豬流感病毒HA基因研究進展

孫法超 張元超 王玉超 肖一紅

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 山東 泰安 271018）

豬流感病毒HA基因研究進展

孫法超 張元超 王玉超 肖一紅

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 山東 泰安 271018）

豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸系統(tǒng)疾病。極易繼發(fā)感染其他病，像一些細菌，病毒和寄生蟲病等。使得病情更加復雜，從而提高了病豬的死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。血凝素(HA)基因是流感病毒表面的主要抗原基因，變異頻率很高，是病毒發(fā)生抗原變異的主要原因。HA與流感病毒感染的宿主范圍和致病力密切相關，同時還能誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是流感病毒最重要的一個蛋白。因此，本文對豬流感病毒的HA基因進行了綜述，為進一步對豬場的流感防治以及疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

2016YFD0500201 國家重點研發(fā)計劃

豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)屬于正粘病毒科，A型流感病毒屬，是一種單股負鏈RNA病毒。豬流感(Swine influenza，SI)是由A型流感病毒引起的一種急性、熱性、傳染性呼吸系統(tǒng)疾病。該病的發(fā)生無明顯的季節(jié)性，但在春秋和冬季，尤其季節(jié)交替時易發(fā)，易感豬群不分年齡、性別和品種，臨床癥狀主要表現(xiàn)為食欲下降，精神沉郁、體溫升高、呼吸困難、咳嗽以及流涕等。20世紀30年代Shope從豬的體內(nèi)第一次分離到了一株H1N1亞型豬流感病毒，因此由該病毒引起的豬的疾病稱為SI[1-3]，之后全球范圍內(nèi)均出現(xiàn)過相關的報道。另外，由于人的流感病毒和禽的流感病毒的受體同時存在于豬體內(nèi)，因此認為豬是人、禽和豬流感病毒通過基因重排并產(chǎn)生新的病毒的“混合器”(Ito et al. 1998；Karasin et al.2006；Thacker et al.2008；Naffakh et al.2009)。當前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的SIV有很多種，包括H1N1、H1N2、H2N3(Ma et al.2007)、H3N1(Lekcharoensuk et al.2006)、H3N2、H3N3(Karasin et al.2004)H3N6、H4N6、H5N1(Lvov et al.2006)和H7N9(Hai et al.2008)等多種不同的亞型。在全球范圍內(nèi)當前的流行毒株以H1N1、H1N2和H3N2為主。SIV的基因組由8個大小不等的獨立片段構成，3種多聚酶蛋白(PB2、PB1和PA)、核蛋白(NP)、基質(zhì)蛋白(M1和M2)、血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核輸出蛋白(NEP)和非結(jié)構蛋白(NS1和NS2)共11個蛋白。HA是一種主要的糖蛋白，該蛋白有以下幾個主要功能：能夠刺激機體，誘導機體產(chǎn)生中和性抗體；可以識別并結(jié)合宿主細胞表面的特異性受體；參與流感病毒囊膜與核內(nèi)膜的融合。所以，對于HA基因的研究還是具有重要意義的。

1 HA基因的特點

流感病毒的基因由八個單鏈RNA組成，通過對絕大多數(shù)流感病毒的全基因序列進行測序，以及序列的比對，發(fā)現(xiàn)所有片段中，5′端的前13個核苷酸相同，均為GGAACAAAGAUGAppp5′；3′前12個核苷酸也相同，為3′HO-UGGU/CUUUCGUCC;每個序列都有Polyu保守區(qū)，位于每個序列的5′端第15至21核苷酸處，其主要功能是利用病毒mRNA的合成時生成的PolyA信號來終止病毒mRNA的合成。流感病毒RNA片段4編碼HA，HA編碼566個氨基酸，大小為75kD。HA基因的亞型較多，很容易發(fā)生變異，A型流感病毒亞型的劃分可以依據(jù)HA基因及其蛋白的抗原特性。(Lind-strom et al.1998)。

2 HA蛋白的特點以及功能

（1）作為流感病毒中的重要蛋白，HA蛋白分子有信號肽、胞漿域、跨膜域以及胞外域這幾個結(jié)構域。HA的糖基化位點一般有6～10個[4]。HA要發(fā)揮作用，需要經(jīng)過裂解酶的裂解，糖基化和脂肪酸的乙?；@幾個加工處理過程。此外，HA水解后可分成兩部分：HA1和HA2，前者氨基酸殘基有319～328個，后者為221～222個。兩者之間以1個精氨酸相連。HA1可以與宿主細胞的受體進行結(jié)合；其功能主要是使病毒與宿主細胞表面的唾液酸受體結(jié)合，之后等病毒吸附后，宿主細胞會通過內(nèi)吞作用使病毒粒子進入。HA2主要參與細胞的融合。HA水解是流感病毒感染的先決條件[5-8]。此外，病毒的致病性也與HA糖基化位點和裂解位點處堿性氨基酸的變化有關。（2）對于HA的蛋白表達，張祥斌等（2008）用pBCX高效可溶表達載體成功表達了H1N1亞型的蛋白，隨后又通過Westernblot實驗證實了可溶表達的融合蛋白對H1N1亞型豬流感病毒陽性血清具有良好的免疫原性，并且最后篩選到的兩株針對HA蛋白抗原表位的單克隆抗體就是用此蛋白作為抗原的。

3 HA基因工程疫苗

基因工程疫苗中研究較多的是HA蛋白基因，主要是HA蛋白相比其他蛋白有著較好的免疫原性，以下幾種疫苗在豬流感中較為常用：

3.1 重組活載體疫苗 豬流感病毒重組活載體疫苗是將HA或者NA基因插入到已知的病毒活載體中致使基因獲得高效表達。這種疫苗有著較多的優(yōu)點，一方面是接種后不受母源抗體的影響，其他疫苗的部分缺點得到改進，另一方面是只需接種少量疫苗就可以產(chǎn)生較多的外源蛋白(Kitikoon et al. 2006)。對于豬流感H3N2疫苗的的獲得，國內(nèi)學者周國輝等(2005)曾把偽狂犬疫苗毒株Bartha-K61的基因組與含有H3N2豬流感HA基因的轉(zhuǎn)移載體pLTK-HA共轉(zhuǎn)染Vero細胞，并成功得到了重組偽狂犬病病毒，隨后對其免疫保護效果進行測試，結(jié)果較為理想。所以，重組活載體HA疫苗具有較好的免疫活性。

3.2 亞單位疫苗 目前亞單位疫苗的制作主要是提取的一些病原體的免疫原蛋白，之后再對有免疫活性的片段篩選。亞單位疫苗由于其主要表面蛋白質(zhì)種類少，致使一些無關抗原誘發(fā)抗體的產(chǎn)生得到了避免，所以疫苗本身的副作用也相應地減少了。在基因工程中可以通過DNA重組技術把HA基因連接到載體質(zhì)粒，之后再導入表達系統(tǒng)中進行擴增表達，此種方法的生產(chǎn)成本較低，而且還可以得到較多的HA蛋白。該種亞單位疫苗可以免疫保護多種H亞型毒株(Ste-phenson et al.2004）)。盡管亞單位疫苗在應用上有著一些不錯的特點，但是在生產(chǎn)過程中也存在很多問題，所以對于亞單位疫苗的生產(chǎn)研究條件還需進一步的優(yōu)化。

3.3 DNA疫苗 豬流感DNA疫苗的制作主要是將該病毒主要免疫原基因HA或NA插入到真核表達質(zhì)粒中，然后將該重組質(zhì)粒導入機體細胞，最后誘導機體產(chǎn)生特異性免疫應答。(Larsen etal .2001)曾對豬用表達的HA的DNA疫苗進行免疫，然后在初免過后四周，又用滅火苗進行加強免疫了一次，與此同時，和只進行DNA疫苗接種的兩次進行比較，發(fā)現(xiàn)前者產(chǎn)生的抗體水平更高。(Ljungberg et al.2002)也曾構建了嵌合HA質(zhì)粒，他用的兩株A型流感毒株在遺傳學和血清學上是不相同的，構建完成后疫苗接種了24只成年雪貂，最后對雪貂體內(nèi)的抗體經(jīng)和HI和ELISA進行檢測，構建的嵌合質(zhì)粒對小鼠有較高的抗體滴度。因此與傳統(tǒng)疫苗相比可以看出，該種疫苗總的來說可以產(chǎn)生一定的免疫保護力，但重復性與免疫效果還是不太理想，所以對該種疫苗的研究還有待提高。

4 結(jié)語

豬流感病毒在我國豬群中廣泛存在，給我國養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。為防治豬流感，減輕損失，對該病的疫苗研究是必要的。HA基因是豬流感病毒中重要的基因，對該基因以及蛋白的研究可以為新型豬流感病毒疫苗的開發(fā)提供理論基礎，所以筆者對于該病防治還是充滿了信心。

[1] 斯特勞 B E, 阿萊爾S D, 蒙加林 W L.豬病學(8版)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2000, 287-300.

[2] 殷震, 劉景華. 動物病毒學(2版)[M]. 北京: 科學出版社, 1997.

[3] 郭元吉, 程小雯著. 流行性感冒病毒及其實驗技術(第1版)[M]. 北京: 中國三峽出版社. 1997, 11: 1-5.

[4] 殷震, 劉景華著. 動物病毒學(第2版)[M]. 北京: 科學出版社. 1997:704-735.

[5] 黃文林等著. 分子病毒學(第1版)[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社,2002: 283-303.

[6] 張祥斌, 謝青梅, 馬靜云等. H1N1亞型豬流感病毒HA基因的表達及單克隆抗體的制備[J]. 中國獸醫(yī)科學, 2008, 38(11): 962-967.

[7] 萬春和, 劉明, 劉春等. H1亞型豬流感病毒血凝素基因在昆蟲細胞中的表達及其間接ELISA方法的初步建立[J]. 微生物學報, 2008,48(2): 220-225.

[8] 周國輝. 表達H3N2亞型豬流感病毒HA基因的重組偽狂犬病病毒的免疫效力研究[D]. 烏魯木齊: 新疆農(nóng)業(yè)大學, 2005.

[9] Shope R E.Swine influenza： Ⅲ .Filtration experiments and etiology[J].Journal of Experimental Medicine, 1931, 54(3): 373-385.

[10] Wharton SA. Structure, function, and antigenicity of the hemagglutinin of influenza virus[M]. In: The Influenza Viruses. 1989, 153.

[11] Wisonia, Skenliel JJ, Wiley DC. Stucture of the liaemagglutinin memberane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution. Nature, 1981,289: 366-373.

[12] LvovD. Population interactions in biological system : influenza virus A-wild and domestic animals-human;reasons and consequences of introduction high pathogenic influenza virus A/H5N1 on Russian territory[J]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol, 2006, 3: 96～100.

[13] Hai Y, Rong H H, Tian C W, et al. Isolation and genetic characterization of avian origin H9N2 influenza viruses from pigs in China[J]. Veterinary Microbiology, 2008, 131(1-2): 82-92.

[14] Lindstrom S E, HiromotoY,NeromeR, etal. Phylogenetic analysis of the entire genome of influenza a(H3N2) viruses from Japan:evidence for genetic reassortment of the six internal genes[J]. Journal of Virology, 1998,72(10): 8021-8031.

[15] Kitikoon P, Nilubol D, Erickson B J, et al. The immune response and maternal antibody interference to a heterologous H1N1 swine influenza virus infection following vaccination[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2006. 112(3～4): 117-128.

[16] Stephenson I,Nicholson K G,Wood J M,et al.Confronting the avian influenza threat:vaccine development for a potential pandemic[J].Lancet Infect Dis,2004,4(8):499～509.

[17] Laren D L, Karasin A, Olsen C W. Immunization of pigs against influenza virus infection by DNA vaccine priming followed by killed virus vaccine boosting[J]. Vaccine, 2001, 19(20): 2842-2853.

[18] Ljungberg K, Kolmskog C, Wahren B, et al. DNA vaccination of ferrets with chimeric influenza A virus hemagglutinin(H3)genes[J].Vaccine, 2002, 20: 2045-2052.

S852.65

A

1007-1733(2017)10-0080-02

2017–06–15）