基于分子機制的逍遙散方證相關研究思路

嚴志祎 焦海燕 馬慶宇 李曉娟 潘秋霞 王亭曄 侯雅靜 王方方劉玥蕓 陳家旭 岳利峰

(1 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京，100029； 2 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700)

基于分子機制的逍遙散方證相關研究思路

嚴志祎1焦海燕1馬慶宇1李曉娟1潘秋霞1王亭曄1侯雅靜1王方方1劉玥蕓1陳家旭1岳利峰2

(1 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京，100029； 2 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京，100700)

逍遙散作為疏肝健脾的經(jīng)典方劑，在臨床上廣泛應用于治療各科疾病所涉及的肝郁脾虛證之中，長久以來也進行了大量關于逍遙散調(diào)節(jié)作用與肝郁脾虛證發(fā)病機制內(nèi)在聯(lián)系與規(guī)律的研究。文章從分子機制研究的側面著手，探討了逍遙散方證研究的思路，以期為今后包括逍遙散與肝郁脾虛證在內(nèi)的方證研究提供思路與方法。

肝郁脾虛證；逍遙散；方正相關；分子機制

在臨床與基礎研究中，逍遙散都被廣泛地運用于治療肝郁脾虛證，在運用現(xiàn)代研究手段研究逍遙散與肝郁脾虛證方證相關的理論之時，人們進行了大量的分子機制研究，但對于其方證相關科學內(nèi)涵的認識仍未清晰。因此，我們在本文試從分子生物學機制的角度，立足于逍遙散與肝郁脾虛證的方證研究，探討其研究思路與方法。

1 逍遙散方證研究的意義

方證體系首見于《傷寒論》，方證相關規(guī)律是一種復雜的對應規(guī)律，方劑本身作為一復雜系統(tǒng)干預了同樣復雜的人體系統(tǒng)，主要是關鍵病機層面上的對應，不同方藥干預不同的靶點，方證對應是保證臨床療效的關鍵[1]。方證相應是臨床與基礎研究中基本的指導思想，方證研究是探究方藥與病證之間的對應關系及其內(nèi)涵的研究領域，是以比較醫(yī)學為方法論基礎，以證的內(nèi)涵與方藥緊密關聯(lián)為邏輯基礎，以中醫(yī)辨證論治的經(jīng)驗為背景，以具有特定屬性的病證模型和特定組成的方藥為研究工具[2]，并且在西醫(yī)的病與中醫(yī)證的結合下，形成了病證結合的動物模型，為中醫(yī)證的研究提供現(xiàn)實有效的途徑[3]。方證研究離不開動物實驗和動物模型，基于方證相應原理，對成功的動物模型施以相應的方藥，在模型的制作中，證候與疾病的病因病機相結合，在符合中醫(yī)理論的同時，又能利用以西醫(yī)疾病模型為基礎，使中醫(yī)證的不確定因素在病的有效補充下變得更加清晰，貼近臨床實際，也能更準確地闡明證候本質(zhì)，以此研究微觀物質(zhì)分子的改變，這是探究分子水平的方證相關與內(nèi)在邏輯的根本。

逍遙散一方首見于《太平惠民和劑局方·卷九·治婦人諸疾》，具有疏肝解郁，健脾和營，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之功效，在早期多被用以“治婦人諸疾”，但隨著社會的發(fā)展和時代的變遷，郁證表現(xiàn)越來越復雜多樣，逍遙散的適應證越來越廣泛，不局限于婦科疾病，但大都具有肝郁脾虛這一共同病機，肝主疏泄、調(diào)暢氣機，肝臟是人體應激機制的調(diào)節(jié)中心[4]，同時脾的運化功能除了作用于消化系統(tǒng)外，還與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡密切相關[5]，機體許多系統(tǒng)功能的變化以及活性物質(zhì)的改變均與肝郁脾虛證有著密不可分的關系，這些都是逍遙散與肝郁脾虛證方證相關研究的基礎，對臨床方證對應的運用具有指導意義。因此，展開逍遙散與肝郁脾虛證相關的科學研究是方證相關研究的具體形式，體現(xiàn)了方證對應規(guī)律研究的思路與方法。

2 基于分子生物學機制對逍遙散方證研究的探索

2.1 逍遙散方證的相關性研究 逍遙散的調(diào)節(jié)機制以及肝郁脾虛證的發(fā)病機制是一個動態(tài)而復雜的過程，涉及其中的調(diào)節(jié)方式多種多樣。研究表明，逍遙散的治療作用與機體許多系統(tǒng)都有關聯(lián)，與大量的微觀物質(zhì)的變化具有相關性，主要是關于逍遙散與特定因素相關性的研究，這一因素可以是基因、蛋白、活性物質(zhì)、組織形態(tài)等等，比如某些物質(zhì)的表達水平與肝郁脾虛證的發(fā)生密切相關，以此為依據(jù)我們就可通過實驗，觀察逍遙散是否對其有干預作用。相關性研究在逍遙散方證研究中是最常見的一類，其研究主要在于探討逍遙散于肝郁脾虛證的調(diào)節(jié)作用與某一物質(zhì)的相關性，以研究其表達量的多寡或活性作為研究內(nèi)容，如調(diào)節(jié)慢性束縛應激肝郁脾虛證模型大鼠SP、VIP基因的表達而對肝郁脾虛證腦腸互動功能產(chǎn)生影響，調(diào)節(jié)慢性束縛應激大鼠下丘腦弓狀核神經(jīng)肽Y與瘦素受體，從而影響食欲與體重[6]，逍遙散能夠在上調(diào)慢性束縛應激大鼠前額皮質(zhì)與海馬CA1區(qū)BDNF的表達的同時下調(diào)TrkB與NT-3[7]，逍遙散通過下調(diào)GluR1 mRNA而上調(diào)GluR2 mRNA在海馬CA1區(qū)的表達影響海馬突觸可塑性[8]，還能夠通過上調(diào)海馬神經(jīng)元PSD-95與SYP的表達水平，逆轉慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠學習記憶功能的下降[9]，采用MTT法檢測慢性應激大鼠脾淋巴細胞活性，發(fā)現(xiàn)逍遙散可以明顯提高脾淋巴細胞活性，拮抗應激大鼠的免疫抑制狀態(tài)[10]，逍遙散還能能夠通過提高肝郁脾虛型慢性疲勞綜合征患者血中NK細胞活性和免疫球蛋白水平，以此提高機體免疫力發(fā)揮療效[11]，具有拮抗應激大鼠大鼠海馬突觸體內(nèi)Ca2+濃度與PKC活性升高的作用[12]，可通過調(diào)節(jié)中樞膽堿神經(jīng)遞質(zhì)活性和數(shù)量，以此對抗D-gal所致AD小鼠模型[13]，可通過抑制藍斑-去甲腎上腺素能神經(jīng)元的活性從而改善慢性束縛應激大鼠抑郁樣行為[14]，可通過調(diào)節(jié)能量代謝、氨基酸代謝、腸道微生物活性對CUMS模型大鼠起到治療作用[15]。

相關性的研究是以各類研究的手段將傳統(tǒng)醫(yī)學的方與證同現(xiàn)代醫(yī)學研究結合的第一步，通過觀察相關指標在肝郁脾虛證中的變化以及與逍遙散調(diào)節(jié)的聯(lián)系，闡釋方證相應的科學內(nèi)涵。

2.2 逍遙散方證相關性研究的拓展 在相關性研究之后，想要進一步研究逍遙散對肝郁脾虛證的干預作用，就不能只是簡單的觀察逍遙散直接或間接改變一些分子物質(zhì)的表達和活性的作用，而要探索分子改變與方證研究之間的深層關系，最常見的方法是探討與方證相關的分子功能所對應的信號通路或系統(tǒng)的改變，通常是以Western-blot等實驗方法檢測這一信號通路或系統(tǒng)的表達以及下游分子的表達或者活化狀態(tài)，以此證明逍遙散的作用與通路分子的表達具有一定關系。比如在進行逍遙散通過JAK/STAT信號通路改善應激與抑郁樣行為的研究中，為了說明逍遙散調(diào)控了JAK/STAT信號通路，通過ELISA檢測杏仁核中JAK/STAT信號通路下游分子TNF-α，gp130，total-Jak2，total-STAT3含量，以此證明了逍遙散與JAK/STAT信號通路分子的表達之間具有邏輯關聯(lián)[16]；又如有研究通過觀察逍遙散對慢性復合應激肝郁脾虛證模型小鼠下丘腦視上核與室旁核中Apelin與APJ受體的表達情況，證明了逍遙散的調(diào)節(jié)作用與Apelin/APJ生物系統(tǒng)功能的改變具有關聯(lián)性[17]；在關于逍遙散對肝郁脾虛模型大鼠海馬突觸可塑性調(diào)節(jié)作用的研究中，逍遙散對通路上NMDA受體、CaMKⅡ、Kalirin以及Rac1的表達具有調(diào)節(jié)作用，因而與NMDAR/CaMKⅡ/Kalirin/Rac通路的改變具有聯(lián)系[18]；在關于逍遙散對CNP/NPR-B系統(tǒng)調(diào)控作用的研究中，設置了高中低劑量的逍遙散實驗組，檢測直腸中CNP與NPR-B的表達水平，結果顯示逍遙散高與中劑量對CNP與NPR-B有上調(diào)的作用，證明了高中劑量逍遙散的調(diào)控與CNP/NPR-B系統(tǒng)變化的關系[19]。此外，在研究信號通路是否為逍遙散治療肝郁脾虛證的作用靶點的同時，論證信號通路與肝郁脾虛證發(fā)病機制之間的聯(lián)系，通常選取特定的阻斷劑，如在研究慢性束縛應激大鼠JAK通路改變與逍遙散調(diào)節(jié)作用的實驗中，運用了JAK通路阻斷劑SP600125，結果發(fā)現(xiàn)阻斷JAK通路能夠減輕大鼠的應激焦慮等表現(xiàn)，這就證明了JAK通路的改變與慢性束縛應激的發(fā)生機制具有關聯(lián)[20]。

通過將與方藥、證候之間具有相關性的分子物質(zhì)作為顏料，而后將相關的信號通路或生物系統(tǒng)的功能改變作為畫筆，通過不斷的研究和探索，力求繪制出方證對應生物學基礎的藍圖，是方證研究的一種思路，也為深入闡明肝郁脾虛證的生物學基礎與逍遙散的作用機制提供了研究思路。

2.3 逍遙散方證研究中的形態(tài)改變 在逍遙散方證的實驗研究中，對組織或細胞形態(tài)變化的觀察也是逍遙散分子機制研究的一類重要手段，如在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，運用不同濃度逍遙散制備的含藥血清能夠改變線粒體膜電位和游離Ca2+濃度，逆轉核破裂、核固縮等變化，以此有效的逆轉氧化應激誘導的海馬神經(jīng)元損傷[21]，慢性束縛應激導致肝郁脾虛證大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了細胞核變形、線粒體嵴模糊,突觸結構不清等變化，逍遙散可明顯改善這些超微結構的損傷[22]，多相性應激使大鼠海馬神經(jīng)元損傷導致神經(jīng)元內(nèi)Nissl體減少，逍遙散能通過抑制海馬神經(jīng)元細胞外Ca2+大量內(nèi)流,阻止Ca2+超載，以此改善應激對大鼠海馬神經(jīng)元造成的損傷及神經(jīng)元內(nèi)Nissl體的減少，從而改善應激大鼠的學習記憶狀況[23]，在關于肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞功能的實驗研究中，通過尼氏染色發(fā)現(xiàn)模型組神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，且前額皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)排列紊亂、缺失、損傷明顯、形態(tài)不規(guī)則、核邊界模糊、分布不均勻等病理表現(xiàn)，逍遙散可通過改善神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量等達到治療肝郁脾虛證的目的[24]。這類研究通過直觀的觀察組織與細胞形態(tài)的改變以及逍遙散的干預作用，為方證研究提供形態(tài)學上的依據(jù)，是分子水平逍遙散方證物質(zhì)基礎的有力補充，豐富了方證研究的內(nèi)容。

3 展望

方證對應是方與證之間的適配性或關聯(lián)性，方證相關表現(xiàn)為多個或某類方劑治療某一病證在不同程度上顯現(xiàn)療效，是作為藥物刺激與生物反應或方劑與機體密切相關的整體觀，也是中醫(yī)辨證論治中最具有特色的學術特征之一。辨證論治包括方證對應，而方證對應則是中醫(yī)辨證論治原則的體現(xiàn)，方劑的應用既是辨證論治的結果，也是遵循方證對應原則的體現(xiàn)。方證對應是對辨證論治模式的深化、簡化和具體化，可操作性更強，可以說辨證論治是一種最基本的臨床辨治方法，而辨方論治則是一種高級的、特殊的辨證方法[25]。因此，從方藥藥理作用來理解證候的科學內(nèi)涵，從證與方藥的不同角度相互補充，這對中醫(yī)證候的現(xiàn)代研究具有重要意義[26]。理法方藥的統(tǒng)一是保證臨床療效的關鍵，中藥復方是通過眾多作用環(huán)節(jié)和機制起到治療作用，是多組分、多途徑、多靶點的作用過程。方證相應研究以經(jīng)典方藥為切入點，借助現(xiàn)代科學技術盡可能全面的了解證候的物質(zhì)基礎和評價方藥的療效。由于復方多成分、多靶點及機制復雜的特點與證候的系統(tǒng)復雜性，方證研究中展開分子機制研究亟需更多更好的思路與方法，在合理運用基因組學、蛋白組學、代謝組學等技術的基礎上，展開微觀病理改變的多靶效應環(huán)節(jié)與中藥復方組分配伍作用機制的方證對應研究，并且采用系統(tǒng)生物學、系統(tǒng)工程理論等多學科知識進行跨領域多角度研究方證內(nèi)涵和物質(zhì)基礎，才能為臨床的診斷治療提供可靠依據(jù)。

本文以逍遙散與肝郁脾虛證方證研究中分子機制的研究為切入點，通過探討方證相關性研究，從分子表達、信號通路或生物系統(tǒng)的改變以及細胞或組織形態(tài)變化的實驗研究中探析了逍遙散與肝郁脾虛證方證研究的思路，希望能夠為今后的方證對應理論科學內(nèi)涵的實驗研究與設計提供參考。

[1]陳家旭.試論開展方證相關內(nèi)涵研究的意義[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2007，30(9):581-582.

[2]劉進娜，謝鳴.方證相關——中醫(yī)學探索的新領域[J].中醫(yī)雜志，2014，55(14):1193-1198.

[3]曹靈修，張林.方證關系研究思路簡[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，55(8):3166-3169.

[4]陳家旭，楊維益.神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡研究概況及其與中醫(yī)肝臟關系的探討[J].北京中醫(yī)藥大學學報，1995，18(4):7-12.

[5]陳家旭.中醫(yī)脾虛證的研究進展與展望[J].中醫(yī)藥導報，1998，4(8):14-16.

[6]Wang S X，Chen J X，Yue G X，et al.Xiaoyaosan Decoction Regulates Changes in Neuropeptide Y and Leptin Receptor in the Rat Arcuate Nucleus after Chronic Immobilization Stress[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine：eCAM，2012，2012(4):381278.

[7]Chen，Jx，W.X.Li，J.Yang.Effects of the Chinese traditional prescription Xiaoyaosan decoction on chronic immobilization stress-induced changes in behavior and brain BDNF，TrkB，and NT-3 in rats[J].Cellular and Molecular Neurobiology，2008:745-755.

[8]Liang Y，Guo X L，Chen J X，et al.Effects of the chinese traditional prescription xiaoyaosan decoction on chronic immobilization stress-induced changes in behavior and ultrastructure in rat hippocampus[J].Evidence-based complementary and alternative medicine：eCAM，2013，2013:984797.

[9]Meng Z Z，Chen J X，Jiang Y M，et al.Effect of Xiaoyaosan Decoction on Learning and Memory Deficit in Rats Induced by Chronic Immobilization Stress[J].Evidence-based complementary and alternative medicine：eCAM，2013，2013(17):297154.

[10]余浚龍，嚴燦.逍遙散對慢性應激大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].廣州醫(yī)藥，2004，35(6):56-57.

[11]時學英.逍遙散治療肝郁脾虛型慢性疲勞綜合征的療效及其對患者免疫功能的影響[J].浙江中醫(yī)雜志，2007，42(7):394-395.

[12]敖海清，徐志偉，嚴燦,等.逍遙散對應激大鼠海馬突觸體內(nèi)PKC活性及Ca2+濃度的影響[J].山東中醫(yī)雜志，2006，25(2):112-114.

[13]吳紅彥，王虎平.以肝脾論治老年性癡呆及逍遙散對老年癡呆模型小鼠學習記憶能力、中樞膽堿能神經(jīng)元活性的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16(5):190-192.

[14]Ding X F，Zhao X H，Tao Y，et al.Xiao Yao San Improves Depressive-Like Behaviors in Rats with Chronic Immobilization Stress through Modulation of Locus Coeruleus-Norepinephrine System[J].Evid Based Complement Alternat Med，2014，2014(6):902516.

[15]Gao X X，Cui J，Zheng X Y，et al.An investigation of the antidepressant action of xiaoyaosan in rats using ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry combined with metabonomics.[J].Phytotherapy Research，2013，27(7):1074-85.

[16]李曉娟，白曉暉，李娜,等.逍遙散對慢性束縛應激抑郁模型大鼠JAK/STAT信號通路的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2016，31(5):1700-1704.

[17]嚴志祎.肝郁脾虛證模型小鼠下丘腦Apdin/APJ受體的變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2016.

[18]劉群.慢性束縛應激肝郁脾虛證大鼠海馬NMDAR/CaMKⅡ/Kalirin/Rac通路的改變及逍遙散的調(diào)節(jié)作用[D].北京：北京中醫(yī)藥大學,2016.

[19]Li P，Tang X D，Cai Z X，et al.CNP signal pathway up-regulated in rectum of depressed rats and the interventional effect of Xiaoyaosan[J].World Journal of Gastroenterology Wjg，2015，21(5):1518.

[20]Hong-Bo Zhao，You-Ming Jiang，Xiao-Juan Li，et al.Xiao Yao San Improves the Anxiety-Like Behaviors of Rats Induced by Chronic Immobilization Stress：The Involvement of the JNK Signaling Pathway in the Hippocampus[J].Biol.Pharm.Bull，2017，40(2)：187-194.

[21]Zhen-zhi Meng，Jing-hong Hu，Jia-xu Chen，et al.Xiaoyaosan Decoction，a Traditional Chinese Medicine，Inhibits Oxidative-Stress-Induced Hippocampus Neuron Apoptosis In Vitro[J].Evidence-based Complementary and Alternative Medicine：eCAM，2012，2012(12):489254.

[22]梁媛，陳家旭，郭曉玲,等.逍遙散對肝郁脾虛證大鼠邊緣系統(tǒng)神經(jīng)元超微結構的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(5):577-581.

[23]徐志偉，敖海清，吳麗麗,等.逍遙散對慢性心理應激損傷大鼠海馬神經(jīng)元的影響[J].中藥藥理與臨床，2005，21(1):5-9.

[24]劉燕.肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞功能變化及逍遙散的調(diào)節(jié)機制[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學，2016.

[25]熊興江，王階，王師菡,等.方證對應理論研究概況[J].中華中醫(yī)藥雜志，2009，24(12):1624-1626.

[26]范穎.方證相關的系統(tǒng)論探討[J].中醫(yī)雜志，2005，46(4):249-250.

(2017-02-20收稿 責任編輯：洪志強)

Discussion on molecular mechanism in correlation between prescription and syndrome of Xiaoyaosan

Yan Zhiyi1, Jiao Haiyan1, Ma Qingyu1, Li Xiaojuan1, Pan Qiuxia1, Wang Tingye1, Hou Yajing1,Wang Fangfang1, Liu Yueyun1, Chen Jiaxu1, Yue Lifeng2

(1SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2DongzhimenHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Xiaoyaosan is the classic prescription of soothing the liver and invigorating the spleen, which is widely used in clinical departments, especially syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency. For long times, there is a lot of researches about the inner link between the regulating effect of Xiaoyaosan and the mechanism of syndrome of liver depression and spleen deficiency. This paper starts from the molecular mechanism, and discusses the thought in prescription and syndrome of Xiaoyaosan, hoping to provide the thinking and method to the study of prescription and syndrome including Xiaoyaosan and syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency.

Syndrome of stagnation of liver qi and spleen deficiency; Xiaoyaosan; Correlation between prescription and syndrome; Molecular mechanism

國家自然科學基金面上項目(編號：81473597)；國家自然科學基金重點項目(編號：81630104)；國家自然科學基金青年項目(編號：81302960)

陳家旭，男，教授，博士研究生導師，北京市朝陽區(qū)北三環(huán)東路11號北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院中醫(yī)診斷系83號信箱，郵編：100029，Tel：(010)64286656，E-mail：chenjx@bucm.edu.cn

R-331

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.002