三溴丙酮酸對結(jié)腸癌HCT-8/V細胞增殖及其mdr1基因、P-gp蛋白表達的影響

李浩，戴世龍，許博文，趙宇，張青松

(1華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院,河北唐山 063000；2華北理工大學(xué)研究生學(xué)院)

三溴丙酮酸對結(jié)腸癌HCT-8/V細胞增殖及其mdr1基因、P-gp蛋白表達的影響

李浩1，戴世龍1，許博文1，趙宇2，張青松1

(1華北理工大學(xué)附屬開灤總醫(yī)院,河北唐山 063000；2華北理工大學(xué)研究生學(xué)院)

目的探討三溴丙酮酸(3-BrPA)對結(jié)腸癌HCT-8/V耐藥細胞株細胞增殖及mdr1基因和P-糖蛋白(P-gp)蛋白表達的影響。方法取結(jié)腸癌HCT-8/V耐藥細胞株、HCT-8細胞株，設(shè)置為對照組，10、20、40、80 mg/L長春新堿組及50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA組，對照組加入PBS，10、20、40、80 mg/L長春新堿組分別加入10、20、40、80 mg/L長春新堿，50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA組分別加入50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA。應(yīng)用MTT法測算3-BrPA及長春新堿干預(yù)后HCT-8/V、HCT-8細胞存活率。應(yīng)用RT-PCR及Western blotting技術(shù)檢測3-BrPA作用HCT-8/V細胞后mdr1基因及P-gp蛋白表達。結(jié)果24 h后，長春新堿組與對照組相比，HCT-8、HCT-8/V細胞存活率降低(P均lt;0.01)；3-BrPA組與對照組相比，細胞存活率均降低(P均lt;0.01)。HCT-8、HCT-8/V mdr1基因相對表達量分別為1.000±0.000、10.539±1.814，Plt;0.01。HCT-8/V細胞經(jīng)0、75、125 μmol/L 3-BrPA處理24 h后,mdr1基因相對表達量分別為1.000±0.000、0.733±0.058、0.542±0.103，不同濃度3-BrPA作用后mdr1基因的相對表達量比較，P均lt;0.01。HCT-8、HCT-8/V細胞P-gp相對表達量分別為0.044±0.036、1.665±0.188，Plt;0.01。HCT-8/V細胞經(jīng)0、75、125 μmol/L 3-BrPA處理24 h后，P-gp相對表達量分別為1.441±0.259、1.140±0.252、0.618±0.274，0、125 μmol/L 3-BrPA處理后P-gp表達比較，Plt;0.01。結(jié)論3-BrPA可抑制結(jié)腸癌HCT-8/V細胞增殖，降低mdr1基因及P-gp蛋白表達。

結(jié)腸癌;三溴丙酮酸;長春新堿;多藥耐藥；細胞增殖

腫瘤的多藥耐藥(MDR)是腫瘤患者化療失敗的主要原因之一，并對患者的化療效果產(chǎn)生嚴重影響。腫瘤耐藥的機制復(fù)雜，細胞編碼的MDR基因mdr1及位于細胞表面P-糖蛋白(P-gp)的高表達被認為是耐藥的主要原因之一[1]。P-gp得以維持正常的生理功能依賴于胞質(zhì)內(nèi)ATP的供應(yīng)，減少ATP的產(chǎn)生是否可逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥成為研究熱點。三溴丙酮酸(3-BrPA)是近年發(fā)現(xiàn)的新型抗腫瘤藥物[2]。以往研究表明，3-BrPA抗腫瘤的作用機制主要通過抑制糖代謝關(guān)鍵酶的活性以減少細胞ATP的產(chǎn)生、降低線粒體膜電位并可激活細胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細胞凋亡、死亡或自噬的發(fā)生，從而對腫瘤發(fā)揮殺滅作用[3～6]。對是否可通過減少ATP產(chǎn)生而抑制多藥耐藥蛋白P-gp的表達以克服耐藥目前尚不明確。2016年10月～2017年5月，我們通過3-BrPA處理結(jié)腸癌耐藥細胞株HCT-8/V及非耐藥細胞株HCT-8，研究3-BrPA對細胞增殖及MDR基因mdr1、P-gp表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌耐藥細胞株HCT-8/V(南京凱基生物公司)；非耐藥細胞株HCT-8(中科院上海細胞庫)；3-BrPA和長春新堿(大連美侖生物公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司；TRIzol試劑及引物合成由Invitrogen公司完成；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量擴增試劑盒(TaKaRa公司)。兔抗人ABCB-1(P-gp)單克隆抗體(Abcam公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠/兔(美國KPL公司)；β-actin(Arigo公司)。QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR System(Life公司)；ECL顯影儀(Tanon-5200，北京原平皓生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) 將人結(jié)腸癌耐藥細胞株HCT-8/V及非耐藥細胞株HCT-8以含10%胎牛血清(FBS)及1%雙抗(青、鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，每周換液3～4次，待細胞生長至70%～80%密度時按照1∶2比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。RPMI1640培養(yǎng)基加入含有終濃度為2 mg/L的長春新堿以維持HCT-8/V細胞耐藥性，并于實驗前2周更換為不含長春新堿的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細胞存活率檢測 采用MTT法。胰酶消化后以1×104/孔細胞數(shù)接種于96孔板中，每孔200 μL。設(shè)置為對照組，10、20、40、80 mg/L長春新堿組及50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA組，對照組加入PBS，10、20、40、80 mg/L長春新堿組分別加入10、20、40、80 mg/L長春新堿，50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA組分別加入50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA，培養(yǎng)24 h，每孔加入15 μL MTT(5 mg/mL)試劑，37 ℃放置4 h，棄上清，加入150 μL DMSO以溶解藍紫色結(jié)晶。搖床上振蕩10 min，490 nm波長處以酶標(biāo)儀檢測光密度(OD)值。細胞存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。每組實驗重復(fù)3次。

1.4 HCT-8/V、HCT-8細胞中mdr1表達檢測 采用RT-PCR法。3-BrPA組處理細胞24 h后，TRIzol法提取細胞總RNA，鑒定RNA質(zhì)量，純度在1.8～2.1。RT-PCR引物序列(Invitrogen公司合成)如下：mdr1正向引物：5′-CACTGGAGCATTGACTACC-3′，反向引物：5′- GCCAACCATAGATGAAGGAT-3′；β-actin正向引物：5′-TGAAGTGTGACGTGGACATC-3′，反向引物：5′-GGAGGAGCAATGATCTTGAT-3′。逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量擴增步驟依據(jù)TaKaRa試劑盒說明書進行，擴增條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s;60 ℃ 34 s;共40個循環(huán)。選用β-actin基因作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析。熒光定量產(chǎn)物選用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳驗證。

1.5 HCT-8/V、HCT-8細胞中P-gp表達檢測 采用Western blotting法。各組細胞經(jīng)3-BrPA處理24 h，提取總蛋白并定量，與上樣緩沖液混合后煮沸備用。電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉2 h，4 ℃孵育一抗過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。所用一抗為ABCB1(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，二抗為山羊抗兔/鼠(1∶5 000)。所得圖像灰度值分析利用Image J軟件，數(shù)據(jù)處理以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值作為蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 HCT-8/V與HCT-8細胞存活率比較 經(jīng)0、10、20、40、80 mg/L長春新堿處理24 h，HCT-8細胞存活率分別為100.00%±0.00%、93.63%±5.19%、64.09%±3.57%、45.01%±4.56%、30.74%±3.28%；HCT-8/V細胞存活率分別為100.00%±0.00%、92.74%±2.00%、92.40%±3.49%、88.15%±2.76%、82.56%±4.65%。經(jīng)0、50、75、100、125 μmol/L 3-BrPA處理24 h，HCT-8細胞存活率分別為100.00%±0.00%、86.01%±11.22%、45.18%±4.65%、19.10%±3.75%、9.53%±4.15%；HCT-8/V細胞存活率分別為100.00%±0.00%、90.02%±13.29%、78.69%±7.89%、42.86%±14.73%、29.05%±10.42%。長春新堿作用于兩種細胞24 h，HCT-8細胞存活率和對照組相比均降低，且呈濃度依賴性(P均lt;0.01)；HCT-8/V細胞存活率和對照組相比均降低(F=27.28,Plt;0.01)。HCT-8/V及HCT-8細胞存活率經(jīng)3-BrPA處理24 h后均降低(P均lt;0.01)。

2.2 HCT-8/V、HCT-8細胞mdr1基因相對表達量比較 HCT-8、HCT-8/V細胞mdr1基因相對表達量分別為1.000±0.000、10.539±1.814，Plt;0.01。 HCT-8/V細胞經(jīng)0、75、125 μmol/L 3-BrPA處理24 h后,mdr1基因相對表達量分別為1.000±0.000、0.733±0.058、0.542±0.103，不同濃度3-BrPA作用后mdr1基因的相對表達量比較，P均lt;0.01。

2.3 HCT-8/V、HCT-8細胞中多藥耐藥蛋白P-gp表達比較 HCT-8、HCT-8/V細胞P-gp相對表達量分別為0.044±0.036、1.665±0.188，Plt;0.01。HCT-8/V細胞經(jīng)0、75、125 μmol/L 3-BrPA處理24 h后，P-gp相對表達量分別為1.441±0.259、1.140±0.252、0.618±0.274，0、125 μmol/L 3-BrPA處理后P-gp表達比較，Plt;0.01。

3 討論

臨床腫瘤患者化療失敗的主要原因之一歸因于腫瘤產(chǎn)生了MDR，腫瘤產(chǎn)生耐藥的主要機制之一與mdr1(ABCB-1)基因所表達的P-gp蛋白增加有關(guān)，除此之外還有肺癌耐藥蛋白(LCRP)、乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等高表達。這些蛋白具有能量依賴性，均屬于ATP結(jié)合盒(ABC)膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族[7]。在研究腫瘤耐藥機制過程中，P-gp是第一個被發(fā)現(xiàn)的ABC蛋白,是一種相對分子質(zhì)量為170 kD的跨膜糖蛋白，由位于人染色體7q21.的mdr1基因所編碼形成。兩條單一相似的多肽鏈組成了P-pg的高級結(jié)構(gòu)，1個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和6個跨膜α螺旋區(qū)組成了單一多肽鏈，藥物的轉(zhuǎn)運通道及結(jié)合位點由跨膜結(jié)構(gòu)域組成，ATP結(jié)合位點為藥物的轉(zhuǎn)運提供所需能量[1,8]。3-BrPA是近年發(fā)現(xiàn)的新型有效抗腫瘤藥物，相關(guān)研究表明，腫瘤細胞膜表面高表達的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(MCT-1)為3-BrPA進入細胞的通道，因此3-BrPA可相對特異性地作用于腫瘤細胞而對正常細胞不產(chǎn)生影響[9]。目前研究表明，3-BrPA主要抗腫瘤作用是通過抑制糖酵解關(guān)鍵酶的活性以使腫瘤組織ATP的產(chǎn)生減少，線粒體膜電位降低，同時可使腫瘤的生長受到抑制并促進其凋亡[10]。

Sadowska-Bartosz等[11]研究結(jié)果表明，對于高表達ABCB1的MDCK-Ⅱ細胞，3-BrPA有更明顯的選擇性抑制作用，ATP水平減少更明顯，從而使高表達ABCB1的MDCK-Ⅱ細胞表現(xiàn)出更好的3-BrPA治療效果。對于ABC高表達的惡性腫瘤SP細胞，3-BrPA可通過抑制糖酵解使ABC轉(zhuǎn)運蛋白失活而克服其耐藥性[12]。3-BrPA可降低耐藥細胞mdr1基因及多藥耐藥蛋白P-gp水平[13]。3-BrPA可使乳腺癌耐藥細胞MCF-7/ARD對表柔比星表現(xiàn)較為敏感，減少藥物的外排并使ATP的產(chǎn)生受到抑制。

近年3-BrPA的研究主要集中于進入細胞的單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白的依賴性、誘導(dǎo)腫瘤凋亡及相關(guān)通路，目前關(guān)于3-BrPA克服腫瘤耐藥的確切機制尚知之甚少。本研究結(jié)果顯示，對結(jié)腸癌正常細胞及耐藥細胞，3-BrPA均可抑制其生長，并可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。耐藥細胞株mdr1基因及P-gp蛋白表達均明顯高于非耐藥細胞，3-BrPA作用于結(jié)腸癌耐藥細胞后，mdr1基因及P-gp蛋白表達均下降，并且具有濃度依賴性。

綜上所述，3-BrPA可克服耐藥細胞的生長并可逆轉(zhuǎn)耐藥，其機制可能和減少腫瘤細胞ATP的產(chǎn)生，從而抑制多藥耐藥基因及蛋白表達有關(guān)。

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唐山市科技支撐項目(14130260)。

張青松(E-mail:klyy888888@163.com)

2017-07-10)