大腸埃希菌耐藥機制的研究進展

虞春華，丁嵐，柯慧，馬嫚，高建華綜述，夏小明審校

(江西醫(yī)學高等?？茖W校病原生物教研室，江西上饒334000)

·綜述·

大腸埃希菌耐藥機制的研究進展

虞春華，丁嵐，柯慧，馬嫚，高建華綜述，夏小明審校

(江西醫(yī)學高等?？茖W校病原生物教研室，江西上饒334000)

大腸埃希菌是感染性腹瀉常見的病原菌，由于抗生素的濫用，使大腸埃希菌的耐藥性越來越嚴重，其耐藥譜也不斷發(fā)生變化，對臨床合理使用抗生素提出了更高和更為迫切的要求。本文就大腸埃希菌耐藥狀況及耐藥機制等方面的研究作一綜述。

大腸埃希菌；抗生素；耐藥機制

大腸埃希菌是存在于人類和動物腸道中的一類正常菌群，也是腸桿菌科埃希菌屬中最重要的細菌，當機體免疫力低下或菌侵入腸外組織或器官，可引起腸外感染。某些菌株具有毒力因子，能直接引起腸道感染。近些年，大腸埃希菌的耐藥株不斷增多，大腸埃希菌的耐藥性越來越嚴重，致病性大腸埃希菌特別是多重耐藥大腸埃希菌臨床監(jiān)測分離率也逐年升高，給感染性疾病的預防和治療帶來了現存的和潛在的危機，細菌耐藥已成為一個全球性問題。大腸埃希菌的耐藥性更是如此，且其耐藥譜在不斷發(fā)生變化，耐藥性產生的原因也是多方面的。如何合理使用抗生素，了解大腸埃希菌耐藥菌的產生機制，控制多重耐藥菌株的產生和傳播，已成為急需解決的問題。

1 大腸埃希菌的耐藥現狀

上世紀六十年代多重耐藥大腸埃希菌較少見，隨著抗生素的普遍應用和濫用，70年代開始出現多重耐藥菌且耐藥譜也不斷發(fā)生變化，不同地區(qū)不同時間出現的耐藥情況也不一樣。國內外相關研究表明，大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥性上升趨勢出現差異，其中對鏈霉素、復方磺胺、四環(huán)素、氨卞西林、壯觀霉素的耐藥率上升明顯[1]。臨床上多重耐藥菌株的檢出率也逐漸增加[2]，王會中等研究發(fā)現[3]大腸埃希菌除對亞胺培南和美羅培南耐藥率較低外，對哌拉西林／他唑巴坦的耐藥率也較低；大部分的多耐藥大腸埃希菌產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)，且多為CTX-M型[4]；翁幸鐾等[5]從尿液中分離出aac(6’)-I b基因新亞型的大腸埃希菌，楊大亮等[6]研究的178株耐藥性大腸埃希菌在急診科和泌尿科的分布為26.40%和21.91%，對氨芐西林的耐藥性為94.3%。2014年中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測結果顯示，腸桿菌科細菌大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌以及奇異變形桿菌中產ESBLs菌株的檢出率分別為55.8%、29.9%和24.0%，大腸埃希菌的檢出率最高。大腸埃希菌中產ESBLs株有所增多為55.8%對54.0%，同時大腸埃希菌對環(huán)丙沙星、慶大霉素、哌拉西林和磺胺的耐藥率均接近或高于50%，與往年相近，對3種碳青霉烯類的耐藥率仍然較低[7]。高明祥等[8]研究發(fā)現大腸埃希菌ESBLs陽性發(fā)生率達75.1%，故研究大腸埃希菌感染現狀，對控制耐藥菌株的蔓延及臨床合理用藥具有十分重要的意義。

2 大腸埃希菌的耐藥機制

細菌的耐藥機制復雜多樣，原因主要有：某些細菌天生就有或者通過自發(fā)突變產生耐藥基因；細菌通過質粒或轉位因子等將耐藥基因進行細菌間轉移。大腸埃希菌的耐藥機制主要表現為產生水解酶或鈍化酶水解或修飾抗菌藥物而使藥物失活；改變抗菌藥物的作用靶位；細菌細胞膜通透性改變（如孔蛋白減少、生物被膜的形成），減少了藥物的攝取和吸收；細菌主動外排功能的增強，使抗生素在菌體內達不到有效殺菌濃度及質粒介導的耐藥性等。大腸埃希菌對不同類抗生素的耐藥機制如下有下列幾類。

2.1 細菌對β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥機制產β-內酰胺酶是大腸埃希菌對β-內酰胺類抗生素耐藥的主要機制，Ambler根據酶分子結構的不同，將β-內酰胺酶分為A、B、C和D四類：A、C、和D類酶的活性位點是絲氨酸，B類活性結構為鋅，A和D類酶能被抑制劑所抑制。Bush K等[9]又將β-內酰胺酶分為四型。Ⅰ型為不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶，Ⅱ型能被抑制劑所抑制，Ⅲ型為不被抑制劑所抑制的金屬內酰胺酶，Ⅳ型為不被克拉維酸抑制的青霉素酶。以Ⅰ型和Ⅱ型尤為重要，Ⅰ型為染色體和質粒介導產生的頭孢菌素酶型（Ampicillin，AmpC）β-內酰胺酶，Ⅱ型是由質粒介導產生的超廣譜β-內酰胺酶（Extended-spectrum beta-lactamases，ESBLs）。目前在大腸埃希菌中發(fā)現的主要有超廣譜β-內酰胺酶、AmpC型酶和碳青霉烯酶金屬酶。AmpC酶是一種不被β-內酰胺酶抑制劑所抑制的水解酶，AmpC酶的出現使得臨床對革蘭陰性致病菌所能使用的抗生素范圍進一步縮小，該類酶主要作用于青霉素和第一、二、三代頭孢菌素，以及單環(huán)類抗生素，而第四代頭孢菌素及碳青霉烯類不受該酶作用。對β-內酰胺酶抗生素耐藥則主要是由質粒介導的超廣譜β-內酰胺酶所致，大腸埃希菌對β-內酰胺類抗生素耐藥主要是由ESBLs引起的。ESBLs是指由質粒介導的能賦予細菌水解頭孢菌素類、單酰胺類抗生素以及青霉素類藥物的一類β-內酰胺酶，根據基因同源性不同，ESBLs可分為五大類：TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型，其中TEM型酶（Temoniera）是最常見的質粒介導的酶，能使細菌對第一代和第二代頭孢菌素耐藥。CTX-M型酶是國內流行最廣泛的超廣譜β-內酰胺酶，迄今已發(fā)現64種，其主要分布于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，國內外相繼有各種基因檢測的報道，黃靖宇等[10]人研究顯示大腸埃希菌攜帶SHV、TEM、DHA-1、ACT-1耐藥基因比率較高，且臨床檢出的多重耐藥菌逐年升高。碳青霉烯酶是指所有能水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類藥物的一類β-內酰胺酶，分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶。A類碳青霉烯酶為絲氨酸酶，其作用機制是利用活性位點絲氨酸殘基滅活β-內酰胺類抗生素。B類碳青霉烯酶又稱金屬β-內酰胺酶，簡稱金屬酶，其作用機制是依賴于活性部位的鋅離子和β-內酰胺類藥物之間的相互作用。目前在大腸埃希菌屬已經發(fā)現的B類碳青霉烯酶有IMP、VIM、NDM 3種[11]。D類碳青霉烯酶也是一種絲氨酸蛋白酶，因其可以水解苯唑西林和氯唑西林，又稱為OXA類β-內酰胺酶。D類碳青霉烯酶可被克拉維酸和他唑巴坦抑制，但克拉維酸對其抑制作用差[12]。目前發(fā)現存在于大腸埃希菌屬的OXA酶包括OXA－1、OXA－2、OXA－48等。

碳青霉烯酶抗生素對大多數致病菌呈現強抗菌作用，故被認為是治療產ESBLs和AmpC酶菌株所致嚴重感染的優(yōu)選藥物之一。以往碳青霉烯類藥耐藥株多為銅綠假單胞菌等非發(fā)酵類細菌[13]，近年來有關大腸埃希菌耐碳青霉烯類藥物耐藥的報道也越來越多。胡麗慶等人研究報道2007－2009年，大腸埃希菌產ESBLs株對亞胺培南的耐藥率從0.2%上升至1.4%，對美羅培南的耐藥率從0%上升至0.9%，呈逐年上升趨勢[14]2016年胡志軍等人研究結果顯示大腸埃希菌耐碳青霉烯類藥物耐藥率達到1.7%[15]。

2.2 對氨基甙苷類抗生素的耐藥機制氨基甙苷類抗生素對各種革蘭氏陰性菌有強大殺菌作用，其殺菌譜廣，臨床常用的主要為丁胺卡那霉素阿米卡星、妥布霉素和慶大霉素等，但隨著氨基甙類抗生素在臨床上的廣泛使用，細菌對該類抗生素耐藥性不斷增加，不同地區(qū)不同時間內氨基糖苷類抗生素耐藥情況不盡相同。氨基甙類抗生素主要作用于細菌的核糖體，抑制細菌蛋白質合成，并破壞細菌細胞膜的完整性。大腸埃希菌對氨基甙類抗生素產生耐藥主要通過以下三方面：

⑴氨基苷甙類鈍化酶的產生。產生氨基甙苷類鈍化酶（aminoglycoside modifying enzyme，AMEs）是臨床菌株對氨基甙苷類抗生素產生耐藥性的最主要的原因。氨基甙苷類鈍化酶作用于特定的氨基或羥基，從而使藥物發(fā)生鈍化。該鈍化酶由質粒和染色體所編碼，通常由可移動DNA片段攜帶，質粒的交換和轉座子的轉座可使耐藥基因整合至敏感菌的遺傳物質上，而且這些酶的基因決定簇即使在沒有明顯遺傳關系的細菌種群間也能傳播。目前已發(fā)現的氨基甙苷類鈍化酶有30多個基因型。氨基甙苷類鈍化酶作用于抗生素特定的氨基或羥基后，抗生素與細菌核糖體結合不緊密而不能進入下一階段發(fā)揮抗菌作用，從而使細菌在抗生素存在的情況下仍能存活[16]。不同的氨基甙類抗生素可為同一種酶所鈍化，而同一種抗生素又可為多種酶所鈍化，這是因為一種抗生素的分子結構中可能存在多個結合位點之故，所以不同地區(qū)和不同時間氨基甙苷類耐藥菌的耐藥機制有很大差異。

⑵作用靶位的改變。細菌與抗菌藥物結合的有效部位發(fā)生變異，從而降低了細菌對抗菌藥物的敏感性而產生耐藥。細菌通過產生誘導酶對菌體（即抗菌藥物的作用靶位）進行化學修飾，或通過基因突變造成而至靶位變異導致耐藥。氨基糖苷類抗生素的結合點在核糖體上，而核糖體是編碼蛋白質的中樞，是受細胞自身的嚴格保護的。通過改變作用靶位，使抗生素進入細菌后不能與之結合而發(fā)揮作用，這種情況較少見。但rRNA特定的突變是造成氨基甙苷類鈍化酶耐藥性的一個重要原因[17]。王會中等人[18]研究發(fā)現導致大腸埃希菌對氨基甙苷類抗生素耐藥的機制主要是產生16S rRNA甲基化酶(Anna或RmtB)。

⑶細胞壁通透性改變或細胞內轉運異常。這種情況導致藥物攝取與積累的減少，從而使細菌耐藥。

2.3 對喹諾酮類抗生素的耐藥機制喹諾酮類藥物是近30年來發(fā)展十分迅速的一類抗菌藥物，目前已經發(fā)展到第四代，因其抗菌譜廣、抗菌活性強、使用方便和劑型較多等優(yōu)點，在國內外臨床控制感染性疾病中已普遍應用。與此同時，細菌對此類藥物的耐藥性也呈蔓延趨勢。2004至2005年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網監(jiān)測結果顯示，大腸埃希菌對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為56.7%、64.9%；2011至2012年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網監(jiān)測結果顯示，大腸埃希菌對左氧氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥率分別為61.6%、65.7%。在我國臨床分離的大腸埃希菌對喹諾酮類抗生素的耐藥率處于全球前列[19]。大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制主要為染色體介導和質粒介導[20]，細菌對喹諾酮類藥物耐藥的機制主要有以下三方面：

⑴藥物作用靶位的結構基因突變致DNA促旋酶（gyrase，gyr）和拓撲異構酶Ⅳ（topoisomerase）突變。喹諾酮類抗生素主要作用于DNA促旋酶和拓撲異構酶，細菌對喹諾酮類藥物的耐藥性機制主要是細菌染色體基因突變，導致藥物作用靶位DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ的結構和構象發(fā)生變化，使藥物不能與酶和DNA復合物穩(wěn)定結合。DNA促旋酶為喹諾酮類抗革蘭陰性菌的第一靶位，DNA促旋酶A亞單位變異是細菌產生耐藥的主要原因。茆海豐等人研究[21]結果顯示62株大腸埃希菌中有36株發(fā)生gyrA基因變異，parC基因突變共42株，所有gyrA基因的變異均同時發(fā)生parC基因突變。

⑵細菌細胞膜通透性改變。喹諾酮類藥物必須進入菌體內才會發(fā)揮抗菌作用，藥物到達靶位需經細胞外膜。革蘭陰性菌的外膜是抵御外來毒物的有效屏障，這種屏障作用與外膜的孔蛋白和脂多糖有關。細胞膜通透性改變后，如孔蛋白的缺失和突變，外膜通透性下降就會阻礙抗生素進入細菌內膜，從而導致細菌產生耐藥。

⑶控制細菌主動外排系統(tǒng)的調控基因突變導致主動外排增強。當泵系統(tǒng)的基因被激活，細菌外排藥物的功能就增強。

2.4 對磺胺和甲氧芐氨嘧啶的耐藥機制二氫葉酸合成酶（dihydropteroate synthase，DHPS）和二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是細菌葉酸生物合成途徑中重要的酶?；前房膳c化學結構相似的對氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，使二氫葉酸合成減少，甲氧芐氨嘧啶則與二氫葉酸還原酶相互作用，使四氫葉酸的生成受阻，抑制細菌的生長繁殖。臨床上甲氧芐氨嘧啶與磺胺的聯(lián)合應用可使細菌的葉酸代謝雙重受阻，增強抗菌作用。自1968年兩種藥物廣泛聯(lián)用以來，到20世紀70年代中，在臨床上相繼出現了耐藥現象，細菌編碼二氫葉酸合成酶的耐藥基因有三種，sul1、sul2和sul3。耐甲氧芐氨嘧啶基因（dihydrofolate reductase，dfr）目前已檢測到30多種，這兩類基因大多位于Ⅰ類整合子上。對于dfr基因可分為1型和2型或dfrA和dfrB[22]。王偉等[23]研究發(fā)現臨床分離的大腸埃希菌攜帶有sul1、dfrA1、dfrA17基因。

綜上所述，大腸埃希菌耐藥機制復雜，且多種耐藥機制可協(xié)同作用，造成耐藥水平高及多重耐藥的現象。臨床上耐藥性大腸埃希菌的感染，特別是多重耐藥現象日趨嚴重，正確選用抗生素是治療的關鍵，也是防止耐藥菌株蔓延的關鍵。對大腸埃希菌的耐藥性監(jiān)測需要加強，同時合理使用抗生素，努力消除細菌的耐藥性，是當前防治工作中急需解決的問題。

[1]?？∪?，王凌峰．大腸埃希菌耐藥機制研究進展[J].中國保健營養(yǎng)，2014，5：2898．

[2]Xjao YH，Giske CG，et al．EpidemioFogy and chamctexisficsof antimicrobial resistance in China[J]．Drug Resist Updat，2011，14：236-250．

[3]王會中，沙杭等.137株多耐藥大腸埃希菌表型及耐藥機制研究[J].中華流行病學雜志，2012，33(12)：12.

[4]潘玫，李穩(wěn).產超廣譜β－內酰胺酶大腸埃希菌耐藥特征及基因分型[J].中國感染與化療雜志，2013，13（2）：132－134．

[5]翁幸鐾，糜祖煌．從尿液中分離出aac(6’)-I b基因新亞型的大腸埃希菌[J]．中華檢驗醫(yī)學雜志，2010，33（2）：149－151．

[6]楊大亮，馮豐湊.178株耐藥性大腸埃希菌的感染現狀及耐藥性分析[J].中國實用醫(yī)藥，2013，8(10)：152．

[7]胡付品，朱德妹，汪復，等.2014年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志，2015，15（5）：401－406．

[8]高明祥，江麗霞，易金萍.289株大腸埃希菌的臨床分布和耐藥性分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學，2013，31(6)：637-638.

[9]Bush K，Jacoby GA，Medeiros AA．A functional classfication scheme for beta-lactamases and its correlation withmolecular structure[J]．Antimicrob Agents Chemother，1995，39(6)：1211．

[10]黃靖宇，黃華，方威，等.產ESBLs與AmpC酶腸桿菌科細菌表型檢測及基因型分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2015，25（23）：4101-4103．

[11]林曉偉，徐濤濤，呂火烊.產碳青霉烯酶大腸埃希菌的耐藥機制研究進展[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志2015，25(10)：1489－1492．

[12]Bhattacharjee A，Sen M R，Anupurba S，et al．Detection of OXA－2 group extended－spectrum－β－lactamase－producing clinical isolatesof Escherichia coli from India[J]．J Antimicrob Chemother，2007，60(3)：703－704．

[13]魏麗華，余蘭．腸桿菌科細菌產碳青霉烯酶研究進展[J]．醫(yī)學信息，2011，24(5)：1464－1466．

[14]胡麗慶，呂火祥，孫定河，等．2007－2009年大腸埃希菌產ESBLs株分離率及對碳青霉烯類藥物的耐藥性變遷[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2011，21(15)：3258－3260．

[15]胡志軍，唐吉斌，吳希靜，等.碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌出現后的大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測[J]．中國衛(wèi)生檢驗雜志，2016，26 (16)：2412－2415．

[16]Llano-Sotelo B，Azucena EF Jr，Kotra LP，et al.Aminoglycosides modified by resistance enzymes display diminished binding to the bacterial ribosomal aminoacyl tRNA site[J]．Chem Biol，2002，9(4)：455-463.

[17]Honore N，Marchal C，Cole S.Novel mutation in 16srRNA associated with streptomycin dependence in Mycobacterium tuberculosis，Antimicrob Agents Chemoher，1995，39：769-770.

[18]王會中，沙杭，陳倩，等．137株多耐藥大腸埃希菌表型及耐藥機制研究[J]．中華流行病學雜志，2012，33（12）：1277－1278．

[19]劉云寧，李小鳳，韓旭穎，等.大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制的研究進展[J]．河北醫(yī)藥，2015，37（2）：265.

[20]Han JH，Nachamkin I，Tolomeo P，et al．Temporal changes in resistance mechanisms in colonizing Escherichia coli isolates with reduced susceptibility to fluoroquinolones[J]．Diagn Micr Infec Dis，2013，76：491-496.

[21]茆海豐，劉洪書，趙勇，等．大腸埃希菌對喹諾酮類抗菌藥物耐藥機制研究[J]．中華醫(yī)院感染學雜志，2015，15：3375－3377．15汪復．抗菌藥物作用機制和細菌耐藥性[M].//聞玉梅主編．精編現代醫(yī)學微生物學．上海；復旦大學出版社，2002：306～307．

[22]16 White PA and Rawlinson WD.Current status of the aadA and dfr gene cassette families[J]．J Antimicrob Chemother，2001，47：495-496.

[23]王偉，糜祖煌，毛劍峰，等.大腸埃希茵連續(xù)分離株耐藥表型及復方磺胺甲噁唑耐藥相關基因研究[J].中國抗生索雜，2008，33（12）：731.

R446.5，Q939.92

A

1674-1129(2017)02-0215-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.02.024

2016-09-06；

2016-12-27)

江西省教育廳科學技術研究項目，編號：151344

虞春華，女，1975年生，醫(yī)學碩士，副主任技師，微生物專業(yè)，研究方向腸道桿菌的耐藥性。

夏小明，男，1963年生，主任醫(yī)師，研究方向為細菌的耐藥性研究。