流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史及在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

王琳

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史及在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

王琳

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱150069）

流式細(xì)胞術(shù)作為一種對(duì)單細(xì)胞定量分析和分選的新技術(shù)已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等研究領(lǐng)域，文章對(duì)其發(fā)展及在獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用作以綜述。

流式細(xì)胞術(shù)；發(fā)展；應(yīng)用

Abstract:As a new technique for single cell quantitative analysis and separation,flow cytometry has been widely used in research field of immunology,hematology,oncology,cell biology,cytogenetics, biochemistry and so on.This article reviewed the development and application of flow cytometry in veterinary medicine.

Key words:flow cytometry;development;application

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段，它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代比較先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)[1]。

1 流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展歷史

1.1 流式細(xì)胞術(shù)儀器的發(fā)展

1930年Casperrsson和Thorell開(kāi)始致力于細(xì)胞的計(jì)數(shù)；1934年世界上最早設(shè)想使細(xì)胞檢測(cè)自動(dòng)化的人Moldaven試圖用光電儀記錄流過(guò)1根毛細(xì)管的細(xì)胞數(shù)量，開(kāi)創(chuàng)了流式細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)的基礎(chǔ)；1936年Caspersson等引入顯微光度術(shù)；1940年Coons提出用結(jié)合熒光素的抗體去標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白；1947年Guclcer運(yùn)用層流和湍流原理研制煙霧微粒計(jì)數(shù)器；1949年Coulter提出在懸液中計(jì)數(shù)粒子的方法并獲得專(zhuān)利；1950年Caspersson用顯微分光光度計(jì)在紫外（UV）和可見(jiàn)光光譜區(qū)檢測(cè)細(xì)胞；1953年Croslannd-Taylor應(yīng)用分層鞘流原理，成功地設(shè)計(jì)紅細(xì)胞光學(xué)自動(dòng)計(jì)數(shù)器；Parker和Hutcheon描述一種全血細(xì)胞計(jì)數(shù)器裝置，成為流式細(xì)胞儀的雛形；1954年Beirne和Hutchcon發(fā)明光電粒子計(jì)數(shù)器；1959年B型Coulter計(jì)數(shù)器問(wèn)世；1965年Kamemtsky等提出兩個(gè)設(shè)想：用分光光度計(jì)定量細(xì)胞成分和結(jié)合測(cè)量值對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)；1967年Kamemtsky和Melamed在Moldaven的方法基礎(chǔ)上提出細(xì)胞分選的方法；1969年Van Dilla Fulwyler及其同事們?cè)贚osALmos，NM（即現(xiàn)在的National Flow Cytometry Resource Labs）發(fā)明第一臺(tái)熒光檢測(cè)細(xì)胞計(jì)；1972年Herzenberg研制出一個(gè)細(xì)胞分選器的改進(jìn)型，能夠檢測(cè)出經(jīng)熒光標(biāo)記抗體染色的細(xì)胞的較弱的熒光信號(hào)[2]。進(jìn)入20世紀(jì)80年代和90年代，流式細(xì)胞儀除了在70年代儀器基礎(chǔ)上進(jìn)行完善多光束、多參數(shù)技術(shù)外，在技術(shù)原理和設(shè)計(jì)研制方面似乎沒(méi)有突破性的進(jìn)展。

現(xiàn)今流式細(xì)胞儀在各種功能上有很大提高，隨著光電技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，流式細(xì)胞儀已開(kāi)始向模塊化發(fā)展，即其光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)器單元和電子系統(tǒng)都可以按照實(shí)驗(yàn)要求隨意更換[3]。進(jìn)入21世紀(jì)，流式細(xì)胞術(shù)已經(jīng)日臻完善，成為分析細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域中無(wú)可替代的重要工具。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)方法學(xué)的發(fā)展

從FCM發(fā)展史看，初始10年是以測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)DNA含量或RNA含量、蛋白質(zhì)或線(xiàn)粒體等大分子結(jié)構(gòu)，研究細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)為重點(diǎn)。在20余年中，F(xiàn)CM方法學(xué)的發(fā)展十分迅速。1974年Hoffman和Laris首先用FCM檢測(cè)了紅細(xì)胞的膜電位；1975年Milstein和K?hler建立了單克隆抗體技術(shù)；1979年Kung等就用該技術(shù)在FCM上區(qū)分了人類(lèi)T淋巴細(xì)胞亞群抗原。以后Loken又利用單激光束研究了同一細(xì)胞的兩種抗原。1975年Gratzner等建立溴脫氧尿嘧啶核苷摻入增殖細(xì)胞，用FCM檢測(cè)的方法了解了細(xì)胞的增殖活性。1976年Darzynkienicz等建立對(duì)同一細(xì)胞DNA-RNA相關(guān)測(cè)量的方法[4]。1979年Visser等用FCM測(cè)量了細(xì)胞中pH的變化。Valet等建立了用FCM測(cè)量細(xì)胞表面電荷的方法。1980年Thorell建立了用FCM測(cè)量細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的方法。1982年Oi發(fā)明了新一代免疫熒光染料——藻膽蛋白系列，拓寬了FCM的研究領(lǐng)域，使熒光免疫技術(shù)有了進(jìn)一步的發(fā)展。近幾年隨著流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展，在一個(gè)樣品可以同時(shí)檢測(cè)雙色、三色及四色熒光染料標(biāo)記的單克隆抗體，這對(duì)研究不同抗原間的關(guān)系提供了方便，使流式免疫熒光標(biāo)記研究也獲得了充分發(fā)展[5]。近年來(lái)出現(xiàn)了許多FCM的靈活數(shù)據(jù)分析軟件，以不同圖像顯示多參數(shù)之間的相關(guān)性，進(jìn)一步推動(dòng)了FCM技術(shù)的發(fā)展[6]。

2 流式細(xì)胞術(shù)在預(yù)防獸醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.1 淋巴細(xì)胞亞群分析

人及動(dòng)物體內(nèi)白細(xì)胞表面標(biāo)志是評(píng)價(jià)機(jī)體免疫狀態(tài)的基礎(chǔ)。流式細(xì)胞術(shù)不僅能檢測(cè)機(jī)體3大免疫細(xì)胞的數(shù)量，包括T細(xì)胞（CD3+CD19-細(xì)胞）、B細(xì)胞（CD19+CD3-細(xì)胞）和NK細(xì)胞（CD3-/CD（16+56）+細(xì)胞），而且還可以檢測(cè)3大免疫細(xì)胞的活性細(xì)胞水平，包括活性T細(xì)胞（CD3+/HLA-DR+細(xì)胞）、活性B細(xì)胞（CD19+/CD5+細(xì)胞）和活性NK細(xì)胞（CD（16+56）+/Fas配體+細(xì)胞）。T細(xì)胞是機(jī)體免疫的核心細(xì)胞。末梢血T細(xì)胞發(fā)育為功能不同的亞群，各亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時(shí)，就可能導(dǎo)致機(jī)體免疫紊亂并發(fā)生一系列的病理變化。在各種疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中用不同的T細(xì)胞表型標(biāo)志物來(lái)測(cè)定人外周血細(xì)胞中T輔助/誘導(dǎo)細(xì)胞亞群（CD3+CD4+細(xì)胞）和T抑制/細(xì)胞毒細(xì)胞亞群（CD3+CD8+細(xì)胞），及二者的比值（CD3+CD4+/CD3+CD8+）來(lái)評(píng)價(jià)體內(nèi)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)平衡狀態(tài)。利用CD4和CD29、CD45-RA單克隆抗體可以將CD4細(xì)胞群分為CD4+CD45RA+的T抑制細(xì)胞誘導(dǎo)亞群及CD4+CD29+的T輔助細(xì)胞誘導(dǎo)亞群；也可以利用CD8和CD28單抗將CD8細(xì)胞分為CD8+CD28+的細(xì)胞毒T細(xì)胞亞群和CD8+CD28-的T抑制細(xì)胞。T細(xì)胞亞群的檢測(cè)可以幫助研究各種與免疫有關(guān)的疾病發(fā)病機(jī)制，特別是T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能[6]。

2.2 微生物鑒別

流式細(xì)胞術(shù)可對(duì)大數(shù)量細(xì)菌逐個(gè)快速的進(jìn)行多參數(shù)精確測(cè)量，現(xiàn)在多數(shù)用于對(duì)酵母菌和各類(lèi)細(xì)菌的測(cè)量與分析。酵母菌的測(cè)量在技術(shù)上比較簡(jiǎn)單，自身體積大，其DNA含量約為人類(lèi)二倍體細(xì)胞DNA含量的1/200?，F(xiàn)在已用定量DNA、RNA和光散射方法來(lái)研究酵母菌的細(xì)胞周期。此外，也采用同樣的方法對(duì)原生生物、藻類(lèi)和霉菌類(lèi)以及各種重金屬對(duì)其的影響進(jìn)行了研究。另外用FITC結(jié)合的抗血清可作種系鑒別，應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)已能代替臨床上經(jīng)典的費(fèi)時(shí)繁瑣的細(xì)菌抗生素敏感試驗(yàn)和傳染活性的測(cè)定。在工業(yè)中，流式細(xì)胞術(shù)可用于快速微生物鑒定，如對(duì)飲用水及原油中的微生物鑒定與控制。

3 流式細(xì)胞術(shù)新技術(shù)的應(yīng)用

3.1 液相芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)是近幾年來(lái)隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的進(jìn)展在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已被大家所熟知。其將生物芯片技術(shù)和FCM有機(jī)結(jié)合在一起，把不同生物探針（核酸、蛋白等）標(biāo)記在各種有熒光的微球上，以熒光標(biāo)記微球作為反應(yīng)載體在液相系統(tǒng)中完成生物學(xué)反應(yīng)，即為流式細(xì)胞術(shù)液相芯片技術(shù)[7]。其組成由微球體+探針+目的分子+報(bào)告分子的一種簡(jiǎn)單反應(yīng)模式，可以在同一液相中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的分子，如對(duì)血液中多種白細(xì)胞介素檢測(cè)。

3.2 定量流式細(xì)胞分析

定量流式細(xì)胞分析是指采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞或微粒上標(biāo)記熒光分子的定量分析，從而對(duì)細(xì)胞的生物分子進(jìn)行精確測(cè)量，如每個(gè)分子表達(dá)的平均分子數(shù)、抗原數(shù)等[8]。定量流式細(xì)胞分析不同于以往的相對(duì)熒光強(qiáng)度或陽(yáng)性細(xì)胞百分率測(cè)量，更為準(zhǔn)確、靈敏，如在獲得性免疫缺陷綜合征和“非典”的研究與治療中，對(duì)外周血中的CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行絕對(duì)記數(shù)，來(lái)反映病情進(jìn)展及監(jiān)測(cè)療效[9]。

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The Development of Flow Cytometry and Its Application in Veterinary Medicine

WANG Lin

（Harbin Pharmaceutical Group Biological Vaccine Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

Q291；S85

A

1001-0084（2017）09-0039-02

2017-08-06

王琳（1982-），女，遼寧錦西人，中級(jí)獸醫(yī)師，主要從事疫苗生產(chǎn)。