肝纖維化動物模型的研究進展

馮天航，姚豫桐，黃孝倫△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽胰脾外科細胞移植中心，四川 成都 610072)

△通訊作者

肝纖維化動物模型的研究進展

馮天航1，姚豫桐2，黃孝倫2△

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院肝膽胰脾外科細胞移植中心，四川 成都 610072)

肝纖維化是各種因素引起慢性肝臟損傷的一種“損傷修復(fù)”慢性進展性病理過程，是向肝硬化發(fā)展的過渡環(huán)節(jié)也是欲阻斷纖維化繼續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文根據(jù)肝纖維化動物模型制備的機制、途徑、效果以及優(yōu)缺點的等方面進行綜述，為不同研究方向選擇肝纖維化動物模型提供參考。

肝纖維化；動物模型；化學(xué)性肝纖維化法；酒精性肝纖維化法；免疫性肝纖維化法；膽管阻塞性肝纖維化法；復(fù)合因素性肝纖維化法

當(dāng)藥物、免疫、基因等多種因素引起肝臟組織受損后，肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)(ECM)合成降解動態(tài)平穩(wěn)失調(diào)引起肝細胞變性、壞死、增生，肝纖維結(jié)締組織增生、沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生異常改變，稱為肝纖維化。此病理過程具有全身性、序貫性的特點[1]。目前臨床普遍認為肝纖維化是慢性肝臟疾病發(fā)展為肝硬化、惡變?yōu)楦伟┑谋亟?jīng)過程，并且是肝病治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。因此肝病權(quán)威專家Hans Popper教授曾提出“誰能阻止或延緩肝纖維化的發(fā)生，誰就將治愈大多數(shù)慢性肝病”這一說法[3，4]。為了深入探討肝纖維化的發(fā)病機制及其病理生理過程，尋找治療有效藥物和方法，國內(nèi)外學(xué)者們建立了一系列比較成熟、穩(wěn)定且重復(fù)性和成功率可靠的肝纖維化動物模型制備方法。目前應(yīng)用比較廣泛的肝纖維化動物模型有化學(xué)性肝纖維化模型、酒精性肝纖維化模型、免疫性肝纖維化模型、膽管阻塞性肝纖維化模型和復(fù)合因素性肝纖維化模型等。本文就不同類型的肝纖維化動物模型，對其制備的機制、途徑、效果以及優(yōu)缺點等方面綜述如下。

1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)肝纖維化動物模型

目前以化學(xué)藥物誘導(dǎo)的動物肝纖維化模型的常用藥物有：四氯化碳(CCl4)、 二甲基亞硝胺(DNM)、 D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)和硫代乙酰胺(TAA)等。

1.1CCl4法CCl4法是目前應(yīng)用最廣泛的肝纖維化造模方法。CCl4致肝硬化的主要機制為：肝細胞吸收CCl4后產(chǎn)生CCL3自由基導(dǎo)致肝細胞膜物質(zhì)脂質(zhì)過氧化，破壞肝細胞功能，肝臟內(nèi)脂蛋白合成過程受影響，狄氏間隙內(nèi)貯脂細胞活化引起肝內(nèi)脂肪聚集使線粒體受損，脂肪代謝障礙，同時肝細胞釋放出IV型膠原酶降解IV型膠原，加重肝細胞脂肪變性。經(jīng)試驗觀察，長期給予CCL4持續(xù)刺激成纖維細胞大量表達I型膠原基因，從而使I型膠原合成增多，取代IV型膠原促使肝臟纖維化。整個過程中的免疫/炎癥反應(yīng)和肝細胞變性、壞死常于纖維化前發(fā)生[5]。

CCL4法造模途徑有：腹腔注射法、皮下注射法和灌胃法等，并且輔以低蛋白、高脂肪食物及乙醇飲料共同作為飲食控制條件，可增加各種動物對CCL4的敏感性，縮短建模周期[6]。由于給藥途徑、劑量及時間不同，模型建成的周期為6～18周。丁可應(yīng)用400 ml/L CCL4溶液以1 ml/kg每周兩次注射食蟹猴，于16周成功建立肝纖維化模型，成功率約75%[7]。另有實驗研究予大鼠以CCL4皮下注射，配合高脂低蛋白飲食6周建立肝纖維化模型[8]。

CCL4法誘導(dǎo)的動物肝纖維化模型與人類肝纖維化相似度高，病理生理和形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)一致，均有肝細胞壞死后再生。具有造模相對容易、廉價及周期短的特點。但是此方法動物死亡率高、個體差異大，并且模型在停藥后有逆轉(zhuǎn)傾向。

1.2DNM法DMN是一種具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性的藥物。其造成肝硬化的機制主要是通過進入體內(nèi)后生成乙醛通過肝微粒體代謝引起肝細胞損害，同時，由于活性代謝產(chǎn)物促進甲基化反應(yīng)，使核酸、蛋白質(zhì)等重要物質(zhì)發(fā)生性變，引起肝細胞變性壞死并且細胞外基質(zhì)進行性增加，從而形成肝纖維化[9]。

DMN法給藥途徑以腹腔注射為主[10]。成模時間根據(jù)給藥劑量、給藥濃度的不同，一般造模周期為4～6周。DMN法相比于CCl4法誘導(dǎo)模型造模時間更短、死亡率更低、模型更穩(wěn)定。其最主要特點是可造成門脈高壓，病理生理、形態(tài)學(xué)上與人類早期肝硬化改變相似，有助于研究門脈高壓和肝硬化的發(fā)生機制和治療手段。但此方法缺陷在于大劑量DMN易引起肝細胞壞死性出血，控制肝臟纖維化程度的難度增加，而且DMN是致癌物質(zhì)、常溫易揮發(fā)，且動物排泄物中含有毒物，污染環(huán)境，對實驗者和實驗室條件要求較高。

1.3D-GalN法D-GALN屬于間接肝毒劑，其進入體內(nèi)后與肝細胞內(nèi)尿苷二磷酸(UDP)結(jié)合形成復(fù)合物，消耗核苷三磷酸(NTP)，使肝細胞中的核苷酸(RNA)與蛋白質(zhì)合成受阻，同時能產(chǎn)生自由基及脂質(zhì)過氧化物，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)肝細胞壞死，從而啟動細胞的“創(chuàng)傷修復(fù)”形成肝纖維化[11]。

D-GalN法經(jīng)皮下、腹腔和靜脈注射給藥均可。一次性腹腔給藥后24～48小時即可以形成急性肝損傷模型[12]。D-GalN法形成的肝纖維化與人類急性病毒性肝炎的肝臟病變相似度高，其病理學(xué)特點是似小結(jié)節(jié)性，可見再生肝細胞團，外包裹多層網(wǎng)狀纖維，結(jié)締組織和膠原及彈性纖維形成，另外其生化、組織學(xué)特征接近于人，重復(fù)性好，對觀察、預(yù)防肝纖維化、急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展具有較高研究價值。雖然D-GalN僅損害肝臟，不對其他器官造成影響，但因藥物價格高昂，未能在實驗中普及。

1.4TAA法TAA具有致癌性，其進入體內(nèi)后在細胞色素P450介導(dǎo)下發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生自由基和活性化合物等物質(zhì)，隨后參與肝內(nèi)物質(zhì)結(jié)合，延長肝細胞有絲分裂過程，妨礙RNA從胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，影響依賴酶代謝過程，從而導(dǎo)致肝細胞壞死、再生結(jié)節(jié)形成、毛細膽管增生，形成纖維隔及門靜脈高壓，進而導(dǎo)致肝硬化[13]。

大鼠皮下注射TAA 6～8周后可見肝臟內(nèi)形成明顯的假小葉[14]。TAA法在血流動力學(xué)、形態(tài)學(xué)及生化代謝改變均與人肝纖維化相似度高，且與病毒性肝炎引起的肝硬化相似。此法相對于CCL4法和DMN法，成模時間更短，死亡率更低并且穩(wěn)定性更優(yōu)，操作簡單易控，重復(fù)性強，但與DMN法有相同的弊端——其具有致癌性、易揮發(fā)性、毒性大、體內(nèi)代謝時間長和易污染環(huán)境的特點。

目前除了上述常用化學(xué)方法制備的肝纖維化模型，還有實驗者使用異煙肼和利福平聯(lián)用制備肝纖維化動物模型取得了較好的實驗結(jié)果。[15]另外有文獻報道利用甲氨蝶呤腹腔注射法成功復(fù)制出肝纖維化動物模型[16]。

2 酒精性肝纖維化動物模型

乙醇會引起肝臟的三種損傷變化：脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化。但是目前酒精對肝損傷的機制尚未完全明確，普遍認為其發(fā)生機制是多方面因素共同作用的結(jié)果——氧化應(yīng)激、免疫/炎癥反應(yīng)、線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損等[17]。首先，乙醇在肝臟經(jīng)過氧化代謝，通過乙醇脫氫酶(ADH)和微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(MEOS)進行，最終產(chǎn)生乙醛。乙醛通過影響三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致脂肪代謝異常，造成脂肪堆積、壞死，同時激活“創(chuàng)傷修復(fù)”過程，刺激貯脂細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞，并合成分泌大量膠原沉積，引起肝纖維化。其次，因乙醇易造成營養(yǎng)不良，是導(dǎo)致肝細胞的壞死因素之一，進一步加重了肝纖維化。

6月上旬柑橘產(chǎn)量與日照時數(shù)呈顯著負相關(guān)。光照是柑橘生長發(fā)育最根本的條件，在適宜范圍內(nèi)，隨光照時數(shù)、強度的增加，光能利用率高，柑橘生長健壯、枝葉充實，花芽分化良好，產(chǎn)量高、品質(zhì)佳。當(dāng)陽光過強，不利于柑橘生長，會引起日灼［12］。6月柑橘處于第二次生理落果和幼果膨大期，陽光直射果實、枝干和樹葉，使其表面溫度達到45℃以上并持續(xù)較長時間，即可引起灼傷，影響產(chǎn)量和品質(zhì)［7］。

乙醇法的給藥途徑主要靠灌胃或稀釋后加入飲用水中，相比之下后者安全性更高，避免了灌胃操作中誤插氣管的可能，因方法與劑量選擇上的不同，成模需要10～16周[18]。其模型病理特點與人的酒精性肝病相似，肝細胞脂肪變性、壞死嚴重以及炎細胞的浸潤，可見明顯的橋接壞死改變。因此法與人類酒精性肝病相似，可以很好地用于人類酒精性肝纖維化的研究。此法死亡率低且成本也較為低廉，并且灌胃法可確保每只大鼠的酒精攝入量符合實驗要求，造模穩(wěn)定性高。但是其容易出現(xiàn)厭食、消瘦等全身不良反應(yīng)，相比前述方法需要更長的周期才能成功建立模型。

3 免疫性肝纖維化法動物模型

免疫性肝纖維化法造模也是實驗室較為常用的造模方法，目前建立免疫性肝纖維化模型比較成熟的方法有：異種血液制品法、刀豆素蛋白A法及血吸蟲感染法等。

3.1異種血液制品法異種血液制品法總共分為兩大類，一類是異種血清，另一類是異種血清白蛋白，二者在作用機制上相似，均是以豬血清、牛血清、人血白蛋白等作為抗原[19]，注射到動物體內(nèi)，刺激動物體內(nèi)產(chǎn)生抗體，激活抗原抗體反應(yīng)，最終發(fā)生免疫復(fù)合物沉積，該反應(yīng)屬于Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)。復(fù)合物主要沉積在門脈匯管區(qū)，引起周圍血管局部炎癥，激活靜止的貯脂細胞轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，其反應(yīng)過程類似于CCL4法——細胞外基質(zhì)均是以降解IV型膠原、分泌I 型膠原蛋白為主要作用，最終形成纖維化。

異種血液制品注射法經(jīng)靜脈注射或腹腔注射給藥均可，但由于反復(fù)靜脈注射易造成動物的靜脈炎，因此常以后者為主。無論選擇血清制品或白蛋白制品建立模型的周期均為8周左右[20]。該模型在病理生理上更符合人類慢性肝纖維化形成的過程，血清及肝組織局部TGF-β1含量較少，竇狀隙毛細血管化較明顯[21，22]。該模型適合于研究由慢性肝炎或免疫性肝病引起的肝纖維化方面的問題。該類模型個體差異較大、建立模型周期長、由于過敏反應(yīng)死亡率也較高，但該模型復(fù)制性好、穩(wěn)定性強，故在實驗室可有選擇性的使用。

3.2刀豆素蛋白A法(ConcanavalinA，ConA) ConA誘導(dǎo)的肝纖維動物模型主要作用機制為：ConA是T細胞的有絲分裂原，T細胞可以被ConA激活而分泌多種細胞因子，引起肝組織的特異性損傷，繼而發(fā)生炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為肝細胞周圍產(chǎn)生以CD4+T細胞為主的大量淋巴細胞浸潤[23]。免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加重了肝臟的損傷促使了肝纖維化的形成。Con A法的常用給藥途徑是靜脈注射，建立模型的周期為8周左右[24]。該模型在發(fā)病機制上的特點與異種血清制品法接近，病理過程中肝細胞受損不嚴重，炎癥反應(yīng)引起膠原沉積為其主要表現(xiàn)，在病理形態(tài)學(xué)上可見肝小葉結(jié)構(gòu)改變，同時可見點狀壞死、片狀壞死，周圍炎性細胞浸潤，適合予以研究肝纖維化免疫疾病、吞噬細胞、Ito細胞及自身免疫性肝病等方面問題[25]。該法操作簡便、成功率高、穩(wěn)定性好不易逆轉(zhuǎn)。

3.3血吸蟲感染法血吸蟲感染法是由血吸蟲蟲卵誘導(dǎo)肝纖維化形成，蟲卵進入體內(nèi)后依次阻塞肝內(nèi)門靜脈、門靜脈周圍側(cè)枝循環(huán)；同時蟲卵形成的肉芽腫分泌細胞刺激因子，刺激成纖維細胞增殖，導(dǎo)致膠原成積引起肝纖維化[26]。血吸蟲感染法是通過表皮感染血吸蟲尾蚴，進而發(fā)生上述過程。模型建立周期尚需13周左右。鑒于模型形成的特殊性，該方法僅對我國血吸蟲疫區(qū)人肝纖維化的發(fā)生有重要的研究和防治指導(dǎo)意義，但該模型不僅存在自身的局限性，還可能對實驗人員發(fā)生感染、產(chǎn)生實驗環(huán)境污染等問題，因此應(yīng)用較為受限。

4 膽管阻塞性肝纖維化法(BCM)動物模型

BCM模型經(jīng)人為造成肝外膽管阻塞，進而形成肝纖維化。主要有單純結(jié)扎肝外膽管法、膽管結(jié)扎后切斷法和逆行性注入N-丁基-2-氰基丙烯酸鹽法三種方式[27～29]，引起梗阻以上部位的膽管阻塞，以致膽汁淤積、膽道壓力升高、肝細胞外環(huán)境改變，引起肝細胞缺血、變性和壞死，纖維組織增生，繼而演變成肝纖維化。

BCM法建立形成的肝纖維化模型接近于臨床上的膽汁淤積性肝纖維化，此模型的建立周期為5天[30]，其優(yōu)點為接近臨床淤積性肝纖維化表現(xiàn)、建立模型周期短、穩(wěn)定性高、無毒和不易自發(fā)逆轉(zhuǎn)，但缺點也較明顯：模型死亡率高，手術(shù)復(fù)雜并且模型長期存活率較低。綜上，該模型更適于研究門脈高壓性肝纖維化和膽汁淤積性肝纖維化等急性反應(yīng)方面的相關(guān)問題。

5 復(fù)合因素性肝纖維化動物模型

上述方法都是單因素形成模型，有不同的形成機制，制作的難易程度也不同，適用于不同的研究類型，所以研究者們可根據(jù)自己的模型需要，組合各種因素，以更安全的流程、更短的模型建立周期、更精準的獲得理想動物模型。這種結(jié)合多種因素方法對動物進行肝纖維化模型建立的方法稱之為復(fù)合因素方法。悉尼大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院Le Couteur教授先用苯巴比妥誘導(dǎo)肝酶作用于肝臟，于2周后加用CCl4注射建立肝纖維化模型，并發(fā)表在藥理學(xué)及實驗治療學(xué)雜志[31]。在著名雜志臨床研究學(xué)雜志中，Tsukamoto應(yīng)用了乙醇法的基礎(chǔ)上配合含鐵劑的飲食[32]。

綜上所述，中國病毒性肝炎感染者數(shù)量仍十分龐大，根據(jù)傳染病報告系統(tǒng)數(shù)據(jù)，僅2016年11月1日0時至11月30日24時病毒性肝炎感染者發(fā)病數(shù)約12萬人，其中乙型病毒性肝炎者占9萬人[33，34]。酒精肝、脂肪肝等發(fā)病率隨著中國人生活質(zhì)量提高、肥胖人群的增加而猛增，有超過病毒性肝炎發(fā)病率的趨勢，都有可能發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。因此對肝纖維化的研究迫在眉睫，而前提是需要建立理想的肝纖維化動物模型，這不僅要追求模型的產(chǎn)生與人類肝纖維化的發(fā)生在機制、病理學(xué)、血流動力學(xué)和生化等多個方面的相似，還需要該模型成功率高、穩(wěn)定性強、周期短、安全性強以及操作簡便、經(jīng)濟等優(yōu)勢。目前尚無符合以上所有理想要求的肝纖維化模型制作技術(shù)，僅能根據(jù)各個模型的建立方法不一、發(fā)生機制不同、特點各異，結(jié)合實驗的研究目的選擇不同的模型建立方法，以盡量滿足實驗需求。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)和推動，給研究者們指出了一個全新的方向——使用高脂飼料聯(lián)合乙醇及CCL4復(fù)合方法建立更接近人類臨床的肝纖維化模型以及建立由病毒引起的靈長類肝纖維化模型以研究人類肝纖維化的形成，為進一步研究肝纖維化的有效干預(yù)措施提供支持。

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Progress on animal model of hepatic fibrosis

FENG Tian-hang1，YAO Yu-tong2，HUANG Xiao-lun2

R575

B

1672-6170(2017)05-0256-04

2017-02-20；

2017-05-24)