廣東地區(qū)人群MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂發(fā)病的關(guān)系

蘭菲菲，丁紅珂，陳延冰，杜麗，尹愛華

(廣東省婦幼保健院，廣州 511442)

廣東地區(qū)人群MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂發(fā)病的關(guān)系

蘭菲菲，丁紅珂，陳延冰，杜麗，尹愛華

(廣東省婦幼保健院，廣州511442)

目的探討MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與廣東人群非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)發(fā)病的相關(guān)性。方法收集162例廣東地區(qū)NSCL/P患者為病例組，178例廣東地區(qū)健康對(duì)照者為對(duì)照組，用TaqMan探針和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)兩組受檢者M(jìn)AFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，并比較兩組等位基因和基因型分布。結(jié)果病例組和對(duì)照組的基因型、等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。病例組等位基因T頻數(shù)169(52.16%)、等位基因C頻數(shù)155(47.84%)，對(duì)照組分別為227(63.76%)、129(36.24%)。兩組等位基因頻率比較，P<0.05。病例組基因型TT者50例(30.86%)、TC者69例(42.59%)、CC者43例(26.54%)，對(duì)照組分別為71例(39.89%)、85例(47.75%)、22例(12.36%)，兩組基因型分布相比P<0.05。結(jié)論MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與廣東地區(qū)NSCL/P發(fā)病相關(guān)。

非綜合征性唇腭裂； MAFB基因；rs13041247位點(diǎn)；單核苷酸多態(tài)性；廣東省

非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)，是指不伴發(fā)其它系統(tǒng)器官畸形的單純性唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱，是新生兒常見的先天性頜面部畸形之一。其群體發(fā)病率約1‰～2‰ ,不同國家發(fā)病率相差較大。國外發(fā)病率約為0.6‰～1.69‰。我國是NSCL/P的高發(fā)國家，發(fā)病率約為1.82‰[1]，占出生缺陷的14.01%[2]，僅次于神經(jīng)管畸形的發(fā)生率，在出生嚴(yán)重畸形的發(fā)生中占第二位。廣東省的唇腭裂發(fā)病率約為1.26‰[3]，居各種缺陷的首位或僅次于胎兒水腫綜合征。NSCL/P病因尚不明確，是一種復(fù)雜的多因素疾病，涉及遺傳、環(huán)境及兩者的相互作用，有一定的種族和地區(qū)差異，男女比例大約為2∶1[4]，其病因?qū)W研究是目前出生缺陷研究中的焦點(diǎn)問題之一。NSCL/P是多基因遺傳病，由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起[5]，遺傳學(xué)因素在唇腭裂的發(fā)病中起重要的作用。有關(guān)NSCL/P易感基因的篩選、定位和研究方法是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)方法發(fā)現(xiàn)了一些新的NSCL/P易感基因[6～10]，MAFB基因是其中之一[11]。但是MAFB基因如何在NSCL/P發(fā)病過程中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究觀察了廣東地區(qū)NSCL/P患者M(jìn)AFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性變化，探討MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與廣東地區(qū)NSCL/P的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2015年12月廣東省婦幼保健院收治的162例NSCL/P患者為病例組，患者出生地均為廣東，其中男82例、女80例，年齡1～20歲，明確排除綜合征性唇腭裂(SCL/P)。另選同期查體的178例健康人為對(duì)照組，其中男90例、女88例，年齡1～20歲。兩組受檢者性別、年齡相比P均>0.05。本研究已獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組受檢者或其監(jiān)護(hù)人均已簽署知情同意書并填寫調(diào)查問卷。

1.2 MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法 采集兩組受檢者EDTA-K2抗凝靜脈外周血2 mL，用Lab-Aid核酸DNA分離試劑盒和Lab-Aid820自動(dòng)核酸提取儀(廈門致善生物科技有限公司)提取基因組DNA。用NanoDrop2000 分光光度計(jì)(Thermo Scientific 公司)檢測(cè)DNA的濃度與純度后，存放于-80 ℃生物樣品庫保存。

用TaqMan 單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行等位基因檢測(cè)和基因型分型。MAFB基因rs13041247位點(diǎn)的TaqMan探針由上海生工生物公司合成，探針上游序列5′-TCCTGGCTGCGTCACTTA-3′，下游序列5′-TCCTGGCTGTGTCACTTA-3′。PCR擴(kuò)增引物上游序列5′-CCTGGGTTTGTATTCTTC-3′，下游序列5′-GCTCTATCCCAATGTATGT-3′。用96孔板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)總體積20 μL，包含Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 μL、上下游引物各0.4 μL、TaqMan探針各0.8 μL、Rox reference Dye 0.4 μL、DNA 模板1 μL、去離子水6.2 μL。用7500 Fast Real-Time PCR system(美國ABI公司)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，擴(kuò)增條件為：60 ℃ 1 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20s，65 ℃ 50 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 1 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。先對(duì)兩組基因型和等位基因分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，如果兩組基因型和等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡則采用χ2檢驗(yàn)比較兩組兩組基因型和等位基因分布的差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)過Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，病例組和對(duì)照組的基因型、等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。病例組等位基因T頻數(shù)169(52.16%)、等位基因C頻數(shù)155(47.84%)，對(duì)照組分別為227(63.76%)、129(36.24%)。兩組等位基因頻率比較，P<0.05。病例組基因型TT者50例(30.86%)、TC者69例(42.59%)、CC者43例(26.54%)，對(duì)照組分別為71例(39.89%)、85例(47.75%)、22例(12.36%)，兩組基因型分布相比P<0.05。

3 討論

唇腭裂是人類最常見的面部先天性畸形，分為綜合征性唇腭裂(SCL/P)和NSCL/P，發(fā)病率高。NSCL/P的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今仍未完全明確[12]。唇腭裂不僅嚴(yán)重影響面部美觀，還因?yàn)榭谂c鼻腔相通影響患者發(fā)育，常導(dǎo)致上呼吸道感染，并發(fā)中耳炎，患者吮奶困難，嚴(yán)重的唇腭裂患者不能正常哺乳，導(dǎo)致明顯營養(yǎng)不良。唇腭裂患者在生長(zhǎng)發(fā)育期間說話時(shí)吐字不清，影響語言發(fā)育，給兒童和家長(zhǎng)的心理造成嚴(yán)重的創(chuàng)傷。又因其治療程序復(fù)雜、周期漫長(zhǎng)、花費(fèi)大，給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響出生人口素質(zhì)。因此，唇腭裂的病因和預(yù)防的研究非常重要。

MAFB基因位于20q12，編碼亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子[13，14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)MAFB基因可能參與鼠的顱面外胚層發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)MAFB基因在胚胎小鼠顎板的上皮細(xì)胞表達(dá)較高，推測(cè)MAFB基因可能參與了鼠的顎板發(fā)育，所以其單核苷酸多態(tài)性可能與NSCL /P有關(guān)。有學(xué)者在2011年報(bào)道的研究中發(fā)現(xiàn)，華南漢族人群中MAFB基因SNP位點(diǎn)rs6072081、rs17820943 和rs6102085，以及IRF6基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs10863790與NSCL/P的發(fā)病有顯著關(guān)聯(lián)。Yuan等[15]在拉丁美洲人群的GWAS 研究中發(fā)現(xiàn)MAFB基因的rs11696257和rs13041247位點(diǎn)與NSCL/P相關(guān)。rs13041247位點(diǎn)在MAFB基因的下游區(qū)，其錯(cuò)義突變可能影響了蛋白結(jié)構(gòu)功能[11]。2015年Sun等[16]通過GWAS方法研究發(fā)現(xiàn)MAFB基因的rs13041247位點(diǎn)與NSCL/P相關(guān)。以上研究結(jié)果均表明MAFB基因是NSCL/P的易感基因[15]，MAFB基因的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與NSCL/P發(fā)病存在很強(qiáng)的相關(guān)性。本研究選取的病例組和對(duì)照組均為廣東地區(qū)人群，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，研究群體具有代表性。對(duì)病例組與對(duì)照組MAFB基因rs13041247位點(diǎn)等位基因和基因型分布進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩組MAFB基因rs13041247位點(diǎn)等位基因和基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Moreno等[12]和Sun等[16]的研究結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了MAFB基因rs13041247位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與廣東地區(qū)NSCL /P發(fā)病相關(guān)。本研究?jī)H選擇了已報(bào)道的、通過GWAS分析的有意義的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)。如果將來?xiàng)l件允許，可以進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，或?qū)AFB基因相關(guān)多個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與環(huán)境因素納入進(jìn)行連鎖分析，同時(shí)進(jìn)行家系分析研究，可以更好地探究MAFB基因SNP位點(diǎn)在NSCL/P發(fā)病機(jī)制中所起的作用。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.018

R722.11

B

1002-266X(2017)35-0055-03

2017-05-18)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目(B2014021)。

尹愛華(Email: yinaiwa@vip.126.com)