血漿循環(huán)腫瘤DNA SEPT9基因甲基化與血清CEA及CA19-9在結(jié)直腸癌輔助診斷中的價值

劉偉，付波，張安琪，劉義華，盧燕，張姍，唐文強，潘麗

(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城252000)

血漿循環(huán)腫瘤DNA SEPT9基因甲基化與血清CEA及CA19-9在結(jié)直腸癌輔助診斷中的價值

劉偉，付波，張安琪，劉義華，盧燕，張姍，唐文強，潘麗

(聊城市人民醫(yī)院，山東聊城252000)

目的比較SEPT9基因甲基化(mSEPT9)與癌胚抗原(CEA)及糖類抗原19-9(CA19-9)在結(jié)直腸癌(CRC)輔助診斷中的價值。方法收集CRC 35例(CRC組)、結(jié)腸直腸腺瘤65例(腺瘤組)和健康對照人群104例(對照組)的外周血樣本，通過Real-time PCR法檢測血漿mSEPT9狀態(tài)，通過化學(xué)發(fā)光法檢測血清CEA和CA19-9。結(jié)果CRC組、腺瘤組、對照組血漿mSEPT9陽性率分別為74.29%(26/35)、12.31%(8/65)、1.92%(2/104)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.001)。CRC組、腺瘤組、對照組血清CEA陽性率分別為34.29%(12/35)、3.18%(2/63)、1.92%(2/104)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.001)。CRC組、腺瘤組、對照組血清CA19-9陽性率分別為17.14%(6/35)、0(0/62)、0.96%(1/104)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.001)。在不同TNM分期的CRC患者中mSEPT9陽性率：Ⅰ期60.0%(3/5),Ⅱ期62.5%(5/8),Ⅲ期77.78%(7/9),Ⅳ期84.62%(11/13);CEA陽性率：Ⅰ期0(0/5),Ⅱ期25%(2/8),Ⅲ期22.2%(2/9),Ⅳ期61.54%(8/13)；CA19-9陽性率：Ⅰ期0(0/5),Ⅱ期12.5%(1/8),Ⅲ期11.1%(1/9),Ⅳ期30.77%(4/13)。CRC中mSEPT9的靈敏度和特異度分別為74.29%和94.08%，高于CEA及CA19-9單獨檢測(分別為34.29%和17.14%)或二者聯(lián)合檢測(37.14%)的靈敏度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.01)。mSEPT9在早期(Ⅰ～Ⅱ期)CRC中的陽性率達61.54%，高于CEA及CA19-9的陽性率(分別為15.38%和7.69%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。在CRC中mSEPT9與CEA聯(lián)合的靈敏度為80%，與CA19-9聯(lián)合的靈敏度為77.14%，三者聯(lián)合的靈敏度為80%，與mSEPT9單獨應(yīng)用相比均不能顯著提高CRC輔助診斷的靈敏度(P均gt;0.05)。結(jié)論mSEPT9與CEA和CA19-9相比，在CRC輔助診斷中具有更高的靈敏度，可作為獨立的分子標志物，且可用于CRC早期診斷。

結(jié)直腸癌；SEPT9基因甲基化；癌胚抗原；糖類抗原19-9

結(jié)直腸癌(CRC)是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤的第3～4位[1,2],近年發(fā)病率呈上升且年輕化趨勢。目前國內(nèi)CRC篩查診斷主要有兩種方法：糞便隱血檢測(FOBT)和結(jié)腸鏡檢查。FOBT具有簡便、無創(chuàng)、經(jīng)濟、耐受性好等優(yōu)勢，但假陽性率較高[3]。全結(jié)腸鏡檢查或乙狀結(jié)腸鏡檢查是CRC診斷的金標準，靈敏度及特異度高，但患者依從性差，存在腸道出血及感染風險，左右半腸結(jié)果差異明顯[4]。腫瘤細胞生物化學(xué)的改變可反映其與正常細胞生長、增殖、代謝功能的差異，對腫瘤的診斷、鑒別診斷和預(yù)后判斷有重要意義。癌胚抗原(CEA)、糖類抗原19-9(CA19-9)等血清學(xué)標志物在CRC輔助診斷及預(yù)后評估中有重要價值[5]。新近研究發(fā)現(xiàn)在CRC發(fā)生發(fā)展過程中SEPT9基因5′端CpG島常發(fā)生甲基化，導(dǎo)致相應(yīng)SEPT9基因表達降低，Septin蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細胞分裂過程，導(dǎo)致細胞朝癌變方向發(fā)展[6]。血漿游離DNA中SEPT9基因甲基化(mSEPT9)可作為CRC敏感特異的分子標志物[7]。但mSEPT9與CEA、CA19-9在CRC輔助診斷中的價值比較鮮見報道。2016年8月，我們比較了血漿mSEPT9單獨及與血清CEA及CA19-9聯(lián)合在CRC輔助診斷中的價值?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 聊城市人民醫(yī)院2015年8月～2016年7月經(jīng)組織病理確診的CRC患者35例(CRC組)，男20例、女15例，年齡(64.9±8.83)歲。腫瘤部位：結(jié)腸11例，直腸24例。CRC分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期8例，Ⅲ期9例，Ⅳ期13例。CRC組織分化程度：低分化腺癌14例，中分化腺癌17例，高分化腺癌4例。結(jié)直腸腺瘤65例(腺瘤組)，男42例、女23例，年齡(63.7±11.28)歲。腫瘤部位：結(jié)腸52例，直腸13例。均為低危腺瘤。健康對照人群104例(對照組)，男57例、女47例，年齡(62.4±7.39)歲。排除標準包括既往惡性腫瘤史；既往腹部手術(shù)史；接受放療或化療患者；妊娠期婦女。三組年齡、性別無統(tǒng)計學(xué)差異(P均gt; 0.05)。本研究通過聊城市人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 血漿mSEPT9及血清CEA、CA19-9檢測方法 血漿mSEPT9檢測：利用Epi proColon 2.0 CE試劑盒，采用磁珠法提取血漿游離DNA(cfDNA)，通過Real-time PCR法檢測mSEPT9。主要實驗步驟：采集10 mL靜脈血，(1 350±150)rcf離心12 min。再次離心后轉(zhuǎn)移3.5 mL的血漿至一新的離心管中。加入100 μL磁珠，室溫中速旋轉(zhuǎn)混勻45 min。棄上清，轉(zhuǎn)移磁珠至2 mL Eppendorf管。磁珠吸附后，吸棄上清，洗脫DNA。加入150 μL亞硫酸鹽溶液80 ℃恒溫孵育45 min轉(zhuǎn)化DNA。加入磁珠結(jié)合后，洗滌磁珠，干燥后洗脫DNA。PCR反應(yīng)體系：15 μL PCR預(yù)反應(yīng)液加入15 μL經(jīng)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA樣本，進行三重平行PCR測試。PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性20 min；93 ℃變性30 s，62 ℃退火5 s，55.5 ℃延伸35 s，45個循環(huán)。PCR結(jié)果判讀：三個平行測試中，兩個及以上mSEPT9 Ct值lt;45結(jié)果判定為陽性，反之陰性。血清CEA、CA19-9濃度檢測：利用Beckman DXI800全自動化學(xué)發(fā)光儀測定血清樣本中CEA和CA19-9濃度。CEA的截斷值為5 mg/L，CA19-9截斷值為39 kU/L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。定量資料比較采用t檢驗或單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，基于確切的二項分布計算靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值的95%可信區(qū)間(95%CI)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組血漿mSEPT9及血清CEA、CA19-9陽性率比較 CRC組、腺瘤組、對照組血漿mSEPT9陽性率分別為74.29%(26/35)、12.31%(8/65)、1.92%(2/104)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=96.23，P均lt;0.001)。CRC組、腺瘤組、對照組血清CEA水平分別為(56.540±204.723)、(2.209±3.150)、(1.945±1.248)mg/L，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.997，P=0.003)。按照CEA截斷值5 mg/L標準，CRC組、腺瘤組、對照組血清CEA陽性率分別為34.29%(12/35)、3.18%(2/63)、1.92%(2/104)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.001)。CRC組、腺瘤組、對照組血清CA19-9水平分別為(128.926±457.903)、(9.094±6.651)、(10.565±7.211)kU/L，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.671，P=0.004)。按照CA19-9截斷值39 kU/L標準，CRC組、腺瘤組、對照組血清CA19-9陽性率分別為17.14%(6/35)、0(0/62)、0.96%(1/104)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均lt;0.001)。在不同分期的CRC患者中mSEPT9陽性率：Ⅰ期60.0%(3/5)，Ⅱ期62.5%(5/8)，Ⅲ期77.78%(7/9)，Ⅳ期84.62%(11/13)；CEA陽性率：Ⅰ期0(0/5)，Ⅱ期25%(2/8)，Ⅲ期22.2%(2/9)，Ⅳ期61.54%(8/13)；CA19-9陽性率：Ⅰ期0(0/5)，Ⅱ期12.5%(1/8)，Ⅲ期11.1%(1/9)，Ⅳ期30.77%(4/13)。

2.2 血漿mSEPT9、血清CEA和CA19-9單獨及聯(lián)合在CRC輔助診斷中的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較 CEA在CRC診斷中的靈敏度低于mSEPT9，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.283，P=0.002)。CA19-9在CRC診斷中的靈敏度低于mSEPT9，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.03，Plt;0.001)。在早期(Ⅰ～Ⅱ期)CRC中mSEPT9的靈敏度為61.54%(95%CI：35.52%～82.29%)，CEA的靈敏度為15.38%(95%CI：4.33%～42.24%)，CA19-9的靈敏度為7.69%(95%CI：1.37%～33.31%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)。在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)CRC中mSEPT9的靈敏度為81.81%(95%CI：61.48%～92.69%)，CEA的靈敏度為45.45%(95%CI：26.92%～65.34%)，CA19-9的靈敏度為22.73%(95%CI：10.12%～43.44%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.636，Plt;0.001)。CEA和CA19-9聯(lián)合檢測在CRC診斷中的靈敏度為37.14%(95%CI：23.17%～53.66%)，低于mSEPT9單獨檢測的靈敏度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.785，P=0.002)。CEA和mSEPT9聯(lián)合檢測在CRC中的靈敏度為80%(95%CI：64.11%～89.96%)，與單獨mSEPT9檢測相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.324，P=0.777)。CA19-9和mSEPT9聯(lián)合檢測在CRC中的靈敏度為77.14%(95%CI：60.98%～87.93%)，與單獨mSEPT9檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.078，P=1)。CEA、CA19-9和mSEPT9聯(lián)合檢測在CRC中的靈敏度為80%(95%CI：64.11%～89.96%)，與單獨mSEPT9檢測差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.324，P=0.777)。見表1。

3 討論

CRC早期癥狀不典型，早期診斷率僅為5%，60%～70%的CRC患者確診時已進展為中晚期[8]，病死率高，預(yù)后差，因此有效的早期篩查、診斷及干預(yù)治療是CRC防治的關(guān)鍵。

表1 血漿mSEPT9、血清CEA和CA19-9單獨及聯(lián)合檢測在CRC輔助診斷中的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較(%)

現(xiàn)有研究報道證實，血漿mSEPT9在CRC輔助診斷中具有良好的靈敏度(56.1%～79.3%)和特異度(89.6%～99.1%)[7，9，10]。本研究中血漿mSEPT9用于CRC診斷靈敏度和特異度分別為74.29%和94.08%，與文獻報道一致。胃腸道血清學(xué)腫瘤標志物如CEA、CA19-9等已用于CRC的篩查、輔助診斷、腫瘤分級等，但這些指標在CRC診斷中敏感性較低[11]。CEA在CRC診斷中的靈敏度為40.9%～51.8%，特異度為85.2%～95%[12,13]。CA19-9在CRC輔助診斷中的靈敏度較CEA低[11]。CA19-9作為CEA的補充，約7.3%患者CA19-9升高而CEA水平不升高[14]。本研究中CEA和CA19-9在CRC中的靈敏度分別為34.29%和17.14%，均顯著低于mSEPT9。在61.53%CRC患者中mSEPT9檢測陽性而CEA不升高，在80.77%的患者中mSEPT9檢測陽性而CA19-9不升高。以上結(jié)果說明mSEPT9與CEA及CA19-9血清學(xué)腫瘤標志物相比在CRC輔助診斷中具有更高的靈敏度。本研究結(jié)果顯示，mSEPT9在CRC中的靈敏度為74.29%，顯著高于CEA(34.29%)、CA19-9(17.14%)單獨或聯(lián)合檢測(37.14%)。在早期(Ⅰ～Ⅱ期)CRC中mSEPT9的靈敏度61.54%，高于CEA(15.38%)及CA19-9(7.69%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明mSEPT9用于早期CRC的輔助診斷優(yōu)于CEA和CA19-9，具有更高的敏感性，有望成為CRC早期輔助診斷的指標。

mSEPT9與CEA和(或)CA19-9聯(lián)合應(yīng)用均不能提高CRC輔助診斷的靈敏度，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明mSEPT9可以獨立作為CRC輔助診斷的分子標記物。但本研究CRC患者樣本較少，需要繼續(xù)擴大樣本量進行更大規(guī)模的研究來進一步驗證mSEPT9與CEA、CA19-9聯(lián)合檢測的價值。

綜上所述，mSEPT9與CEA、CA19-9相比在CRC輔助診斷中具有更高的靈敏度，可作為獨立的分子標記物用于CRC早期診斷。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.023

R735.3

B

1002-266X(2017)41-0068-03

付波(E-mail：fubo.22@163.com)

2017-06-02)