(zhì)體注射到植物細(xì)胞中，以獲得成功轉(zhuǎn)化的方法。

3 電擊法

電擊法（Eletroporation）又稱為電穿孔法，其原理是利用高壓電脈沖作用于受體細(xì)胞膜上，使其形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA或RNA的攝取。電擊法具有操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化率高，對(duì)受體細(xì)胞無特殊選擇性且適于瞬時(shí)表達(dá)研究等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是電穿孔易損傷原生質(zhì)體，降低其再生率；而且該法必須經(jīng)過原生質(zhì)體培養(yǎng)，而原生質(zhì)體的分離比較繁瑣；同時(shí)電擊法所用的儀器比較昂貴。將電擊法與PEG法和脂質(zhì)體法等結(jié)合使用，有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。此外，隨著“電注射法”的發(fā)明與應(yīng)用，省略了原生質(zhì)體的制備過程，不但提高了植物細(xì)胞的存活率，而且簡(jiǎn)便易行，現(xiàn)已在水稻上獲得轉(zhuǎn)基因植株［7］。

4 基因槍法

基因槍法（Particle gun）又稱微彈轟擊法（Microprojectiole bombardment），其基本原理是將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒表面，利用高壓將微粒高速射入受體細(xì)胞，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后，隨機(jī)整合到植物基因組中，實(shí)現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。與其它遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，基因槍轉(zhuǎn)化法具有無宿主限制；靶受體類型廣泛，可以是胚、愈傷組織，也可以是懸浮細(xì)胞或其他細(xì)胞、組織［8］；可控度高；操作簡(jiǎn)便快速，甚至可克服無菌操作困難等優(yōu)點(diǎn)，這使其成功應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化，特別是單子葉植物。然而，它也存在一些缺點(diǎn)及需要改進(jìn)的問題。由于基因槍轟擊的隨機(jī)性，外源基因進(jìn)入宿主基因組的整合位點(diǎn)相對(duì)不固定，拷貝數(shù)往往較多，這樣轉(zhuǎn)基因后代容易出現(xiàn)突變、外源基因容易丟失且易引起基因沉默，不利于外源基因在宿主細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)［9］，此外基因槍的價(jià)格昂貴、運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用高，使其沒有被廣泛應(yīng)用。

5 花粉管通道法

花粉管通道法（Pollen-tube pathway）的主要原理是：利用植物受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵中，并進(jìn)一步整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而形成攜帶有目的基因的新個(gè)體。它有效地利用了植物自然生殖過程，避開了植株再生的難題，而且轉(zhuǎn)化不受基因型限制，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化成本也較低，與農(nóng)桿菌介導(dǎo)法相比，它可以得到大量未經(jīng)初步篩選的種子。因此，建立一種準(zhǔn)確、快速、有效的檢測(cè)方法就成為花粉管通道轉(zhuǎn)化法的關(guān)鍵技術(shù)。然而它也存在一些不足之處，如技術(shù)不太完善，對(duì)轉(zhuǎn)化機(jī)制缺乏系統(tǒng)的研究，操作過程帶有一定的盲目性，且隨機(jī)性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率較低等［10］。

6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。存在根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌兩類轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌，它們均普遍存在于土壤中，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠自發(fā)感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位。在根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上都有一段T-DNA（T-DNA region）， 即 轉(zhuǎn) 移 -DNA（transfer-DNA），又稱為T區(qū)（T region），農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，將T-DNA插入并整合到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。水稻遺傳轉(zhuǎn)化中較常使用的是Ti質(zhì)粒，還未見有關(guān)Ri質(zhì)粒對(duì)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道［11］。

6.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的研究

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法已成功應(yīng)用于許多雙子葉植物，然而在單子葉植物特別是禾本科植物中的應(yīng)用起初卻發(fā)展緩慢，這主要是因?yàn)閱巫尤~植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，農(nóng)桿菌無法將外源DNA整合到單子葉植物基因組中。然而，隨著農(nóng)桿菌侵染機(jī)理的進(jìn)一步研究，對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行有效的修飾，使其成為單子葉植物的理想轉(zhuǎn)化載體。1986年，Baba 等［12］采用聚乙二醇（PEG）法將農(nóng)桿菌與水稻原生質(zhì)體融合起來，得到了一部分能夠合成胭脂堿的胚性愈傷，開創(chuàng)了農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的新篇章。從此，人們對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化展開了廣泛的研究。1990年Raineri等［13］以及1992年Chan等［14］分別以成熟胚和離體根為材料，均未得到任何轉(zhuǎn)基因植株。1993年報(bào)道了首例農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻幼胚遺傳轉(zhuǎn)化［15］，表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化取得了正式成功。隨后，Hiei等［16］于1994年實(shí)現(xiàn)了對(duì)粳稻的高頻轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率高達(dá)28.6%。至此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)得到了突破性進(jìn)展，并逐漸邁向成熟。

在最近的十幾年里，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化更是取得了顯著進(jìn)展。首先是1996年，Rashid等［17］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功轉(zhuǎn)化秈稻Basmati系列水稻，接著Dong等［18］也成功轉(zhuǎn)化了爪哇稻；其次，Zhang等［19］以幼胚和胚性愈傷組織為外植體，通過對(duì)外植體進(jìn)行真空浸透處理，顯著提高了轉(zhuǎn)化率 ；隨后，林擁軍［20］、Lin and Zhang［21］分別建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻和秈稻的高效轉(zhuǎn)化體系；2006年，Seiichi Toki等［22］把誘導(dǎo)5 d的水稻成熟胚愈傷直接用于農(nóng)桿菌侵染，并成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，這樣不僅避免了體細(xì)胞在繼代過程中所產(chǎn)生的突變，而且大大縮短了整個(gè)轉(zhuǎn)化周期；2009年，Lin and Zhou等［23］利用穿刺法成功進(jìn)行粳稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，這種方法不經(jīng)愈傷的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化周期比快速轉(zhuǎn)化法更短。

6.2 影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化率的因素

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)桿菌菌株與水稻細(xì)胞互作的結(jié)果，凡是能夠影響農(nóng)桿菌侵染力和水稻細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)答能力以及轉(zhuǎn)化子再生能力的各種因素，均可對(duì)轉(zhuǎn)化的效果產(chǎn)生影響，歸結(jié)起來主要包括兩個(gè)方面：一是農(nóng)桿菌侵染體系；二是水稻的組織培養(yǎng)與再生體系。

6.2.1 農(nóng)桿菌侵染體系 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化中，選擇正確的菌株與載體組合至關(guān)重要。不同的農(nóng)桿菌菌株具有不同的宿主范圍，所以不同的菌株對(duì)同一受體的轉(zhuǎn)化效率存在差別。根據(jù)侵染能力的強(qiáng)弱，農(nóng)桿菌可分為普通菌株和超毒菌株，超毒菌株是通過對(duì)普通菌株的進(jìn)一步改造獲得的，如EHA101和EHA105。近來的研究又衍生出了一種超毒菌株以外的新的轉(zhuǎn)化體系，即超雙元載體［24］。為了克服單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化敏感性差的問題，利用超毒力菌株和超雙元載體，增強(qiáng)農(nóng)桿菌的侵染能力和T-DNA的整合能力，從而有效地提高了轉(zhuǎn)化效率［25］。水稻轉(zhuǎn)化中常用的菌株為普通菌株LBA4404和超毒菌株EHA101，EHA105和AGL1等。1998年，劉巧泉等［26］以及后來易自力等［27］分別對(duì)比了 LBA4404、EHA105和 AGL1三種農(nóng)桿菌菌株對(duì)水稻愈傷組織的轉(zhuǎn)化能力，發(fā)現(xiàn)三者存在差異，其中EHA105菌株的轉(zhuǎn)化效果最好，因此，目前水稻的遺傳轉(zhuǎn)化普遍使用超毒菌株EHA105。

Vir基因位于Ti質(zhì)粒上，它能夠激活T-DNA的轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。Vir區(qū)由VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG及VirH等7個(gè)互補(bǔ)群基因組成，它的活化對(duì)于T-DNA的加工、運(yùn)輸和整合發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

選擇標(biāo)記的功能是在特定的選擇壓力下把轉(zhuǎn)化體選擇出來，為了實(shí)現(xiàn)這一目的，首先要在篩選培養(yǎng)基中加入特定的選擇劑，使其產(chǎn)生一定的選擇壓力，使得未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能生長(zhǎng)和發(fā)育。其次，選擇標(biāo)記基因的產(chǎn)物對(duì)選擇劑具有抗性，從而使轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受選擇劑的影響，正常生長(zhǎng)和發(fā)育，最終實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體的選擇。

6.2.2 水稻的組織培養(yǎng)與再生體系 水稻基因型也是影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要因素之一。1986年，Abe and Futsuhara等［28］對(duì)66種不同的粳稻和秈稻品種進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同品種的可培養(yǎng)性存在顯著性差異。盡管粳稻［29］、秈稻［30］和爪哇稻［31］都已經(jīng)建立了相應(yīng)的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系，然而不同的水稻品種對(duì)農(nóng)桿菌的敏感程度不一樣，通常粳稻的轉(zhuǎn)化較易成功，且轉(zhuǎn)化率高，而秈稻，則比較困難，再加上秈稻愈傷誘導(dǎo)和再生不敏感［32］，其轉(zhuǎn)化率通常不超過10%［31］。

選擇適合的轉(zhuǎn)化受體是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件。目前認(rèn)為植物體的任何組織和器官都可以作為轉(zhuǎn)化的外植體，然而由于它們的脫分化和再分化能力、細(xì)胞全能性及感受態(tài)程度等存在很大的差別，即使同一組織器官的不同部位的差異也是顯著的。因此不同的外植體，培養(yǎng)的效果不同。通常選擇幼年型、增殖能力強(qiáng)、具有較強(qiáng)再生能力且遺傳穩(wěn)定性好的外植體，如胚、頂端分生組織、幼穗等。水稻中的幼胚和成熟胚均是很好的轉(zhuǎn)化受體，雖然幼胚的轉(zhuǎn)化效率較成熟胚高，但由于幼胚的取材受時(shí)間和空間的限制，而成熟胚取材方便，且不受季節(jié)限制，因此水稻的遺傳轉(zhuǎn)化主要以成熟胚作為轉(zhuǎn)化受體。

一個(gè)好的再生系統(tǒng)需要有一種最佳的培養(yǎng)基與之相適應(yīng)。迄今為止已研制出許多基本培養(yǎng)基的配方，主要有MS、NB、N6和CC等，它們既有共性，也存在特異性。其中共性主要表現(xiàn)在都含有無機(jī)鹽、有機(jī)成分和蔗糖等，特異性則表現(xiàn)在所含成分的種類或含量不同。不同的水稻品種對(duì)培養(yǎng)基的要求不一樣，其中NB適合粳稻和秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)。同時(shí)在組織培養(yǎng)過程中，通常會(huì)往基本培養(yǎng)基中添加適量的不同種類的激素，它們的主要功能表現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)愈傷組織和生根等。

7 討論

選擇適合的轉(zhuǎn)化受體是實(shí)現(xiàn)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的先決條件。人們已成功利用水稻的幼胚、成熟胚、葉片和幼穗等進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。這些不同的分生組織與器官的愈傷誘導(dǎo)率與質(zhì)量卻存在顯著差異，其中幼胚的誘導(dǎo)率最高，且愈傷質(zhì)量最好，其次是成熟胚。可是由于幼胚要在水稻開花10～15 d內(nèi)取材，而且要及時(shí)消毒，不能放置太久，受時(shí)間和空間限制，而成熟胚取材方便，不受季節(jié)限制，因此通常以水稻的成熟胚作為轉(zhuǎn)化受體。

愈傷組織褐化是影響愈傷組織質(zhì)量的重要因素之一。褐化是指外植體在組織培養(yǎng)過程中，由于機(jī)械損傷造成傷口處分泌出酚類化合物，有氧條件下，酚氧化酶催化氧化酚類物質(zhì)產(chǎn)生醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)而導(dǎo)致組織褐變，并逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制其它酶的活性，毒害整個(gè)外植體。褐化抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，并影響其發(fā)育。造成愈傷組織褐化的因素有很多，包括外植體的基因型和生理狀態(tài)、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等。不同基因型的外植體在誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)過程中的褐化率不一樣，因此，在相同的培養(yǎng)條件下，應(yīng)選擇褐化程度相對(duì)較輕的外植體。培養(yǎng)基的成分以及所含激素的種類和含量都會(huì)影響愈傷組織的褐化率。通過往培養(yǎng)基中加入適量的激素以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，減少細(xì)胞過度吸水，最終降低愈傷組織褐化死亡的頻率。培養(yǎng)條件也是引起愈傷組織褐化的主要原因，包括溫度、pH值以及繼代時(shí)間等。

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