特發(fā)性膜性腎病患者血清中小麥蛋白抗體的水平變化及意義

朱超亞，劉志剛，黃俊，魏清柱，劉愛群，吳碧芳，洪國(guó)保，祝爽爽，鄒和群

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院·泌尿疾病研究所，廣州 510630；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 3廣州市第一人民醫(yī)院)

特發(fā)性膜性腎病患者血清中小麥蛋白抗體的水平變化及意義

朱超亞1，劉志剛2，黃俊3，魏清柱1，劉愛群1，吳碧芳1，洪國(guó)保1，祝爽爽1，鄒和群1

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院·泌尿疾病研究所，廣州 510630；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 3廣州市第一人民醫(yī)院)

目的 探討特發(fā)性膜性腎病(IMN)患者血清中小麥蛋白抗體的水平變化及意義。方法 運(yùn)用液氮研磨丙酮提取法粗提取小麥總蛋白，以此蛋白作為抗原，采用ELISA雙抗體間接法檢測(cè)40例IMN患者(IMN組)、34例其他腎小球腎炎患者(其他腎炎組)和40例健康人(對(duì)照組)血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA和IgE水平，并對(duì)患者進(jìn)行食物過敏情況問卷調(diào)查，觀察小麥蛋白特異抗體水平明顯變化患者的臨床特征。結(jié)果 IMN組血清中小麥蛋白特異性IgG水平低于對(duì)照組(P<0.01)、其他腎炎組(P<0.05)；其他腎炎組與對(duì)照組比較，P﹥0.05；各組血清中小麥蛋白特異性IgA水平比較，P>0.05；各組血清中均未檢測(cè)到小麥蛋白特異性IgE。與其他腎炎組比較，IMN組血清肌酐、24 h尿蛋白定量升高，血漿白蛋白降低(P均<0.05)；兩組eGFR比較，P﹥0.05。20例血清中小麥蛋白特異性IgG抗體水平明顯降低(低于中位數(shù))的IMN患者中12例尿蛋白大于5 g/24 h，且血清白蛋白水平<20.0 g/L。結(jié)論 IMN 患者血清中小麥蛋白特異性IgG升高，IgA、IgE無變化，IgG可能與IMN發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

特發(fā)性膜性腎??；小麥蛋白抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

膜性腎病是一種以腎小球毛細(xì)血管袢上皮側(cè)下大量免疫復(fù)合物沉積，并伴有腎小球基底膜彌漫增厚及足細(xì)胞足突廣泛融合為特征的病理診斷[1]。根據(jù)其病因分為特發(fā)性、繼發(fā)性及家族性三大類，而原因未明的特發(fā)性膜性腎病(IMN)約占2/3[2],其是導(dǎo)致成人出現(xiàn)腎病綜合征最常見原因[3，4]。隨著病情緩慢進(jìn)展，IMN患者中有30%～50%可在20年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎臟病。然而，IMN的確切病因及致病機(jī)制仍不明確。2011年Debiec等[5]研究發(fā)現(xiàn)，陽離子牛血清白蛋白(BSA)可能是兒童，特別是小于5歲的IMN患兒的主要致病靶抗原之一，而牛奶是獲得這一致病抗原的主要途徑，這提示食物抗原可能導(dǎo)致或參與IMN的發(fā)病。目前在國(guó)內(nèi)尚未見食物抗原與IMN發(fā)病關(guān)系的報(bào)道,我們率先研究了國(guó)內(nèi)IMN患者與食物小麥的關(guān)系，檢測(cè)和比較了IMN患者、其他腎臟疾病患者及健康人血清中小麥粗提蛋白特異性抗體IgG、IgA和IgE水平，旨在初步探討小麥在IMN發(fā)病中可能存在的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年11月于南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢病理診斷為IMN的患者40例(IMN組)，男21例、女19例，年齡(47.65±13.46)歲；經(jīng)腎活檢病理診斷為其他腎小球腎炎患者34例(其他腎炎組)，包括IgA腎病患者15例、系膜增生性腎小球腎炎患者7例、局灶性節(jié)段性腎小球硬化患者3例、微小病變腎病患者3例、狼瘡膜性腎病患者3例，血管炎性腎病患者、乙肝相關(guān)性系膜增生性腎小球腎炎患者、糖尿病腎病患者各1例，該組中男15例、女19例，年齡(35.85±12.09)歲。選取40例健康體檢結(jié)果無異常發(fā)現(xiàn)的健康體檢者(對(duì)照組)，其中男22例、女18例，年齡(38.65±10.61)歲。IMN患者除外過敏性紫癜、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤等繼發(fā)性病因者。對(duì)照組均無腎病及其他疾病個(gè)人史和家族史，尿常規(guī)、腎功能及其他健康體檢實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果均正常。IMN組年齡高于其他腎炎組及對(duì)照組，性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 臨床資料收集 收集血肌酐、血清白蛋白、24 h尿蛋白，采用腎臟病膳食改良試驗(yàn)簡(jiǎn)化公式計(jì)算GFR估算值(eGFR)，MDRD簡(jiǎn)化公式：eGFR=[175× (Scr)-1.234×(年齡)-0.179×(男性,×0.79)]。并對(duì)所有入組者進(jìn)行食物過敏情況問卷調(diào)查。

1.3 小麥蛋白粗提取 將小麥放入液氮中研磨成粉末后，轉(zhuǎn)移燒杯中加4 ℃預(yù)冷的丙酮浸泡(按1體積粉末加4體積丙酮比例)，放入冰水中冰浴，放4 ℃冰箱。期間每隔2小時(shí)更換新的丙酮，直至丙酮澄清，放置4 ℃冰箱1 d。倒去上層丙酮，將沉淀在燒杯底部的蛋白倒在保鮮膜上或者錫紙上鋪開，放在通風(fēng)廚吹干。吹干后，將粉末收集到燒杯中，加入PBS磁鐵攪拌子攪拌溶解，4 ℃冰箱中，攪拌過夜，或用分散儀破碎。溶解完后冷凍離心機(jī)上10 000 r/min離心15 min，取上清繼續(xù)離心，共3次。上清液在冰上用0.45 μm分子篩注射過濾，收集過濾液，即為蛋白粗提液。用BCA試劑盒測(cè)蛋白濃度，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。剩余蛋白粗提液凍存于-80 ℃冰箱待用。根據(jù)測(cè)得濃度上樣50 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行)。

1.4 各組血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA、IgE的檢測(cè) IMN組和其他腎炎組留取腎活檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血，對(duì)照組留取清晨空腹靜脈血，標(biāo)本均采5 mL，置于促凝劑試管中，立即用離心機(jī)離心15 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,分離留取上層血清,凍存于-80 ℃冰箱待檢。采用ELISA雙抗體間接法檢測(cè)：將小麥粗提蛋白用CBS稀釋至1 μg/mL，向96孔板中每孔加入稀釋后的小麥蛋白液100 μL，置4 ℃冰箱過夜后取出；每孔中加入用PBS稀釋成5%濃度的BSA液200 μL，置37 ℃恒溫箱中2 h后取出，每孔加入PBST 300 μL，置于自動(dòng)洗板儀上振蕩清洗，2 min/次，共2次；拍干96孔板，向孔中加入用PBST稀釋的血清(血清∶PBST體積比為1∶30)，100 μL/孔，置37 ℃恒溫箱中1 h后取出，每孔加入PBST 300 μL置于自動(dòng)洗板儀上振蕩清洗，2 min/次，共5次；拍干96孔板，向孔中加入用PBST稀釋的IgG(IgG∶PBST體積比為1∶8 000)或IgA(IgA∶PBST體積比為1∶6 000)或IgE(IgE∶PBST體積比為1∶400)，100 μL/孔，置37 ℃恒溫箱中1 h后取出，每孔加入PBST 300 μL置于自動(dòng)洗板儀上振蕩清洗，2 min/次，共6次。拍干96孔板，每孔中加入現(xiàn)配A+B混合液(A∶B體積比為1∶1) 100 μL，置室溫中待96孔板顯色后，立即向孔中加入終止液2 mol/L H2SO450 μL，并立即置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)。TWB吸收波長(zhǎng)450 nm處讀值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。連續(xù)性計(jì)量資料用中位數(shù)與四分位數(shù)間距表示，兩組間比較用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WalisH非參數(shù)檢驗(yàn)，組間多重比較用Dunn′st檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 粗提取的小麥蛋白 提取到小麥蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測(cè)得濃度為5.063 mg/mL，并經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證。

2.2 食物過敏情況調(diào)查結(jié)果 參與本研究的所有IMN患者否認(rèn)進(jìn)食某些食物后出現(xiàn)嘴唇或面部腫脹、全身風(fēng)團(tuán)、瘙癢、蕁麻疹、腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱、氣管收縮或抽搐等。所有IMN患者無明確的食物過敏史。

2.3 IMN組與其他腎炎組臨床指標(biāo)比較 IMN組血清肌酐、血漿白蛋白、24 h尿蛋白定量、eGFR分別為109.5(84.50～173.75)μmol/L、21.29(19.40～23.65)g/L、4.36(3.84～5.48)g、67.69(36.85～92.57)mL/(min·1.73 m2)，其他腎炎組分別為83(61.00～118.00)μmol/L、37.00(31.30～42.20)g/L、0.46(0.31～2.89)g、90.31(67.08～133.05)mL/(min·1.73 m2)。IMN組與其他腎炎組血清肌酐、血漿白蛋白、24 h尿蛋白定量比較，P均<0.05；兩組eGFR比較，P﹥0.05。另外，我們觀察了血清中小麥蛋白特異性IgG抗體水平明顯降低(低于中位數(shù))的20例IMN患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)其中12例尿蛋白大于5 g/24 h，且血清白蛋白水平<20.0 g/L。

2.4 各組血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA、IgE水平比較 各組血清中小麥蛋白特異性IgG水平對(duì)應(yīng)OD值中位數(shù)由高到低分別為：對(duì)照組1.020 0、其他腎炎組0.741 4、IMN組0.543 9；IMN組低于對(duì)照組(P<0.01)、其他腎炎組(P<0.05)；其他腎炎組與對(duì)照組比較，P﹥0.05。各組血清中小麥蛋白特異性抗體IgA水平對(duì)應(yīng)OD值中位數(shù)由高到低分別為：IMN組0.500 3、其他腎炎組0.429 8、對(duì)照組0.376 5；三組比較，P>0.05。各組血清中均未檢測(cè)到小麥蛋白特異性IgE。

3 討論

本研究是國(guó)內(nèi)首次研究食物小麥與IMN關(guān)系的研究。我們通過檢測(cè)和比較多組腎臟病患者血清以及健康人血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA、IgE水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IMN患者血清中小麥蛋白特異性抗體IgG水平低于其他腎炎組及對(duì)照組；而血清中小麥蛋白特異性抗體IgA水平在各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在各組血清中均未檢測(cè)到小麥蛋白特異性抗體IgE。提示小麥特別是小麥蛋白特異性抗體IgG可能參與IMN的發(fā)病過程或者疾病進(jìn)程。

早在20世紀(jì)80年代末，就有關(guān)于飲食與IMN關(guān)系的研究。Kawaguchi等[6]在被動(dòng)IMN模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，高蛋白飲食會(huì)引起嚴(yán)重的蛋白尿和腎小球硬化腎小管損傷，在給予低蛋白飲食一段時(shí)間后，大鼠的蛋白尿完全消失，提示日常飲食對(duì)IMN臨床發(fā)展具有一定影響。另有學(xué)者在研究黏膜免疫與原發(fā)腎小球腎炎的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，在IMN患者血清中有高水平抗BSA、卵白蛋白、雞溶解酵素、α乳白蛋白等抗食物蛋白的IgA抗體，進(jìn)一步提示食物與IMN有一定關(guān)系。

2014年周朝敏等[7]在研究IgA腎病患者6種食物(花生、牛奶、雞蛋、大豆、蝦、魚)主要抗原特異性抗體水平中發(fā)現(xiàn)了食物抗原特異性IgG水平的升高，與本研究中各組腎病患者小麥蛋白特異性IgG水平低于健康人水平的結(jié)果相反，這可能與其檢測(cè)的是食物中特異抗原對(duì)應(yīng)的特異性抗體，而我們檢測(cè)的是小麥粗提總抗原蛋白特異性抗體有關(guān)；同時(shí)也可能與我們選入的各類腎病患者在納入研究時(shí)病情較重、病程較長(zhǎng)有關(guān)；另外，也可能是血清中小麥蛋白特異性抗體IgG經(jīng)過血液循環(huán)沉積于腎小球上，降低了血清中IgG水平。本研究結(jié)果顯示，三組小麥蛋白特異性抗體IgA水平雖然在數(shù)據(jù)上有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Rostoker等[8]研究結(jié)果相似，可能與本研究中使用的小麥抗原蛋白是粗提總蛋白有關(guān)。

本研究中根據(jù)1999 年國(guó)際食品法典委員會(huì)第23次會(huì)議公布的常見致敏食物清單，選擇了小麥這種常見致敏食物作為研究對(duì)象。小麥蛋白具有較強(qiáng)致敏性或抗原性?？贵wIgE介導(dǎo)速發(fā)型過敏反應(yīng)，過敏患者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)高水平特異性IgE，一般過敏癥狀突出與接觸過敏物質(zhì)有關(guān)，正常情況下抗體IgE在人體血清中含量極低。本研究中的所有對(duì)象經(jīng)過問卷調(diào)查，均承認(rèn)日常飲食中有接觸小麥面粉類食物，但均否認(rèn)小麥類食物過敏史及在接觸該食物后出現(xiàn)可疑過敏癥狀，比如唇部或面部腫脹、皮膚瘙癢、腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、氣管收縮或抽搐。本研究中入選者血清中均檢測(cè)不到抗小麥蛋白特異性IgE，與調(diào)查相一致。

Jacobs等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)花生經(jīng)過消化吸收后仍有完整的花生過敏原被血小板運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)，引起過敏反應(yīng)，提示食物通過消化吸收后可以導(dǎo)致疾病發(fā)生。小麥含有豐富的凝集素，凝集素不會(huì)被烹飪或者消化作用破壞。凝集素作為碳水化合物結(jié)合蛋白，能選擇性及特異性地與細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂上的碳水化合物基團(tuán)結(jié)合，而PLA2R是表達(dá)于正常腎小球足細(xì)胞上的糖蛋白重要組成部分。小麥很可能以凝集素的方式識(shí)別并結(jié)合了腎小球上PLA2R，導(dǎo)致IgG-小麥抗原蛋白復(fù)合物在腎小球的沉積。另外，有研究表明腎小球疾病患者的腸道通透性明顯增加，而腸道通透性增加可促進(jìn)腸道多種抗原進(jìn)入血液循環(huán)，因而也更容易使含多種食物抗原的循環(huán)免疫復(fù)合物沉積到腎小球。腸道免疫主要為IgA介導(dǎo)的黏膜免疫，而我們研究中各腎病患者血清中小麥蛋白特異抗體IgA水平均較健康人升高，雖然各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍表明IMN患者黏膜免疫活躍、腸道通透性增加。同時(shí)，我們觀察了血清中小麥蛋白特異性抗體IgG水平明顯降低，且IMN患者中大部分尿蛋白增多、血清白蛋白低。提示小麥可能在IMN的疾病進(jìn)程中有重要作用。

總之，本研究從血清學(xué)水平研究食物小麥與IMN的關(guān)系，提示小麥在IMN致病或進(jìn)程中可能起一定作用，并初步探討小麥參與IMN發(fā)病機(jī)制和發(fā)病進(jìn)程的可能性。為進(jìn)一步研究IMN的發(fā)病機(jī)制指出了一個(gè)新的方向，也為以后探索食物與IMN發(fā)病關(guān)系的研究奠定了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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鄒和群(E-mail: hequnzou@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.028

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1002-266X(2017)29-0084-03

2017-04-26)