口蹄疫滅活疫苗146S含量檢測方法概述

董金杰 王 凡 陳苗苗 牟克斌 王超英 劉 萍*

（①中農(nóng)威特生物科技股份有限公司 蘭州 730046 ①中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 蘭州）

口蹄疫滅活疫苗146S含量檢測方法概述

董金杰①①王 凡①陳苗苗①牟克斌①①王超英①①劉 萍①*

（①中農(nóng)威特生物科技股份有限公司 蘭州 730046 ①中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所 蘭州）

口蹄疫(Food and Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Food and Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄類動物的急性、熱性、接觸性、烈性傳染病。世界范圍內(nèi)預防口蹄疫發(fā)生的有效方法是疫苗免疫，疫苗生產(chǎn)過程中，各環(huán)節(jié)過程控制至關(guān)重要，其中準確定量完整的口蹄疫病毒粒子(146S)尤為關(guān)鍵，因為146S抗原的含量直接決定了口蹄疫滅活疫苗的質(zhì)量，所以準確，快速，敏感的定量方法勢在必行，本文對146S含量檢測主要方法的研究進展做一綜述。

1 密度梯度離心法

主要有蔗糖密度梯度離心法和氯化銫密度梯度離心法兩種，其中蔗糖密度梯度離心法應用較為廣泛。

1.1 蔗糖密度梯度離心法 （1）該方法最早由Barteling等于1974年建，是采用10%～25%的蔗糖梯度，45000r/min離心30min，測定各部分在254nm處的吸光值，根據(jù)峰面積計算146S含量。但病毒液中146S含量太少時，不能直接檢測，需要用PEG-6000對樣品進行濃縮。最近幾年，很多研究人員對此方法進行了改進。董金杰等(2010)將滅活的FMDV經(jīng)超濾濃縮后分別加于15%～45%和15%～55%的蔗糖梯度頂部，35000/min，超速離心2.5h后，用紫外分光檢測儀檢測各區(qū)帶在259nm處的吸光值，繪制吸收峰圖譜，并計算峰的面積從而得到146S抗原的含量。試驗結(jié)果表明，15%～45%的蔗糖梯度能較好的純化FMDV抗原，分離效果比15%～55%蔗糖梯度更為理想。因此15%～45%的蔗糖梯度更適合用于146S的定量檢測。盧永干等（2010）采用氯仿或三氯乙烯初步純化病毒液，超速離心對病毒液進行濃縮，15%～45%的蔗糖梯度離心進行病毒146S的定量。（2）兩種方法存在的缺點是：所需樣品量大，至少需10ml才能檢測；過程繁瑣，樣品必須經(jīng)過濃縮步驟(超濾、沉淀和懸浮等過程)，抗原損失不確定，檢測結(jié)果不能反映真實值，導致重復性和穩(wěn)定性差。往往在實驗室之間，人與人之間檢測結(jié)果變化率大。因此，董金杰等(2012)在原有的研究基礎(chǔ)上做了進一步改進，改進后無須將FMDV濃縮，可直接加FMDV于15%～45%的蔗糖梯度頂部，35000/min，超速離心3h后，用連續(xù)紫外檢測儀檢測各區(qū)帶在259nm處的吸光值，繪制吸收峰圖譜，通過計算吸收峰面積得出146S的含量。此方法的改進大大克服了樣品濃縮導致的周期長，樣品量大等缺點，同時結(jié)果的穩(wěn)定性和重復性得到了保證，目前已在中農(nóng)威特生物科技股份有限公司應用約兩年，檢測各類樣品8000余份次。實踐應用結(jié)果顯示，當樣品146S含量在1～15μg/ml時，相對偏差基本在5%以內(nèi)，為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司指導疫苗生產(chǎn)、質(zhì)量控制和濃縮純化工藝的開發(fā)和研究提供了技術(shù)支撐和保障。但此方法的局限是不能檢測多價成品疫苗中各血清型抗原的146S含量。

1.2 氯化銫密度梯度離心法 比蔗糖密度梯度離心法更為精確的測定146S含量的方法是通過氯化銫密度梯度離心定量分析，在每毫升微克量水平估測出146S抗原量，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測病毒抗原多肽的完整性以確定其質(zhì)量。但因氯化銫價格較為昂貴，未被廣大科研工作者和疫苗生產(chǎn)廠家廣泛應用。

2 ELISA方法

（1）Crowther等(1979)是最早使用ELISA方法檢測和定量146S的，使用直接ELISA、間接ELISA、夾心ELISA方法同時定量FMDV，獲得很好的效果，三種方法的結(jié)果相同，靈敏度高，可檢測樣品含量在5～30ng/ml時的146S。在此基礎(chǔ)上，Abu Elzein等(1979)建立了一種夾心ELISA方法，使用的是豚鼠抗純化且滅活FMDV 146S的血清包被酶標板，加入待檢抗原，最后加入同源的酶標記的IgG，加入顯色底物，NaOH終止反應，酶標儀檢測OD405nm。在研究中發(fā)現(xiàn)，豚鼠抗純化且滅活FMDV146S的血清在免疫擴散試驗、補體結(jié)合試驗、雙抗體放射免疫試驗中與12S和146S都能發(fā)生反應，然而在此雙夾心ELISA試驗中該血清不與12S抗原發(fā)生反應，因此認為這種方法可以在有12S存在情況下特異性定量146S。（2）李樂等(2008)建立的ELISA的方法則是利用市場上現(xiàn)有的口蹄疫抗原捕獲ELISA試劑盒進行檢測，進行了146S抗原含量和ELISA結(jié)果的相關(guān)性研究，結(jié)果表明，抗原含量和OD450nm表示的ELISA結(jié)果有對數(shù)線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.98。此方法與蔗糖密度超速離心方法定量比較，6個樣品檢測后，兩種方法檢測出的抗原含量差異在0.2～2.5μg/ml之間，且ELISA結(jié)果均高于蔗糖密度超速離心方法，由此可見兩種方法之間的檢測差異較大。Ouldridge等(1984)介紹了一種間接夾心ELISA專門用于定量收獲病毒液中的146S。多價兔血清用于包被微量滴定板，多價豚鼠血清用于試驗的第二相。建立的夾心ELISA方法不檢測12S抗原，因此適于定量146S抗原。但是，Van Mannen等(1990)發(fā)現(xiàn)這種ELISA方法既檢測12S也檢測146S，因此不適于定量146S，這與Ouldridge等的結(jié)果相反。（3）鑒于以上方法的局限性，因此進而發(fā)展出了有單克隆抗體參與的ELISA方法，Crowther等(1995)建立了一種雙抗體夾心ELISA方法，此方法使用的單克隆抗體為普通的抗FMDV單克隆抗體。該方法涉及使用了針對O型病毒VP1環(huán)狀區(qū)域的線性抗原表位的病毒中和性單抗隆抗體。在夾心ELISA中，這一單抗既被用作捕獲試劑也被用作檢測試劑。Crowther等建立的方法也是不檢測蛋白酶裂解過的146S。Yang等(2008)分離出了兩株抗FMDV的單克隆抗體，經(jīng)試驗后發(fā)現(xiàn)這兩株單克隆抗體可用于定量疫苗生產(chǎn)過程中FMDV的146S含量。此方法在Pirbright疫苗研究中心測定疫苗生產(chǎn)過程中的146S含量受到廣泛的應用。雖然單克隆抗體ELISA方法具有較多的優(yōu)點，但是制備單克隆抗體的過程較為復雜，而且ELISA方法檢測受到FMDV血清型和毒株的限制。一種單克隆抗體ELISA方法所能檢測的FMDV毒株的種類是有限的。

3 凝膠過濾色譜法

董金杰等(2007)利用Superose 6 HR柱(GE公司)對口蹄完整病毒進行分離純化，即將各種方法處理的BHK-21細胞口蹄疫病毒抗原制備物和陰性對照經(jīng)氯仿去除大部分脂蛋白，再經(jīng)Superose 6 HR一步柱層析純化，結(jié)合紫外(波長為254nm)檢測系統(tǒng)收集抗原峰，然后利用反向間接血凝試驗和感染性試驗檢測。結(jié)果顯示，Superose 6 HR柱對口蹄疫病毒的分離純化有一定效果，但根據(jù)陰性對照結(jié)果，抗原峰含有一部分水解乳蛋白和細胞成分；且經(jīng)感染性檢測結(jié)合血凝試驗，抗原峰和后峰均含有完整病毒顆粒，徹底分離口蹄疫病毒較為困難，Marcelo等(2011)利用Sephacryl S-1000或S-400填料(G公司)分離純化并定量口蹄疫病毒完整粒子，原理是通過分子排阻色譜來分離疫苗混合物中的不同組分，將146S分離出來，在波長254nm下的光吸收值來測定146S含量，檢測范圍為5～70μg/ml。優(yōu)點是適用于不同的口蹄疫毒株；使用標準的層析介質(zhì)，可以自動化操作；純化后的樣品的檢測結(jié)果與蔗糖密度梯度離心分析法有良好的相關(guān)性。但未經(jīng)純化的樣品檢測結(jié)果與蔗糖密度梯度離心分析法相關(guān)性如何，還需設(shè)立對照試驗進一步驗證。

4 熒光定量RT-PCR法

苗海生等（2013）利用口蹄疫146S抗原ELISA定量技術(shù)抗原含量關(guān)系的標準抗原作為對照，通過對口蹄疫病毒的RNA進行檢測，并進行待檢樣品與標準抗原曲線的對比，實現(xiàn)由病毒RNA熒光Ct值的測定向抗原含量的轉(zhuǎn)變。此過程整個操作過程僅需要2h，可迅速根據(jù)標準曲線判斷病毒懸液中病毒顆粒含量，節(jié)約生產(chǎn)成本。但本方法往往由于試劑、操作等因素的影響會產(chǎn)生一些誤差，并且受研究技術(shù)水平的限制，絕對定量的精度和準確性還有待進一步提高。

5 展望

上述幾種檢測方法各有利弊，蔗糖密度梯度離心法對FMDV的血清型毒株沒有限制，但無法檢測多價成品疫苗各血清型病毒的抗原含量；ELISA方法操作相對簡單，一次性可檢測大量樣品，但是制備單克隆抗體的過程復雜，并且對檢測的病毒株有限制；凝膠過濾色譜法則自動化程度高，操作相對簡單，但檢測靈敏度及對雜質(zhì)含量較高的樣品分離效率目前不高，有待進一步的提高。

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[2] 董金杰, 祁光宇, 劉學榮等. 用蔗糖密度梯度離心法檢測與定量口蹄疫病毒抗原[A]. 第三屆中國獸藥大會－獸醫(yī)生物制品學、獸醫(yī)微生物學學術(shù)論壇文集[C]. 2010.

[3] 董金杰, 劉學榮, 陳苗苗等. 凝膠過濾層析法純化口蹄疫病毒的試驗[J]. 中國獸醫(yī)科學增刊, 2007.

[4] Junsuke SHIRAI, Arinee CHATCHAWANCHONTEERA, et al.Estimation of 140S Particles in Foot-and-Mouth Disease Virus(FMDV)Vaccine by Using the computer Analyzing System. Jpn J Vet Sci, 1990,52(3): 621-630.

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S852.4+3

A

1007-1733(2017)10-0078-02

甘肅省科技支撐計劃項目(1104NKCA081)

*通訊作者，

2017–05–11）