豬偽狂犬病基因缺失弱毒疫苗的研發(fā)及應(yīng)用進展

姚海飛張萬紅嚴曙光

（1.淮安市洪澤區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇洪澤 223100；

2.淮安市洪澤區(qū)東雙溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇洪澤 223100）

豬偽狂犬病基因缺失弱毒疫苗的研發(fā)及應(yīng)用進展

姚海飛1張萬紅1嚴曙光2

（1.淮安市洪澤區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇洪澤 223100；

2.淮安市洪澤區(qū)東雙溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，江蘇洪澤 223100）

豬偽狂犬?。≒seudorabies）是一種以發(fā)熱、腦脊髓炎、繁殖障礙為主要癥狀的急性、熱性傳染病。病原為偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）。近年來該病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失。目前該病尚無特效治療藥物，主要采用疫苗接種作為重點防控手段。因此，本文重點綜述了近年來臨床使用較廣泛的豬偽狂犬基因缺失弱毒疫苗的研發(fā)及應(yīng)用情況。

豬偽狂犬??；弱毒疫苗；基因缺失

豬偽狂犬病是由皰疹病毒科偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎、繁殖障礙為主要癥狀的急性、熱性傳染病[1]。我國將本病列為二類動物疫病。豬是偽狂犬病毒的天然宿主、貯存者和傳播者。該病毒可感染各個年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、哺乳仔豬高死亡率及種豬不育等，而且該病還可影響免疫系統(tǒng)，繼而導(dǎo)致與其他疾?。ㄈ缢{耳病等）發(fā)生混合感染的概率大大提高[2]。目前，豬偽狂犬病在我國廣泛流行，嚴重威脅著豬群的健康，并造成了嚴重經(jīng)濟損失。

該病最為有效的策略防控是疫苗免疫。目前我國使用最廣泛的是通過基因工程改造的PRV活病毒疫苗，本文將對該類疫苗目前的研究進展進行論述。

1 PRV基因缺失疫苗研究進展

隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，以及對PRV各病毒蛋白功能的不斷深入研究，一類新型的PRV減毒活疫苗逐漸發(fā)展起來。該類疫苗主要通過分子生物學(xué)的手段，對PRV基因組中毒力基因若干堿基進行刪除，已達到徹底失活該基因的目的，但仍能保留該毒株較強的免疫原性。

1.1 單基因缺失PRV疫苗

1.1.1 TK單基因缺失的PRV疫苗

該類疫苗是1986年美國批準上市的的第一批PRV基因工程疫苗。該疫苗以BUK毒株為母本，缺失TK序列上一段148bp長度的序列構(gòu)建而成。該毒株非常穩(wěn)定，在傳代多次后仍保持TK缺失狀態(tài)。該類疫苗代表性毒株包括BUK-dl3、NIA-3、ADV-783、Begonia等毒株。動物試驗表明，該疫苗不僅安全性好，而且攻毒保護率較高[3]。我國學(xué)者也分別在本土PRV流行毒株的基礎(chǔ)上成功缺失了TK基因并對缺失毒株進行了一系列生物學(xué)特性等研究并取得較好進展[4-6]?？傮w而言，TK單缺失后PRV毒力可以下降到尚可接受的水平，故當(dāng)前的PRV基因工程疫苗均在現(xiàn)有TK基因單缺失的基礎(chǔ)上進行進一步研發(fā)。

1.1.2 gD單基因缺失PRV疫苗

gD基因有利于增強子代病毒感染性，進而增強感染動物向其他動物傳播的能力。因此缺失該基因制備的PRV基因工程疫苗對動物的毒力較低，且可誘導(dǎo)免疫豬產(chǎn)生了較好保護力。

1.2 雙基因缺失PRV疫苗

盡管TK基因缺失可以顯著降低毒株毒力，但無法用血清學(xué)的方法區(qū)分野毒感染和疫苗感染，因此在TK缺失的基礎(chǔ)上，在編碼非必需糖蛋白的基因內(nèi)引入一個新的缺失，或插入一個報告基因，這樣得到的突變株不能產(chǎn)生缺失糖蛋白，免疫動物后不能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，因此可以通過血清學(xué)方法區(qū)分免疫接種和野毒感染豬，多基因的缺失也有助于進一步降低毒株的毒力。

1.2.1 TK-/gE-雙缺失疫苗

gE基因缺失有助于對疫苗接種和野毒感染豬只做鑒別診斷，因此在TK缺失的基礎(chǔ)上進一步缺失gE基因研制PRV基因工程疫苗，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的認可和應(yīng)用。VanOirschot等于1990年以NIA-4為母本病毒，成功構(gòu)建了TK/gE雙基因缺失株，該疫苗免疫動物后對豬、牛、羊均安全性較好[7]。我國彭大新等通過Cre/loxP系統(tǒng)成功構(gòu)建了基于PRV-JSZ株的TK/gE雙基因缺失株，并表現(xiàn)較好的安全性和保護力[8]。

1.2.2 TK-/gG-雙缺失疫苗

該疫苗主要以TK-單缺失毒株為母本，進一步構(gòu)建TK-/gG-雙缺失毒株，該毒株對豬無致病性，但對牛、犬、貓毒性較強。該疫苗免疫豬后，對強毒株具有較好抵抗力。而且通過建立基于gG蛋白的ELISA方法可以區(qū)分野毒感染與疫苗接種。但該檢測方法的靈敏度仍然不及基于gE蛋白的ELISA方法，因此一定程度限制了TK-/gG-疫苗的推廣。不過我國華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春院士基于HB-98株所改進研制TK-/gG-雙缺失疫苗目前國內(nèi)市場反饋較好。

1.2.3 TK-/gC-雙缺失疫苗

gC基因也可以作為該類疫苗區(qū)分野毒和疫苗毒的標記，有學(xué)者[9]以BUK-dl3株為親本，進一步缺失了gC基因片段，構(gòu)建了TK-/ gC-雙缺失毒株，通過建立可建立基于gC蛋白的ELISA檢測方法，可以達到鑒別野毒感染和疫苗接種的目的。但該疫苗免疫效果還有待進一步提高。

1.3 三基因缺失PRV疫苗

TK-/gE-/gI-三基因缺失苗：

我國學(xué)者郭萬柱等[10]于2003年首次以TK-單缺失株的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了TK-/gE-/gI-三基因缺失株，而且該母本毒株是我國主要的流行毒株，疫苗通過進一步的安全性評估、免疫保護試驗及進一步的臨床試驗證實該疫苗是一種安全性高、穩(wěn)定性強、免疫效果好的疫苗，并已獲新獸藥證書。

1.4 四基因缺失PRV疫苗

選擇更多基因的缺失，是大幅度降低PRV毒株的毒力的策略，而且可以有效降低疫苗的排毒率。

1.4.1 gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失苗

四基因缺失策略早在1990年國外學(xué)者已開展相關(guān)研究[11]，所構(gòu)建的gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失株，能有效提高對仔豬的免疫保護水平，而且并未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。

1.4.2 gD-/gE-/gI-/gG-四基因缺失苗

Mettenleiter等[12]在原有四缺苗的基礎(chǔ)上，將gC-置換為gD-，并基于已改造的gD-穩(wěn)定細胞系，成功構(gòu)建了gC-/gE-/gI-/gG-四基因缺失株，進一步試驗表明，該毒株的安全性顯著提高，而且可以顯著降低豬只的排毒水平。

2 小結(jié)與展望

動物疫苗研發(fā)從傳統(tǒng)疫苗向基因工程疫苗發(fā)展將是未來整個行業(yè)的趨勢，而且特別作為弱毒疫苗來說，標記疫苗更是解決如何區(qū)分野毒感染和疫苗接種的重要手段。而我國豬偽狂犬基因工程標記疫苗正是目前應(yīng)用最為成功的動物標記疫苗。對推動其他疫病基因工程標記疫苗的研發(fā)和推廣具有重大的指導(dǎo)意義。但該類疫苗仍然面臨毒力返強、排毒抑制不徹底等問題，但隨著我國動物疫苗研制水平的不斷提升，同時完善豬偽狂犬病的綜合防控體系，最終將實現(xiàn)我國根除該病的目標。

[1] An，T.Q.，Peng，J.M.，Tian，Z.J.，Zhao，H.Y.，Li，N.，Liu，Y.M.，Chen，J.Z.，Leng，C.L.，Sun，Y.，Chang，D.，Tong，G.Z.，2013.Pseudorabies virus variant in bartha-K61-vaccinated pigs，China[J].Emerg.Infect.Dis.，2012（19）：1749-1755.

[2] Wang，H.G.，Yang，D.Y.，Luo，X.F.，Zeng，Z.Y.，Li，C.Y.，Gan，Z.L.，Wang，F(xiàn).，Liu，J.，Hao，F(xiàn).，Research progress of mixed infections of classical swine fever and other diseases[J].Chin. Swine Indus，2013，（4）：56-58.

[3] Mettenleiter，T.C.，Lukacs，N.，Rziha，H.J.，Mapping of the structural gene of pseudorabies virus glycoprotein A and identification of two non-glycosylated precursor polypeptides[J].J.Virol.1985，（53）：52-57.

[4] 周復(fù)春，陳煥春，方六榮，等.偽狂犬病病毒鄂A株TK基因的克隆及其鑒定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，1999，（5）：417-420.

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[7] Van Oirschot J T，Terpstra C，Moormann R J M，et al.Safety of an Aujeszky's disease vaccine based on deletion mutant strain 783 which does not express thymidine kinase and glycoprotein I[J].Vet Rec，1990，127（10）：443-446.

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[10] 郭萬柱，徐志文，王小玉，等.新型偽狂犬病病毒基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究（初報）[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，18（1）：1-3.

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[12] Mettenleiter TC，Klupp BG，Weiland F，et al.Characterization of a quadruple glycoprotein deleted pseudorabies virus mutant for use as a biologically safe live virus vaccine[J].J Gen Virol，1994，75（7）：1723-1733.

2016年度江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項目“生豬偽狂犬病綜合凈化技術(shù)”（項目編號：SXGC[2016]160）

姚海飛（1987—），男，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)本科畢業(yè)，農(nóng)學(xué)學(xué)士，初級獸醫(yī)師，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，淮安市洪澤區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心實驗室負責(zé)人，主要從事動物疫病防控工作。