低分子柑橘果膠對子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa中Caspase-3蛋白表達影響

劉玲，張巖，魏力

(中國醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，沈陽 110000)

·基礎(chǔ)研究·

低分子柑橘果膠對子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa中Caspase-3蛋白表達影響

劉玲，張巖，魏力

(中國醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，沈陽110000)

目的觀察低分子柑橘果膠(LMCP)對子宮內(nèi)膜癌細胞株 Ishikawa中半胱氨酸門冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表達的影響。方法①將Ishikawa細胞隨機分為A、B、C、D組，分別加入終濃度為0、100、300、500 nmol/L 的LMCP培養(yǎng)24 h，用Western blotting法檢測各組Caspase-3。②將Ishikawa細胞隨機分為1、2、3、4組，加入終濃度為300 nmol/L的LMCP分別培養(yǎng)0、6、12、36 h，用Western blotting法檢測各組Caspase-3。結(jié)果A、B、C、D組Ishikawa細胞中Caspase-3蛋白表達量分別為0.30±0.01、0.32±0.01、0.77±0.01、0.79±0.01。Caspase-3蛋白表達量A組

低分子柑橘果膠；子宮內(nèi)膜癌；半胱氨酸門冬氨酸蛋白酶-3；細胞凋亡

Abstract:ObjectiveTo observe the influence of low modified citrus pectin (LMCP ) on the protein expression of Caspase-3 in endometrial cancer cells Ishikawa.Methods① The endometrial cancer cells Ishikawa were randomly divided into four groups: groups A, B, C, and D, which were added with 0, 100, 300, 500 nmol/ LLMCP and then were cultured for 24 h. After that, the protein expression of Caspase-3 was detected by Western blotting. ② The endometrial cancer cells Ishikawa were randomly divided into four groups: groups 1, 2, 3, and 4, which were added with 300 nmol/L LMCP and then were cultured for 0, 12, 24, and 36 h, respectively. The expression of Caspase-3 was deteced by Western blotting.ResultsThe protein expression of Caspase-3 was 0.30±0.01, 0.32±0.01, 0.77±0.01, and 0.79±0.01 in the groups A, B, C, and D, respectively, and the order was as follows: group A

Keywords: low modified citrus pectin; endometrial carcinoma; Caspase-3; apoptosis

腫瘤細胞表面半乳糖凝素(Gal-3)與腫瘤轉(zhuǎn)移過程中細胞黏附和聚集功能密切相關(guān), 多種高轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞均能高表達 Gal-3[1]。低分子柑橘果膠 (LMCP) 的主要成分半乳糖能有效封閉和阻斷 Gal-3 的功能表達[2]，且因其分子質(zhì)量和酯化 度較低，無分支，易被腸道吸收，并可進入血液循環(huán)，有良好的應(yīng)用前景[3]。但是目前LMCP抗腫瘤效果的研究未涉及子宮內(nèi)膜癌。天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)與腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)。本研究觀察了LMCP對子宮內(nèi)膜癌細胞株Ishikawa中凋亡蛋白 Caspase-3表達的影響，探討用LMCP促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 人子宮內(nèi)膜癌細胞株 Ishikawa 細胞 由中國醫(yī)科大學(xué)細胞生物教研室提供，在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中貼壁生長，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中加0.125%胰酶+0.020%EDTA 傳代培養(yǎng)；果膠購于浙江果園康品生物科技有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購于Sigma公司；CO2培養(yǎng)箱CB115 為德國WTB-binder公司生產(chǎn)；小鼠抗人Caspase-3一抗由碧云天生物技術(shù)研究所提供;堿性磷酸酶標(biāo)記的馬抗小鼠及山羊抗兔第二抗體、堿性磷酸酶顯色試劑盒均購于北京中山生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司。

1.2 LMCP的制備 稱取果膠30 g，置于5 L三角瓶 中，加少量95%乙醇濕潤，然后加入3 L沸水，攪拌溶解。待果膠溶解完全后，經(jīng)100目濾布過濾，濾液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原液的1/3。濃縮后的果膠液經(jīng)121 ℃高溫處理30 min，自然冷卻后于-20 ℃冰箱中冷凍2～3 h，再于-78 ℃冰箱中冷凍3 h，最后進行冷凍干燥，樣品粉碎后即得到 LMCP，留取備用，以蒸餾水調(diào)節(jié)實驗中所需濃度。

1.3 不同濃度LMCP培養(yǎng)24 h的子宮內(nèi)膜癌細胞株 Ishikawa中Caspase-3蛋白表達觀察 取對數(shù)生長期的 Ishikawa細胞，胰酶消化、計數(shù)，調(diào)整密度為1×105/ mL，接種于6 cm2的培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的條件下恒溫培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)達到12h后吸出舊培養(yǎng)液，每皿加入3 mL無血清培養(yǎng)液，12 h后吸出培養(yǎng)液。設(shè)A、B、C、D組，分別加入終濃度為0、100、300、500 nmol/L 的LMCP繼續(xù)培養(yǎng)，每組5個復(fù)孔，24 h后常規(guī)收集細胞。采用Western blotting法檢測各組Caspase-3。收集到的細胞用PBS洗3次，冰上裂解20 min后勻漿，15 000 r/min離心15 min,取上清，10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，電泳后將PAGE凝膠中的蛋白通過電轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移至PVDF膜(40 ℃)。取出膜用麗春紅染色，TBST封閉，加入一抗(1∶400稀釋)4 ℃孵育24 h，15 mL TBST洗3次，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，15 mL TBST洗3次,DAB法顯色。以GAPDH為內(nèi)參照。各組Caspase-3表達量以Caspase-3條帶灰度值與GAPDH灰度值之比表示。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 300 nmol/L的LMCP培養(yǎng)不同時間后子宮內(nèi)膜癌細胞株 Ishikawa中Caspase-3蛋白表達觀察 設(shè)1、2、3、4組，加入300 nmol/L的LMCP分別培養(yǎng)0、6、12、36 h，其余同1.3。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LMCP培養(yǎng)24 h的Ishikawa細胞中Caspase-3蛋白表達量比較 A、B、C、D組Ishikawa細胞中Caspase-3蛋白表達量分別為0.29±0.06、0.38±0.06、0.40±0.06、0.42±0.06。Caspase-3蛋白表達量A組

2.2 300 nmol/L的LMCP培養(yǎng)不同時間的Ishikawa細胞中Caspase-3蛋白表達量比較 1、2、3、4組Ishikawa細胞中Caspase-3蛋白表達量分別為0.30±0.01、0.32±0.01、0.77±0.01、0.79±0.01。Caspase-3蛋白表達量1組<2組<3組<4組，P均<0.05。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，LMCP能增強子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa中凋亡蛋白 Caspase-3表達，且此效果有劑量(0～500 nmol/L)和時間(0～36 h)依賴性。Caspase-3是凋亡蛋白家族的重要成員，與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。體外實驗證實，LMCP做為Gal-3的抑制劑，能夠通過抑制腫瘤細胞同型聚集，進而抑制腫瘤血管生成，并減弱腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞黏附作用[5]，發(fā)揮抗腫瘤作用。國內(nèi)學(xué)者張巖等[6,7]通過研究驗證，Gal-3在正常子宮內(nèi)膜向子宮內(nèi)膜腺癌轉(zhuǎn)化的過程中表達逐漸升高，其在子宮內(nèi)膜腺上皮的惡性轉(zhuǎn)化過程中，作為細胞增殖、黏附的調(diào)節(jié)因素，參與了子宮內(nèi)膜腺上皮的癌變，同時該學(xué)者還經(jīng)實驗印證Gal-3及MMP-9在正常增生期子宮內(nèi)膜組織(NE)、不典型增生組織(AH)及子宮內(nèi)膜腺癌組織(EC)中的表達逐漸增高,二者在EC組及AH組表達明顯高于NE組，Gal-3的表達隨腫瘤的分化降低而增加,在低分化癌中表達明顯高于高分化腺癌。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)LMCP作用后胃癌和結(jié)直腸癌SW-480細胞系的細胞活性明顯降低，細胞異體移植瘤的體積明顯小于對照組，同時LMCP能降低Gal-3的表達水平，抑制生存蛋Survivin的表達，促進細胞凋亡。Lu等[9]證實LMCP能增強奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細胞的抑制作用，增強凋亡蛋白Caspase-3、9的表達。Hsieh等[10]發(fā)現(xiàn)LMCP能抑制人類前列腺JCA-1細胞的生長，并且能使該細胞中與癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的nm23基因呈穩(wěn)定低態(tài)表達。國內(nèi)學(xué)者汪峰等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)LMCP 能增加奧沙利鉑對HCT116細胞增殖的抑制作用，該效應(yīng)可能與細胞周期的調(diào)節(jié)以及活化線粒體凋亡途徑有關(guān)。黃志良等[12]研究發(fā)現(xiàn)通過建立小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，高濃度LMCP 組肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目及腫瘤體積均明顯小于對照組，LMCP 能明顯抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。Hsieh等[10]早期的研究表明LCP可能通過下調(diào)cyclin B細胞和Cdc2影響前列腺JCA-1的細胞周期調(diào)，進而導(dǎo)致G2/M期細胞積聚及隨后的細胞凋亡。此后，Streetly等[13]證實順鉑單藥與順鉑、低分子柑橘果膠聯(lián)合用藥均能人肺癌細胞A549細胞凋亡比例增加,聯(lián)合組較單藥組細胞凋亡更加顯著，單藥組與聯(lián)合組A549細胞的凋亡相關(guān)蛋白procaspase-3、8、9蛋白的表達均下調(diào),聯(lián)合組較單藥組procaspase-3、9蛋白表達下調(diào)更為顯著。劉海鷹等[14]在小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型中研究發(fā)現(xiàn)，高濃度低分子柑橘果膠組肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯低于陽性對照組(P<0.05)，陽性對照組和各治療組血清Gal-3濃度均明顯高于陰性對照組(P均<0.01)，該實驗得出結(jié)論Gal-3在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中呈高水平表達，低分子柑橘果膠能明顯抑制結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移。

目前國內(nèi)外未見對LMCP在婦科腫瘤應(yīng)用效果的報道。本研究填補了這一空白，同時本研究結(jié)果也提示，LMCP可以促進子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，說明其有明確的抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的作用?？紤]到LMCP的提煉成本較低，社會來源廣泛，筆者認(rèn)為LMCP在子宮內(nèi)膜癌治療中的應(yīng)用具有很大的研究前景。

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Influence of low modified citrus pectin on protein expression of Caspase-3 in endometrial cancer cells Ishikawa

LIULing,ZHANGYan,WEILi

(TheFourthAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110000,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.008

R737.33

A

1002-266X(2017)35-0026-03

2017-02-15)

遼寧省自然科學(xué)基金項目(2015020482)。

張巖(E-mail：cmu4h-zhy@126.com)