嗅覺通路神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展

黃 莉，樊建剛，韓 亮，馮 勇△

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頭頸外科，b.科技部，四川 成都 610072)

嗅覺通路神經(jīng)干細(xì)胞研究進(jìn)展

黃 莉a，樊建剛a，韓 亮b，馮 勇a△

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.耳鼻咽喉頭頸外科，b.科技部，四川 成都 610072)

干細(xì)胞是能自我更新增殖和分化的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型和自身相同的子細(xì)胞，同時(shí)還能分化為祖細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞指來自神經(jīng)系統(tǒng)并可以經(jīng)過自我更新或者不對(duì)稱分裂，產(chǎn)生除自身以外的其它細(xì)胞，可向特定類型的神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化[1]。研究發(fā)現(xiàn)，從發(fā)育中甚至成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中，可以分離出具有多潛能干細(xì)胞，并能在體外培養(yǎng)成永生的神經(jīng)祖細(xì)胞系，這有望成為合適的體外轉(zhuǎn)基因載體之一，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性、創(chuàng)傷性和退行性疾病的治療提供新策略。

神經(jīng)干細(xì)胞；嗅上皮；嗅球；嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞

哺乳動(dòng)物嗅通路中的嗅上皮和嗅球中也存在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)，嗅上皮和嗅球NSCs的生物學(xué)特性已是神經(jīng)科學(xué)研究的重點(diǎn)方向。本文對(duì)嗅上皮和嗅球NSCs的解剖生理來源及特性進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述，為研究嗅上皮和嗅球NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天性、創(chuàng)傷性和退行性疾病奠定理論基礎(chǔ)。

1 嗅上皮NSCs的來源

脊椎動(dòng)物的嗅感覺神經(jīng)細(xì)胞(olfactory receptor neuron，ORN)可終生再生，新生的ORN由NSCs分化而來。嗅上皮最頂端為支持細(xì)胞，其下方為ORN，NSCs分布在嗅上皮基底層。從形態(tài)學(xué)劃分，成年小鼠嗅上皮NSCs分為球狀基底細(xì)胞(global basal cells，GBCs)和水平狀基底細(xì)胞(horizontal basal cells，HBCs)，其中HBCs緊貼在基底膜上，而GBCs位于HBCs上方。研究發(fā)現(xiàn)，通常ORN的再生由GBCs完成，外源性轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-B(TGF-B)及血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)等可通過程序性調(diào)控誘導(dǎo)GBCs向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化；只有在嗅上皮嚴(yán)重受損情況下，HBCs才活化增殖，并最終分化為嗅上皮的各種細(xì)胞成分[2]。

在基底細(xì)胞分裂慢速階段，基底細(xì)胞分裂產(chǎn)生另一個(gè)位于基底膜附近的干細(xì)胞和一個(gè)神經(jīng)前體細(xì)胞，這個(gè)神經(jīng)前體細(xì)胞最后生成大量未成熟神經(jīng)元，并在分化過程中從基底膜向嗅上皮表面移行[3]，伴隨這一過程同時(shí)進(jìn)行的是成熟嗅上皮中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4]。由此可見，哺乳動(dòng)物嗅上皮處于基底細(xì)胞生成、神經(jīng)細(xì)胞分化、基底細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)平衡中，這種平衡可能是由自分泌和旁分泌信號(hào)參與調(diào)控，從而最終刺激或抑制增殖[5]。其中，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)參與調(diào)節(jié)成熟ORN凋亡及增加前體細(xì)胞增殖；而生長(zhǎng)和分化因子II (GDFII)抑制神經(jīng)前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞[6]。

2 嗅上皮NSCs的培養(yǎng)

嗅上皮NSCs可通過自體取材獲得，并能通過體外培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。研究證實(shí)，采用無(wú)血清、非神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法可從嗅上皮分離培養(yǎng)出三種細(xì)胞，包括球形基底細(xì)胞、水平基底細(xì)胞及少量的支持細(xì)胞，并且體外培養(yǎng)的嗅上皮神經(jīng)干細(xì)胞具有多向分化潛能。

在NSCs分離培養(yǎng)的研究中，酶消化法(如膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶等)和機(jī)械分離法都可以用來分離NSCs。高亮等[7]通過不同消化酶(如中性蛋白酶和I型膠原酶)分階段酶解消化嗅上皮，可以原代富集到純度較高的嗅上皮NSCs(呈集落狀生長(zhǎng))，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增后，用含生長(zhǎng)因子(bFGF)的無(wú)血清培養(yǎng)液促使傳代細(xì)胞增殖形成神經(jīng)球，通過血清誘導(dǎo)神經(jīng)球分化，可維持嗅上皮NSCs的增殖活力和多潛能性，表現(xiàn)為從神經(jīng)球遷移出的分化細(xì)胞具有很高異質(zhì)性，高亮通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)神經(jīng)球細(xì)胞具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和寡突膠前體細(xì)胞分化的潛能。目前，對(duì)于誘導(dǎo)嗅上皮NSCs向特定種類的細(xì)胞分化(如向多巴胺能神經(jīng)元分化)所需的條件，仍有待于進(jìn)一步研究。另外，有些理論認(rèn)為，由于酶消化法可以部分破壞細(xì)胞存活所需的細(xì)胞表面粘附分子和細(xì)胞基質(zhì)等成分，并且胰蛋白酶殘留可能會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，所以推崇采用機(jī)械分離法來制備單細(xì)胞懸液，這樣能夠提高分離的活細(xì)胞率，并且形成較多的細(xì)胞球。

Mumm等[8]采用無(wú)血清培養(yǎng)方法從胚胎小鼠嗅上皮培養(yǎng)出神經(jīng)克隆形成細(xì)胞，并最終分化為神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，必須有來自嗅上皮底層基質(zhì)的細(xì)胞共培養(yǎng)，才能形成可分化為神經(jīng)元的神經(jīng)克隆，而與分化成熟的嗅上皮神經(jīng)元共培養(yǎng)時(shí)，神經(jīng)克隆形成數(shù)量明顯減少，這表明嗅上皮底層基質(zhì)中的細(xì)胞可能分泌促進(jìn)神經(jīng)克隆形成的某些因子，而分化成熟的神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)克隆的形成有反饋抑制作用，這與前文研究發(fā)現(xiàn)一致[4]。Roisen等[9]用DMEM /F12 (1：1)和10%胎牛血清的培養(yǎng)液，從成人嗅上皮分離培養(yǎng)出可以形成神經(jīng)球并具有自我更新能力，向神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞多向分化潛能的NSCs。Othman等[10]采用神經(jīng)球培養(yǎng)方法從硫酸鋅刺激后的綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠嗅上皮中分離培養(yǎng)出nestin免疫反應(yīng)陽(yáng)性NSCs，可直接用于創(chuàng)傷性和退行性中樞神經(jīng)疾病的NSCs移植治療研究。

嗅覺系統(tǒng)中存在許多與內(nèi)耳發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)的基因，如neurog1、neurod1及foxg1[11]。朱秋蓓等[12]通過體外原代及傳代培養(yǎng)大鼠嗅上皮NSCs，獲得具有多分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞球，將嗅上皮NSCs與體外培養(yǎng)的毛細(xì)胞或耳蝸培養(yǎng)液共培養(yǎng)，誘導(dǎo)嗅上皮NSCs分化為耳蝸毛細(xì)胞。Doyle等[13]報(bào)道了嗅上皮神經(jīng)前體細(xì)胞同耳蝸細(xì)胞共培養(yǎng)，或用耳蝸細(xì)胞的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的方法，在體外誘導(dǎo)嗅上皮神經(jīng)前體細(xì)胞分化形成耳蝸毛細(xì)胞，分化的細(xì)胞在形態(tài)上與毛細(xì)胞相似并表達(dá)多種毛細(xì)胞的標(biāo)志分子，包括 myosinVIIa、FM1-43、calretinin、phal-loidin和espin，以上均為探索嗅上皮NSCs治療毛細(xì)胞損傷所致的感音神經(jīng)性耳聾提供了理論依據(jù)。Murrell等[14]則在不同培養(yǎng)條件中將成體嗅上皮NSCs定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞。

3 嗅球NSCs的來源

嗅球最外層為嗅神經(jīng)層，由ORNs的軸突及鞘細(xì)胞組成。ORNs的軸突在嗅球內(nèi)側(cè)的小球?qū)优c二級(jí)神經(jīng)元僧帽和簇狀細(xì)胞的樹突形成突觸。小球?qū)又車鸀橛芍虚g神經(jīng)元組成的小球周圍細(xì)胞。小球?qū)拥膬?nèi)側(cè)是外叢層，由簇狀細(xì)胞體及樹突、僧帽細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的樹突組成，其內(nèi)側(cè)為僧帽細(xì)胞層。內(nèi)叢層主要由僧帽細(xì)胞和簇狀細(xì)胞的軸突、顆粒細(xì)胞的樹突組成，其由側(cè)為顆粒細(xì)胞層，包含顆粒細(xì)胞體及嗅球的第二型中間神經(jīng)元。嗅球的中央是由吻側(cè)遷移流(RMS)向前延伸的室管膜下層，內(nèi)含由側(cè)腦室的室下區(qū)(SVZ)產(chǎn)生的NSCs。室管膜下層中的生成嗅球中的中間神經(jīng)元、顆粒細(xì)胞和小球周圍細(xì)胞[15]。

嚙齒動(dòng)物出生后，顆粒細(xì)胞層中及小球?qū)又車闹虚g神經(jīng)元由來自SVZ，經(jīng)RMS遷移到嗅球的NSCs生成。腦室周圍區(qū)域產(chǎn)生的NSCs在未知因素作用下經(jīng)RMS遷移至嗅球的室管膜下層，疏散進(jìn)入嗅球的顆粒細(xì)胞層和小球周圍區(qū)域并分化成為中間神經(jīng)元[16]，即嗅球的顆粒細(xì)胞層和小球周圍NSCs負(fù)責(zé)出生后嗅球的神經(jīng)發(fā)生[17]。研究表明，嗅球自身也存在NSCs，且大部分分化為膠質(zhì)細(xì)胞；而來自RMS的NSCs多數(shù)分化為神經(jīng)元[18]。

4 嗅球NSCs的培養(yǎng)

嗅球內(nèi)富含NSCs，取材簡(jiǎn)便，細(xì)胞獲得率高，并且在體外培養(yǎng)時(shí)顯示出向神經(jīng)細(xì)胞及非神經(jīng)細(xì)胞的多向分化潛能，是NSCs自體移植最理想的取材部位。Pagano等[19]首先采用無(wú)血清神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)方法從人嗅球成功分離培養(yǎng)出具有自我更新并能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞的NSCs。在無(wú)血清培養(yǎng)基中去除生長(zhǎng)因子后，由于營(yíng)養(yǎng)供給及細(xì)胞因子受體活性發(fā)生改變，使得嗅球NSCs由分裂增殖狀態(tài)過渡到分化狀態(tài)。另外發(fā)現(xiàn)，無(wú)血清誘導(dǎo)下，嗅球NSCS更多地分化為神經(jīng)元，而有血清培養(yǎng)如胎牛血清，有助于嗅球NSCS更多的向星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，并且血清濃度與膠質(zhì)細(xì)胞的分化程度成正比關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)，嗅球NSCs增殖分化特性在不同發(fā)育階段存在一定的差異：隨著發(fā)育階段的增長(zhǎng)，形成神經(jīng)球的細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元分化趨勢(shì)逐漸減少。在個(gè)體發(fā)育不同階段中，嗅球NSCs的生物學(xué)特性出現(xiàn)差異，導(dǎo)致嗅球NSCs增殖分化特性發(fā)育差異的機(jī)制和意義，應(yīng)當(dāng)是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。

鑒于NSCs的培養(yǎng)與其它神經(jīng)細(xì)胞不同，研究者為了維持其干細(xì)胞特點(diǎn)，需要特殊的培養(yǎng)條件來保證NSCs的分裂增殖并抑制細(xì)胞分化，所以NSCs的培養(yǎng)需要添加生長(zhǎng)因子(如bFGF/EGF等)。郭向東等[20]采用神經(jīng)細(xì)胞球形成法，以無(wú)血清培養(yǎng)液，使用生長(zhǎng)因子(bFGF/EGF)進(jìn)行大鼠嗅球NSCs體外擴(kuò)增培養(yǎng)，以機(jī)械分離法連續(xù)傳代，運(yùn)用相差顯微鏡及電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，通過免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Nestin表達(dá)，運(yùn)用四甲基偶氮哇鹽(MTI)，比色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)嗅球NSCs的增殖能力。研究證實(shí)[20]，NSCs在體內(nèi)的發(fā)育依賴于多種生長(zhǎng)因子(如IGF-I和BDNF)的作用。其中，IGF-I是一種促生長(zhǎng)肽類激素(growth promoting peptide hormone)，有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)特性；BDNF是第2種被鑒定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)[21]，是腦內(nèi)分布最廣的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。IGF-I可以通過靶細(xì)胞表面的特異性受體來促進(jìn)嗅球源性NSCs增殖和分化；而BDNF對(duì)嗅球源性NSCS的增殖分化不起主導(dǎo)作用，但BDNF可增強(qiáng)IGF-I的作用[22]。更多地認(rèn)識(shí)細(xì)胞因子在嗅球NSCs增殖分化過程中的作用，將有助于我們深入了解嗅球NSCs增殖分化的分子生物學(xué)機(jī)制，提高我們控制嗅球NSCs向特定功能神經(jīng)細(xì)胞定向分化的精確度，對(duì)將來NSCs移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病意義重大。

5 NSCs應(yīng)用

5.1細(xì)胞替代治療指在將體外培養(yǎng)和擴(kuò)增的NSCs移植到腦內(nèi)，治療因細(xì)胞死亡或凋亡引起的疾病，如帕金森氏病、Huntington病、神經(jīng)性耳聾等[23]。目前，細(xì)胞替代實(shí)驗(yàn)的開展主要分為以下三個(gè)思路：①內(nèi)源性NSCs的自身激活。然而，研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷導(dǎo)致內(nèi)源性NSCs的增殖產(chǎn)生的幾乎全是膠質(zhì)細(xì)胞[24]，所以，內(nèi)源性NSCs的自身激活有效率不高，而NSCs移植仍然是最可行的神經(jīng)組織替代治療策略；②異體NSCs移植。體外培養(yǎng)的NSCs移植到腦內(nèi)后能夠遷移分化為特定部位的神經(jīng)細(xì)胞，這些分化后的神經(jīng)細(xì)胞能很好地整合于宿主組織，與其它神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，分泌神經(jīng)遞質(zhì)并發(fā)揮功能。陳福權(quán)等[25]采用細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染及細(xì)胞移植的方法，分別從從胚胎、新生及成年大鼠嗅球分離培養(yǎng)NSCs，將攜帶報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的新生大鼠嗅球NSCs移植至正常成年大鼠耳蝸，結(jié)果表明植入耳蝸的NSCs可存活數(shù)周，主要分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞，遷移至螺旋神經(jīng)節(jié)及其周圍突區(qū)域，可主動(dòng)產(chǎn)生分泌GDNF及NGF。研究表明，NSCs可能替代缺失或損傷的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，并對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)支持作用。龐飛等[26]制備大鼠下胸段脊髓打擊損傷模型，將嗅粘膜來源神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(OM-NSCs)聯(lián)合移植，免疫熒光顯示移植的BMSCs和OM-NSCs均能遷移至脊髓損傷區(qū)，并在損傷區(qū)存活。但是，關(guān)于異體NSCs移植治療策略，有兩點(diǎn)需要注意：①移植NSCs細(xì)胞的分化方向和功能是由其所處的微環(huán)境而不是NSCs自身內(nèi)在特性決定；②分化效率偏低，如Vescovi等[27]在研究NSCs細(xì)胞移植治療帕金森氏病時(shí)發(fā)現(xiàn)，在體外實(shí)驗(yàn)中沒有必須的因素干預(yù)下，自然分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例只占細(xì)胞總數(shù)的0.5%～5%。因此，如何精確調(diào)控干細(xì)胞分化效率成為研究重點(diǎn)；③自體NSCs移植。Pagano等[28]首次將嗅球切除術(shù)患者的嗅球組織進(jìn)行體外分離培養(yǎng)NSCs并獲得成功，并建立了“嗅球干細(xì)胞系”，為NSCs自體移植的細(xì)胞來源提供了初步探索。

5.2基因/藥物治療載體鑒于很多有治療作用的大分子物質(zhì)如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性生長(zhǎng)因子等都不能通過血腦屏障，NSCs作為基因/藥物治療載體，具有遷徙能力，可以整合于宿主組織，能分化為成熟細(xì)胞修復(fù)病損組織并且可以避免免疫排斥反應(yīng)的特點(diǎn)，為治療一些CNS疾病開辟了新途徑。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[29]，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的基因片段導(dǎo)入NSCs中，移植到腦內(nèi)后，NSCs能遷移并整合于病變部位，長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、白介素-4、活性酶和神經(jīng)遞質(zhì)等外源基因產(chǎn)物，并不同程度改善動(dòng)物疾病模型的癥狀或抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)動(dòng)物生存時(shí)間。已有報(bào)道，用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的B-葡萄糖醛酸酶基因轉(zhuǎn)染NSCs，再將其注入MPSVII新生鼠腦內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠行為及神經(jīng)功能均恢復(fù)正常，并且病理分析發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞己經(jīng)彌散到全腦[30]。

6 展望

嗅球和嗅上皮終生維持活躍的神經(jīng)細(xì)胞更新，并且取材簡(jiǎn)便，是目前獲取NSCs的重要模型，也是自體NSCs移植的可靠來源。目前，我們對(duì)于嗅覺通路NSCs生長(zhǎng)特性、分化機(jī)制的了解仍不全面，需進(jìn)一步探討。

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Research progress on the olfactoryneural stem cells

HUANG Li，F(xiàn)AN Jian-gang，HAN Liang，F(xiàn)ENG Yong

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014SZ0051)

R329

B

1672-6170(2017)05-0249-04

2017-04-13；

2017-05-26)

△通訊作者