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    EV71感染手足口病患兒血清IL-6、IL-13水平變化及其原因

    2017-04-04 19:06:51何春卉
    山東醫(yī)藥 2017年29期
    關(guān)鍵詞:腸道病毒單核細(xì)胞口病

    何春卉

    (廣州市婦女兒童醫(yī)療中心,廣州 510000)

    EV71感染手足口病患兒血清IL-6、IL-13水平變化及其原因

    何春卉

    (廣州市婦女兒童醫(yī)療中心,廣州 510000)

    目的 探討腸道病毒71型(EV71)感染引起的手足口病(HFMD)患兒血清IL-6和IL-13水平變化及其原因。方法 以EV71感染的HFMD患兒作為觀察組,健康體檢者作為對(duì)照組,用ELISA法測(cè)定兩組血清IL-6和IL-13水平。比較觀察組中嚴(yán)重程度不同(臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期)的HFMD患兒血清IL-6和IL-13水平。采用利巴韋林等抗病毒治療。對(duì)比治療前后血清IL-6和IL-13水平變化。用流式細(xì)胞儀測(cè)定單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13的表達(dá)水平。EV71感染從健康人全血中分離出來(lái)的單核細(xì)胞和T細(xì)胞,制成感染陽(yáng)性細(xì)胞,檢測(cè)其細(xì)胞中IL-6和IL-13的表達(dá)水平,以未感染的單核細(xì)胞及T細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞。結(jié)果 觀察組治療前血清中IL-6和IL-13水平與對(duì)照組相比升高(P均<0.01)。 與治療前比較,治療后觀察組不同分期患者血清IL-6和IL-13水平均下降(P均<0.01)。不同分期間,隨著臨床分期升高,血清IL-6、IL-13水平升高(P均<0.01)。與對(duì)照組比較,觀察組各分期單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13表達(dá)水平均高(P均<0.05)。EV71感染單核細(xì)胞和T細(xì)胞后,其IL-6和IL-13表達(dá)水平高于陰性對(duì)照細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論 EV71感染HFMD患兒血清IL-6和IL-13水平升高,其原因可能是FV71感染的單核細(xì)胞表達(dá)IL-6和T細(xì)胞表達(dá)IL-13能力增強(qiáng)。

    手足口??;白細(xì)胞介素6;白細(xì)胞介素13;腸道病毒71型;兒童

    1957年,新西蘭首次報(bào)道了手足口病(HFMD)[1],由于免疫力的差異,HFMD多在5歲以下兒童群體傳染,出現(xiàn)口痛、低熱、胃納差、手足口部位皰疹或潰瘍的臨床癥狀,在免疫力較強(qiáng)的成人群體中,除了重癥感染患者,其他多處于隱性潛伏狀態(tài),易成為傳染源[2]?,F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)柯薩奇病毒A16(CVA16)和腸道病毒71型(EV71)均能引起HFMD,且從初期的臨床癥狀上難以區(qū)分[3]。但CVA16引起的HFMD一般較少出現(xiàn)并發(fā)癥[4],EV71引起的HFMD患者常出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[5,6]。據(jù)研究,EV71屬小RNA病毒科,腸道病毒屬,是一種正義單鏈RNA病毒[7,8]。研究表明,參與炎癥發(fā)生過(guò)程的細(xì)胞因子在EV71感染導(dǎo)致的HFMD病程中可能起了關(guān)鍵作用。但關(guān)于EV71導(dǎo)致HFMD發(fā)生的病理過(guò)程中IL-6和IL-13所起的作用研究報(bào)道較少。本研究對(duì)36例確診為EV71感染導(dǎo)致的HFMD住院患兒血清IL-6和IL-13水平變化進(jìn)行了觀察,并探討了血清IL-6和IL-13水平變化的原因。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 2015年1~12月廣州市婦女兒童醫(yī)療中心共收治和確診EV71感染的HFMD住院患兒36例(觀察組),符合“手足口病治療指南(2010年版)”[9]。男20例、女16例,年齡(25.19±8.92)個(gè)月。對(duì)照組為本院同期健康體檢者20例,男11例、女9例,年齡(25.56±10.31)個(gè)月?;颊吒鶕?jù)“陜西省EV71感染重癥手足口病病例臨床診斷與治療專家共識(shí)(2014年修訂版)”的臨床特征分期[10]如下:神經(jīng)系統(tǒng)受累期(臨床Ⅱ期)患兒12例,年齡(26.32±9.81)個(gè)月;心肺衰竭前期(臨床Ⅲ期)患兒12例,年齡(23.63±10.21)個(gè)月;心肺衰竭期(臨床Ⅳ期)患兒12例,年齡(25.63±11.23)個(gè)月。兩組性別比例、年齡分布均衡。

    1.2 治療方法 應(yīng)用利巴韋林10 mg(/kg·d)靜滴或喜炎平靜滴抗病毒治療1周。對(duì)于出現(xiàn)口腔潰瘍的患者,用復(fù)方氯已啶清洗口腔,康復(fù)新噴劑促進(jìn)口腔潰瘍愈合。對(duì)于體溫升高超過(guò)38.5 ℃的患兒,對(duì)其進(jìn)行物理降溫,可口服布洛芬、對(duì)乙酰氨基酚溶液降溫?;純褐行枰M(jìn)行母乳喂養(yǎng)的可以繼續(xù)母乳喂養(yǎng),對(duì)于無(wú)需母乳喂養(yǎng)的患兒保持食用清淡、易消化、維生素含量豐富的食物。

    1.3 血清IL-6、IL-13水平的檢測(cè) 采用ELISA法。對(duì)照組體檢時(shí)及觀察組患兒入院及住院期間抽血。實(shí)驗(yàn)步驟如下:①吸附:取血清樣品、空白對(duì)照和R&D公司試劑盒所配的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL,加入反應(yīng)板的孔中,于37 ℃培養(yǎng)箱孵育90 min,棄去反應(yīng)板各孔中溶液,分別加入洗滌液250 μL,振蕩1 min,棄去洗滌液,按此重復(fù)共4次;②加抗體:將生物素化抗體工作液加入各孔中,100 μL/孔,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min后,洗板4次;③加底物:加入酶聯(lián)底物溶液100 μL/孔,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min;洗板4次;④顯色:加入顯色劑100 μL/孔,避光37 ℃下孵育15 min,加入終止液100 μL/孔。用FC酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

    1.4 細(xì)胞中IL-6和IL-13表達(dá)的檢測(cè) 將肝素鈉抗凝的全血樣本用Ficoll密度梯度離心法分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞,將細(xì)胞加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10% FBS,200 IU/mL rhIL-2)中,制備成濃度為2×106/mL的細(xì)胞懸液。外周血單個(gè)核細(xì)胞用100 ng/mL PMA和1 μg/mL離子霉素刺激1 h后,加入高爾基體阻斷劑,保持細(xì)胞因子在細(xì)胞中,不被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外,孵育5 h。收集細(xì)胞,先加入表面染色的單抗試劑,用CD14圈定單核細(xì)胞和CD3圈定T細(xì)胞,細(xì)胞膜固定透化后加入IL-6和IL-13的熒光標(biāo)記抗體,固定細(xì)胞膜通透性后,用流式細(xì)胞儀對(duì)上述樣品進(jìn)行分析。

    1.5 EV71感染陽(yáng)性細(xì)胞中IL-6和IL-13水平的檢測(cè) EV71病毒以MOI=5的條件感染1×107的健康人的單核細(xì)胞和T細(xì)胞,RT-PCR鑒定感染成功的單核細(xì)胞和T細(xì)胞[3]。用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)被感染細(xì)胞的IL-6和IL-13水平,以正常的單核細(xì)胞和T細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

    2 結(jié)果

    2.1 觀察組患兒治療前后血清IL-6和IL-13水平比較 觀察組臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期治療前血清IL-6水平分別為(50.62±4.21)、(74.79±8.53)、(96.41±10.63)pg/mL,治療后分別為(24.31±6.59)、(41.09±8.64)、(68.09±15.37)pg/mL,對(duì)照組為(21.71±5.72)pg/mL;觀察組臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期IL-13水平分別為(24.62±3.57)、(38.51±5.48)、(48.74±4.87)pg/mL,治療后分別為(10.36±3.58)、(18.69±5.60)、(21.07±5.25)pg/mL,對(duì)照組為(16.53±2.72)pg/mL。觀察組治療前血清中IL-6和IL-13水平與對(duì)照組相比升高(P均<0.01)。與治療前比較,治療后觀察組不同分期患者血清IL-6和IL-13水平均下降(P均<0.01)。不同分期間,隨著臨床分期升高,血清IL-6、IL-13水平升高(P均<0.01)。

    2.2 兩組單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13表達(dá)水平比較 觀察組臨床Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期及對(duì)照組單核細(xì)胞中IL-6水平分別為(10.44±6.29)、(13.16±13.14)、(12.41±11.61)、(2.01±0.35)pg/mL,T細(xì)胞中IL-13水平分別為(8.48±5.78)、(4.04±1.39)、(5.27±3.72)、(2.43±0.46)pg/mL。與對(duì)照組比較,觀察組各分期單核細(xì)胞中IL-6和T細(xì)胞中IL-13表達(dá)水平均高(P均<0.05)。

    2.3 EV71感染的細(xì)胞中IL-6和IL-13水平比較EV71病毒感染的單核細(xì)胞及陰性對(duì)照細(xì)胞IL-6水平分別為(1.56±0.35)、(0.36±0.14)pg/mL,IL-3水平分別為(1.82±0.75)、(0.57±0.26)pg/mL。EV71病毒感染單核細(xì)胞和T細(xì)胞后,其IL-6和IL-13水平高于陰性對(duì)照細(xì)胞(P均<0.05)。

    3 討論

    HFMD是多種腸道病毒所致的傳染性疾病,其多發(fā)于嬰幼兒,最常見(jiàn)病毒包括腸道病毒EV71在內(nèi)。其臨床表現(xiàn)為口痛、厭食、低熱,手、足、口腔等部位出現(xiàn)小皰疹或小潰瘍,多數(shù)患兒一周左右自愈,少數(shù)患兒將發(fā)展至心肌炎等嚴(yán)重疾病[2]。

    既往研究表明,IL-6是一種單核細(xì)胞分泌的多功能炎性細(xì)胞因子,在多種病理過(guò)程中起作用[11]。當(dāng)機(jī)體受到病毒感染時(shí),IL-6血清濃度會(huì)上升。IL-6在炎癥反應(yīng)中有抗炎和致炎的雙向作用,與其在機(jī)體中的含量水平相關(guān)[12]。Huang等[13]研究表明,小鼠被EV71感染初期會(huì)短暫出現(xiàn)IL-6、IL-10和IFN-γ水平升高。在使用靶向IL-6受體的抗體治療,抑制IL-6參與的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,EV71感染導(dǎo)致的組織損傷好轉(zhuǎn)、血液中病毒數(shù)量下降、炎癥水平降低[14]。說(shuō)明IL-6可能參與了EV71感染致HFMD的病理過(guò)程[15]。IL-13主要由T細(xì)胞產(chǎn)生,參與炎癥反應(yīng)過(guò)程,促進(jìn)B細(xì)胞增殖,抑制促炎細(xì)胞因子分泌[16]。EV71感染引起的肺水腫患者及小鼠模型均顯示,受感染后血清IL-13水平升高[17,18]。觀察組血清中IL-6和IL-13水平高于對(duì)照組,且隨著HFMD臨床診斷嚴(yán)重分級(jí)越高,血清中IL-6和IL-13水平越高。提示IL-6和IL-13可能參與了EV71感染導(dǎo)致的HFMD發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。

    觀察組和對(duì)照組單核細(xì)胞 中IL-6和T細(xì)胞中IL-13水平高于對(duì)照組。結(jié)合觀察組血清中IL-6和IL-13水平偏高的測(cè)定結(jié)果,說(shuō)明可能是因?yàn)閱魏思?xì)胞和T細(xì)胞分泌IL-6和IL-13增多,導(dǎo)致血清中其水平的升高。通過(guò)EV71體外感染健康人的單核細(xì)胞 和T細(xì)胞,測(cè)定結(jié)果顯示細(xì)胞中IL-6和IL-13表達(dá)水平升高。說(shuō)明EV71導(dǎo)致HFMD的一個(gè)途徑是,通過(guò)促進(jìn)單核細(xì)胞和T細(xì)胞表達(dá)IL-6和IL-13細(xì)胞因子,升高血清中IL-6和IL-13水平,進(jìn)而導(dǎo)致HFMD患者出現(xiàn)炎癥加重的臨床病癥。Huang等[13]研究表明,EV71感染后T淋巴細(xì)胞瘤(Jurkat細(xì)胞)分泌IL-2、IFN-ɑ、IL-6和IL-10的能力下降。本研究結(jié)果與其不同。推測(cè)可能的原因是Huang 等試驗(yàn)是通過(guò)ELISA法測(cè)定培養(yǎng)48 h后細(xì)胞因子的總量,EV71感染Jurkat細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,如果48 h后以樣品組與對(duì)照組中IL-6和IL-13的測(cè)得濃度來(lái)對(duì)比細(xì)胞因子的表達(dá)水平,會(huì)因?yàn)榧?xì)胞數(shù)量的差別而有所差異。故本研究采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)IL-6和IL-13表達(dá)水平,通過(guò)比較單核細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)量,以及IL-6和IL-13的水平來(lái)排除其他因素的干擾。

    綜上所述,EV71感染導(dǎo)致HFMD,可能的途徑是通過(guò)感染單核細(xì)胞和T細(xì)胞,促進(jìn)其分泌IL-6和IL-13,引起血清中IL-6和IL-13的水平升高,但是其分子機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

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    B

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