犬在高原低氧環(huán)境適應(yīng)性的研究進(jìn)展

李 靜 陳方良 陳 超 萬九生 唐樹生 韋云芳

（公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204）

犬在高原低氧環(huán)境適應(yīng)性的研究進(jìn)展

李 靜 陳方良*陳 超*萬九生 唐樹生 韋云芳

（公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204）

高原環(huán)境中的低氧因素對(duì)于棲居在高原上的人類和動(dòng)物是最極端的生存挑戰(zhàn)之一。犬在高原低氧環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生一系列適應(yīng)性的生理性變化，同時(shí)，低氧適應(yīng)相關(guān)基因在機(jī)體低氧適應(yīng)的調(diào)控過程中起著非常重要的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多參與低氧適應(yīng)調(diào)控通路的基因被發(fā)現(xiàn)。本文就犬在低氧適應(yīng)性方面的生理變化和相關(guān)基因遺傳機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。目前犬表現(xiàn)出與低氧適應(yīng)相關(guān)的基因大多涉及低氧誘導(dǎo)信號(hào)通路以及血紅蛋白血氧結(jié)合的通路上。開展低氧適應(yīng)性研究可以為低氧相關(guān)疾病的研究提供生理和遺傳基礎(chǔ)資料，尋找低氧分子標(biāo)進(jìn)行高原耐低氧環(huán)境的定向品種培育，同時(shí)對(duì)高原家養(yǎng)動(dòng)物特色基因的保存和利用及高原畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

犬；高原低氧；EPAS1；HBB；適應(yīng)性

1 前言

家犬作為人類最早馴化的家養(yǎng)動(dòng)物和最親密的朋友，在人類進(jìn)化遷徙的各個(gè)時(shí)期，家犬也跟隨人類遷徙到高原地區(qū)并已長期適應(yīng)了高原的低氧環(huán)境。相比于低海拔地區(qū)的犬，高海拔地區(qū)的家犬在長期生活和適應(yīng)積累的過程中，形成了特異的高海拔低氧適應(yīng)性。研究犬在高海拔低氧適應(yīng)性有多方面的重要意義，探求犬在高原地區(qū)適應(yīng)性的生理機(jī)制，對(duì)警犬等用在高原地區(qū)出現(xiàn)的高原反應(yīng)和疾病的防治具有重要作用。同時(shí)尋找低氧適應(yīng)性相關(guān)的分子標(biāo)記，可以定向培育適應(yīng)高原環(huán)境的犬服務(wù)人類和警用等需要。本綜述旨在總結(jié)已有研究經(jīng)驗(yàn)，為下一步的犬高原適應(yīng)性研究打下基礎(chǔ)。

2 高原地區(qū)的環(huán)境特征

高原通常意義上認(rèn)為是海拔2000～3000m以上地域面積較為廣闊的特殊區(qū)域。對(duì)于生存在高原環(huán)境下的生命的影響涉及大氣物理，地球化學(xué)和生物生態(tài)環(huán)境等諸多方面，而低氧，低氣壓，低溫，強(qiáng)紫外線照射，大風(fēng)、低濕度和氣候多變，這些都對(duì)生物的生存帶來了極大的挑戰(zhàn)。其中升高的海拔環(huán)境形成大氣壓下降和其中氧分壓的降低，可吸入氧含量的下降是對(duì)生命影響最主要的環(huán)境因素。研究顯示，當(dāng)海拔上升到4000m時(shí)，空氣中氧含量僅為海平面的60%；而到海拔5000m時(shí)空氣中氧含量僅為海平面的50%甚至更低，因此氧分壓與海拔高度呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)[1]。

3 高原低氧環(huán)境引起的主要的生理變化

高原反應(yīng)其本質(zhì)是機(jī)體的低氧反應(yīng)。以人類為例，未經(jīng)適應(yīng)的人迅速進(jìn)入高海拔地區(qū)，由于空氣中的氧含量低下，導(dǎo)致吸入的空氣氧分壓降低，從而引發(fā)人體低氧血癥，俗稱“低氧”，也就是人們常說的“高原反應(yīng)”。低氧適應(yīng)的本質(zhì)，就是在低氧的條件下，機(jī)體能夠最大化的利用有限的氧，進(jìn)而完成正常的生理生化功能。生活在低海拔地區(qū)的人快速來到高原地區(qū)，對(duì)于輕度和中度低氧，在短暫適應(yīng)一段時(shí)間后，機(jī)體通過整體水平代償機(jī)制調(diào)節(jié)，加快呼吸，增加肺通氣；通過增加紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白濃度，以增加攜氧能力保證氧氣供應(yīng)；或加快心跳速率和加強(qiáng)心臟泵血功能，以增加血氧量等。這些適應(yīng)性的變化可以達(dá)到短期低氧適應(yīng)的目的。

然而對(duì)于更高海拔的重度低氧，整體代償作用則遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足機(jī)體對(duì)能量的需求。雖然人體受低氧環(huán)境的脅迫會(huì)加速產(chǎn)生血紅蛋白以獲得更多氧氣，然而血紅蛋白的過度生產(chǎn)卻又會(huì)導(dǎo)致血液黏稠。因組織細(xì)胞不能充分獲得氧和利用氧，使糖和脂肪不能徹底分解氧化，或堿中毒或酸中毒導(dǎo)致血糖升高、血壓或血脂升高；能量減少，不能滿足細(xì)胞組織需求，造成慢性高原疾病，甚至有可能引發(fā)肺水腫和腦水腫，導(dǎo)致呼吸困難、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)猝死。除因環(huán)境缺氧外，還有精神緊張、勞累等使耗氧量增加，加重缺氧有關(guān)，但是關(guān)鍵還是組織細(xì)胞主動(dòng)獲取氧和利用氧能力降低。

4 犬在高原低氧環(huán)境下機(jī)體生理適應(yīng)性的變化

4.1 對(duì)心血管系統(tǒng)的影響

由于缺氧，犬的情緒興奮和輕微運(yùn)動(dòng)都會(huì)使心跳加速。初到高原，犬體的晨脈（清晨初醒時(shí)的脈搏）較海平面水平高20%左右。10d后，晨脈應(yīng)降至原來水平[2]。所以，通過測(cè)量晨脈的變化程度和恢復(fù)到原有水平的時(shí)間，可以判斷犬對(duì)高原的適應(yīng)能力。

紅細(xì)胞和血紅蛋白在生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)輸氧氣，滿足機(jī)體對(duì)氧氣的需要。而紅細(xì)胞在數(shù)量增多的情況下，紅細(xì)胞體積的減小會(huì)降低血液的黏滯性，進(jìn)而不影響血液的流動(dòng)速度，保證機(jī)體氧氣的運(yùn)輸。高原動(dòng)物在長期適應(yīng)低氧環(huán)境的過程中，其紅細(xì)胞和血紅蛋白存在不同的適應(yīng)特征。如鼠兔[3]、駝?lì)惣鞍哳^雁、安第斯雁，這些高原動(dòng)物均以低血紅蛋白濃度（Hb）、低紅細(xì)胞壓積（Hct）提供高氧親和力。而野牦牛、家牦牛、藏綿羊和藏山羊的血液具有較高的紅細(xì)胞數(shù)（RBC）和血紅蛋白濃度（Hb）[4]。在對(duì)藏豬的研究中也發(fā)現(xiàn)，與普通豬相比，其平均紅細(xì)胞體積（MCV）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）均偏低[5]。

已有研究經(jīng)過檢測(cè)了來源于青藏高原地區(qū)的藏犬以及中國大陸低海拔地區(qū)家犬的血紅蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)高海拔藏犬群體與低海拔家犬群體的平均血紅蛋白濃度并無顯著差異[6]。

4.2 對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響

由于氧氣壓力較低，犬會(huì)因缺氧而過度換氣、通氣。在海平面安靜狀態(tài)下，成年犬呼吸數(shù)為10～15次/min，脈搏數(shù)為70～80 次/min，犬正常心率為70～120次/min[7]。同樣體重的犬，每分鐘需要吸入的空氣量，海拔3000m時(shí)是平原的1.5倍，才能滿足身體對(duì)氧氣的需要，此時(shí)，犬會(huì)感到呼吸急促，如果加上運(yùn)動(dòng)，犬會(huì)通過增加呼吸頻率來適應(yīng)地低氧環(huán)境。

5 犬在高原低氧環(huán)境下適應(yīng)性的遺傳機(jī)制

氧是機(jī)體及細(xì)胞進(jìn)行有效能量代謝不可缺少的物質(zhì)，低氧使機(jī)體及細(xì)胞的生理發(fā)生改變，嚴(yán)重時(shí)可引起一系列的損傷和疾病。為適應(yīng)低氧環(huán)境，生物經(jīng)長期進(jìn)化，已形成一套完整的氧感受機(jī)制及在不同氧化環(huán)境下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制來適應(yīng)低氧環(huán)境，達(dá)到生存目的。高原世居動(dòng)物對(duì)低氧適應(yīng)并不太依賴于器官功能的變化，更重要的是通過對(duì)細(xì)胞代謝的調(diào)整和許多抗低氧因子誘導(dǎo)從分子水平上來適應(yīng)高原低氧環(huán)境。生物體對(duì)外界環(huán)境刺激作出反應(yīng)，普通的機(jī)制是通過配體與受體結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的升高或降低，機(jī)體和細(xì)胞對(duì)低氧信號(hào)的識(shí)別及對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控也遵循這一機(jī)制[8]。其中低氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia inducible factor，HIF）是廣泛存在于人類與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種非常重要的氧氣調(diào)節(jié)因子，在低氧條件下，可以調(diào)控許多與低氧應(yīng)答相關(guān)的基因表達(dá)[9]，促進(jìn)機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)，是低氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子。HIF 是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。α亞基共有3種亞單位，其中氧濃度主要通過對(duì)HIF1α和HIF2α的調(diào)節(jié)使其在低氧表達(dá)中扮演核心調(diào)控的作用[10]。在低氧狀態(tài)下，α亞基和β亞基組合成二聚體形式并且轉(zhuǎn)錄HIF調(diào)控的下游基因[11]，使其在生理上產(chǎn)生適應(yīng)性的變化。目前對(duì)犬的高原適應(yīng)性研究是通過全基因組測(cè)序的方法，最終確定了EPAS1和HBB基因是在高原犬在低氧適應(yīng)性方面起重要作用的候選功能基因。

5.1 EPAS1基因?qū)Ω咴m應(yīng)性的影響

EPAS1基因（Endothelial PAS domain protein 1，內(nèi)皮細(xì)胞含PAS結(jié)構(gòu)域蛋白-1），在家犬中編碼HIF2α蛋白，位于家犬第10號(hào)染色體Chr10：51，676，759-51，760，023，包含有個(gè)16外顯子和15個(gè)內(nèi)含子，全長103.27kb，共轉(zhuǎn)錄2607bp堿基，編碼869個(gè)氨基酸。EPAS1為堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，并且具有PSA結(jié)構(gòu)域，EPAS1在低氧條件下對(duì)系統(tǒng)的低氧應(yīng)答起到至關(guān)重要的作用，是主要的低氧誘導(dǎo)因子之一[12-14]。

EPAS1主要表達(dá)于肺、胎盤和血管內(nèi)皮細(xì)胞，由編碼的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性由氧氣進(jìn)行調(diào)節(jié)作用。常氧狀態(tài)下，位于HIF2α蛋白中的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域（oxygen dependent degradation domain，ODDD）與PHD蛋白（prolylhydroxylase domain，特定脯氨酸殘基被脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白）發(fā)生羥化，使得HIF2α蛋白發(fā)生泛素化，最終被蛋白水解酶降解，因此HIF2α蛋白在細(xì)胞中含量保持很低的狀態(tài)。而當(dāng)?shù)脱鯐r(shí)，PHD蛋白失去活性，ODDD結(jié)構(gòu)域中的特定脯氨酸殘基不能發(fā)生羥化，HIF2α蛋白因不能被水解而含量增多，從而進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)相關(guān)應(yīng)對(duì)低氧的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[15]。

5.2 HBB基因?qū)Ω咴m應(yīng)性的影響

血紅蛋白β基因（Hemoglobinβ，HBB）又稱β珠蛋白基因。在家犬基因組上位于Chr21：31，299，273-31，306，907，由個(gè)3外顯子構(gòu)成，全長7.57kb，共轉(zhuǎn)錄635bp堿基，編碼147個(gè)氨基酸。HBB基因編碼血紅蛋白中的β多肽鏈，與血紅素結(jié)合形成β -珠蛋白[16-18]。

在絕大多數(shù)的脊椎動(dòng)物中，血紅蛋白分子是由4個(gè)珠蛋白亞基裝配組成。每個(gè)亞基則由一條肽鏈和一個(gè)亞鐵血紅素分子結(jié)合而成，肽鏈會(huì)以螺旋的形式盤旋成球形，將亞鐵血紅素分子結(jié)合在內(nèi)將其環(huán)繞在內(nèi)形成一個(gè)珠蛋白。HBB基因編碼的肽鏈組成β珠蛋白是構(gòu)成血紅蛋白的重要組成因素。由于血紅蛋白在氧氣中運(yùn)輸起重要作用，結(jié)構(gòu)變異會(huì)直接導(dǎo)致其氧親和力變化，進(jìn)而影響動(dòng)物對(duì)低氧的適應(yīng)。目前的研究認(rèn)為HBB基因在功能上參與了氧從肺部輸送交換至全身各器官的重要功能。具有高氧親和力的血紅蛋白是高原動(dòng)物適應(yīng)低氧環(huán)境的最重要的特征之一[19]。在一些高原物種上的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在血紅蛋白鏈和鏈上的突變，會(huì)改變血紅蛋白與氧氣的親和力，從而對(duì)高原上的動(dòng)物對(duì)氧氣的利用效率產(chǎn)生影響，這一例子已經(jīng)在安第斯蜂鳥和高原鹿鼠上進(jìn)行過研究報(bào)道[20-22]。

5.3 犬在高原低氧環(huán)境下適應(yīng)性的遺傳機(jī)制

王國棟[23]等對(duì)犬在青藏高原低氧環(huán)境下適應(yīng)性的研究發(fā)現(xiàn)通過等量混合樣品的全基因組重測(cè)序獲得240萬個(gè)SNP位點(diǎn)信息，再結(jié)合Fst檢驗(yàn)、Fisher’s精確檢驗(yàn)的嚴(yán)格篩選條件，最終有12個(gè)基因組區(qū)域的14個(gè)基因同時(shí)通過了兩個(gè)檢驗(yàn)的篩選成為中國大陸家犬中最有可能受到高原適應(yīng)性正選擇的基因。這其中內(nèi)皮PAS結(jié)構(gòu)域包含蛋白1基因（EPAS1基因）與血紅蛋白β基因（HBB基因）中包含有非同義突變，并且顯著性非常突出。為了進(jìn)一步了解EPAS1基因的4個(gè)非同義突變等位基因頻率的情況，進(jìn)行了擴(kuò)展實(shí)驗(yàn)，采集了61只只來自西藏的藏犬和149只來自低海拔地區(qū)的本地土狗進(jìn)行SNP檢測(cè)，結(jié)果顯示位于EPAS1上的突變?cè)诓厝型蛔冃偷任换蝾l率為95%，而在低海拔土狗中這一數(shù)值僅為4.9%。這些結(jié)果顯示EPAS1基因在青藏高原犬的高原適應(yīng)性方面起到非常重要的作用。HBB基因的2個(gè)非同義突變等位基因頻率在藏犬中為86.4%，在低海拔土狗中僅為17.5%，突變型等位基因同樣表現(xiàn)出與高海拔群體的高度一致。

研究隨后擴(kuò)大采樣地點(diǎn)和樣本量，在中國大陸地區(qū)的連續(xù)海拔梯度上共采集了17個(gè)地點(diǎn)一共511只中國本地土狗的樣本，這個(gè)地點(diǎn)遍布中國地區(qū)各省市，海拔梯度從海平面水平城市到青藏高原地區(qū)，覆蓋包括了低海拔地區(qū)，代表如廣州（海拔約50m、江西（約300m）、雅安（約600m）等，中等海拔地區(qū)如昆明（約1900m）、云南麗江（約2500m）、云南迪慶（約3400m）、甘肅甘南（約3600m）。以及高海拔地區(qū)如四川阿壩（約3700m）、青海玉樹（約4000m）、香格里拉（約4100m），西藏（約4100m）等。使用測(cè)序的方法，對(duì)EPAS1和HBB上6非同義突變點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)本地土狗進(jìn)行等位基因頻率的分析研究，這些突變位點(diǎn)的等位基因頻率都呈現(xiàn)出隨著采樣地海拔的升高而上升的趨勢(shì)，突變型等位基因頻率與海拔呈現(xiàn)出極其顯著的正相關(guān)性。進(jìn)一步在群體水平上證明了EPAS1基因與HBB基因在家犬高原適應(yīng)性中起到非常重要的作用，并受到了正選擇的搭載效應(yīng)的影響。

6 小結(jié)

高原低氧適應(yīng)性的研究在生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，無論是從生理生化水平，遺傳機(jī)制水平或者是從進(jìn)化等角度，都是近期的熱點(diǎn)研究問題。開展犬高原的低氧適應(yīng)研究，可以為高原民族和高原動(dòng)物、對(duì)前往高原地區(qū)的人員和動(dòng)物的適應(yīng)性和高原疾病研究提供生理和分子基礎(chǔ)資料。另一方面可以為快速、準(zhǔn)確選育既高產(chǎn)又耐低氧的優(yōu)良品種尋找低氧分子標(biāo)記，開展適應(yīng)高原低氧環(huán)境的定向品種培育；同時(shí)對(duì)高原動(dòng)物特色基因的保存和利用及高原畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

[1] CM Beall.Two Routes to Functional Adaptation：Tibetan and Andean High-Altitude Natives[J].Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America，2007，104Suppl1（Suppl 1）：8655-8660.

[2] 杜振華，孔慶波，畢海龍.犬的高原反應(yīng)及應(yīng)對(duì)策略探討[J].中國工作犬業(yè)，2010，（6）：18-20.

[3] 王曉君，魏登邦，魏蓮，等.高原鼢鼠和高原鼠兔紅細(xì)胞低氧適應(yīng)特征[J].四川動(dòng)物，2008，27（2）：1100-1103.

[4] 蔡全林.西藏綿羊、山羊、黃牛、牦牛生理指標(biāo)測(cè)定[J].中國獸醫(yī)雜志，1980，（2）：44-46.

[5] 顧為望，劉運(yùn)忠，唐小江，等.西藏小型豬血液生理生化指標(biāo)的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，15（1）：60-63.

[6] 樊若溪.青藏高原家犬的高原適應(yīng)性遺傳機(jī)制[D].云南大學(xué)，2015.

[7] 金洪興.犬病的診斷技術(shù)[J].浙江畜牧獸醫(yī)，2000，25（2）：40.

[8] SemenzaG.Wang G.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site requiredfor transcription activation[J].Mol Cell Biol，1992，12 （12）：5447-5454.

[9] GL Semenza.Targeting HIF-1 for cancer therapy[J].Nature Reviews Cancer，2003，3（10）：721.

[10] Y oon D，Pastore Y D，Divoky V，et al．Hypoxia-inducible factor-1 deficiency results in dysregulated erythropoiesis signaling and iron homeostasis in mouse development[J].Journal of Biological Chemistry，2006，281（35）：25703-25711.

[11] Majmundar AJ，Wong WJ，Simon MC，et al．Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress[J].Mol Cell，2010，40 （2）：294-309.

[12] HOCKEL M.SCHLENGER K.MITZE M，etal.Hypoxia and Radiation Response in Human Tumors[J].Seminars in radiation oncology，1996，6（1）：3-9.

[13] TINA H，HAMMER R E，MATSUMOTO A M，etal.The hypoxiaresponsive transcription factor EPAS1 is essential for catecholamine homeostasis and proection against heart failure during embryonic development[J].Genes &development，1998，12（21）：3320-3324.

[14] LEEFS，PERCYMJ.The HIF pathway and erythrocytosis[J].Annual review of pathology，2011，6（6）：165.

[15] S Jain，E Maltepe，MM Lu，et al，Gene expression pattern Expression of ARNT，ARNT2，HIF1a，HIF2a and Ah receptor mRNAs in the developing mouse[J].Seventeenth-Century French Studies，2012，34（2）：158-175.

[16] U Stelzl，U Worm，M Lalowski，et，al.A human protein-protein interaction network：a resource for annotating the proteome[J].Cell，2005，122（6）：957-968.

[17] B Shaanan. Structure of human oxyhaemoglobin at 2.1 A resolution[J]. Journal of Molecular Biology，1983，171（1）：31-59.

[18] R Campos，M Branco，S Weiss，N Ferrand.Patterns of hemoglobin polymorphism [α-globin（HBA）and β-globin（HBB）] across the contact zone of two distinct phylogeographic lineages of the European rabbit（Oryctolaguscuniculus）[M].Springer Netherlands，2007：237-255.

[19] 江炎庭，茍瀟，李明麗，等.高原民族和動(dòng)物低氧適應(yīng)血液生理特征及相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（10）：149-153.

[20] Projecto-Garcia J，Natarajan C，Moriyama H，et al. Storz. Repeated elevational transitions in hemoglobin function during the evolution of Andean hummingbirds[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（51）：20669-20674.

[21] Natarajan C，Inoguchi N，Weber R E，et al. Epistasis among adaptive mutations in deer mouse hemoglobin[J]. Science，2013，340 （6138）：1324.

[22] Storz J F，Runck A M，Moriyama H，et al. Genetic differences in hemoglobin function between highland and lowland deer mice[J]. Journal of Experimental Biology，2010，213（15）：2565-2574.

[23] Ruoxi，Hong，Shifang，Chunling，et.al.A Positive Correlation between Elevated Altitude and Frequency ofMutant Alleles at the EPAS1 and HBB Loci in Chinese Indigenous Dogs[J].Journal of Genetics and Genomics，2015，42（4）：173-177.

公安部科技強(qiáng)警基礎(chǔ)工作（基礎(chǔ)研究類）專項(xiàng)項(xiàng)目（2016GABJC38）

李靜（1989—），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)榫肿舆z傳育種。陳超（1974-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，副研究員，碩士，研究方向?yàn)榫膊》乐窝芯俊?/p>

陳方良（1977—），男，云南陸良人，副研究員，碩士，研究方向?yàn)榫膊》乐窝芯俊?/p>