單克隆抗體藥物耐藥機制的研究進(jìn)展

張懷民，傅秀慧，劉曉志

單克隆抗體藥物耐藥機制的研究進(jìn)展

張懷民1，傅秀慧2，劉曉志3*

單克隆抗體藥物的問世，使疾病治療的方式發(fā)生了革命性的變化。過去的20年，單克隆抗體藥物在癌癥、自身免疫等疾病的治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。單克隆抗體藥物低毒和高特異性優(yōu)勢是其成功的關(guān)鍵。單克隆抗體藥物的這兩個優(yōu)勢使其快速替代傳統(tǒng)的化學(xué)療法，但其治療效果也同樣受到耐藥性的困擾。耐藥性是導(dǎo)致單克隆抗體藥物治療效果被抑制的原因之一，單克隆抗體藥物靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞后又被清除的情況，稱為抗體的調(diào)制。靶細(xì)胞通過順式或反式方式實現(xiàn)調(diào)制，并形成二次吞噬，導(dǎo)致細(xì)胞聚集沉淀。本文將對每個過程的證據(jù)以及應(yīng)對策略進(jìn)行討論。

單克隆抗體藥物；Fcγ受體；內(nèi)化作用；削除作用；免疫療法；CD20

0 引言

1975年，Kohler和Milstein對單克隆抗體的制備進(jìn)行了描述，為抗體大規(guī)模應(yīng)用于疾病治療奠定了基礎(chǔ)[1]。Kohler和Milstein也因此獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎，他們的技術(shù)導(dǎo)致了最早一代單克隆抗體藥物的誕生。此后，單克隆抗體治療充滿了挑戰(zhàn)，如早年使用鼠原抗體帶來嚴(yán)重的免疫原性問題，隨著嵌合抗體、人源化抗體技術(shù)及噬菌體篩選技術(shù)，小鼠表達(dá)人源抗體技術(shù)以及臨床前及臨床試驗監(jiān)管力度的加大，免疫原性問題等有關(guān)單克隆抗體藥物安全性的情況得到了明顯改善。一些單克隆抗體藥物在臨床上表現(xiàn)出潛在的治療效果?？笴D20單克隆抗體藥物利妥昔單抗可以明顯提高藥物的響應(yīng)率和患者的總生存期，其批準(zhǔn)上市，標(biāo)志著B細(xì)胞惡性腫瘤治療新時代的開始。單克隆抗體藥物不僅用于B細(xì)胞功能障礙相關(guān)疾病的治療，最近，其治療范圍擴大到自身免疫性疾病領(lǐng)域，標(biāo)志著單克隆抗體藥物治療已經(jīng)進(jìn)入了“后利妥昔單抗時代”。

抗腫瘤壞死因子(TNF，Anti-tumour necrosis factor)單克隆抗體藥物英夫利昔單抗(Infliximab)對自身免疫性疾病的治療產(chǎn)生了重要的影響。1998年，英夫利昔單抗被批準(zhǔn)用于克羅恩病(Crohn′s disease)的治療，現(xiàn)在被批準(zhǔn)的適應(yīng)證擴大到了強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及潰瘍性結(jié)腸炎等。然而，這兩個成功的單克隆抗體藥物面臨著同樣的挑戰(zhàn)，即單克隆抗體藥物的耐藥性問題[2]。

1 單克隆抗體藥物的藥效機制

單克隆抗體藥物的藥效機制同小分子藥物完全不同。例如，單克隆抗體藥物結(jié)合特異靶點分子作用于天然配體(如：Infiximab，單克隆抗體藥物的靶點是TNF-α)，單克隆抗體藥物還用于信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)(Herceptin阻止Her-2neu的二聚化)[3]，或用于免疫系統(tǒng)的效應(yīng)調(diào)節(jié)，如啟動血清中的補體效應(yīng)，或通過抗體Fc同NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上Fc受體結(jié)合而啟動的ADCC效應(yīng)(抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用)。

實際上，大多數(shù)治療性單克隆抗體是通過Fc受體，特別是Fcγ受體產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)用于疾病治療。Fcγ受體屬于進(jìn)化相關(guān)的受體蛋白家族，一般依照其與IgG結(jié)合性和下游信號效應(yīng)進(jìn)行分類。人類和小鼠具有高親和力Fcγ受體，可以同IgG單體結(jié)合，其余種屬的Fcγ受體屬于中度親和力受體，只能同水溶性IgG多聚體或細(xì)胞結(jié)合免疫復(fù)合物結(jié)合。FCγ受體的主要功能是通過FcR區(qū)域的γ鏈結(jié)合產(chǎn)生激活信號，γ鏈包含了免疫受體酪氨酸活化組件。然而，小鼠和人都具有單一的抑制性FcγRIIB (CD32B)，是基于酪氨酸的免疫抑制性受體，可以降低FcγR或SHIP招募的其他刺激受體的激活作用[4]。

研究者以CD20單克隆抗體藥物作為研究對象，尋找FcγR在單克隆抗體藥物發(fā)揮耐藥的機制，并需求解除這種耐藥現(xiàn)象的策略。以CD20單克隆抗體藥物的體外功能將其劃分為Ⅰ型(利妥昔單抗樣)和Ⅱ型(托西莫單抗樣)。Ⅰ型CD20單克隆抗體藥物的Fc片度的富集增強了C1q的招募作用，顯示其激活組分的能力，將CD20重新分布到細(xì)胞膜微區(qū)域的脂筏上。Ⅱ型CD20單克隆抗體藥物不具備這些作用，而是激發(fā)同質(zhì)粘附和溶酶體介導(dǎo)的非凋亡細(xì)胞死亡[5]。此外，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體比Ⅱ型抗體更易從細(xì)胞表面內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi)。我們對這兩類單克隆抗體的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，揭示單克隆抗體藥物的耐藥機制及應(yīng)對策略。

2 單克隆抗體藥物的細(xì)胞內(nèi)化

CD20在惡性腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，是抗體治療中理想的靶標(biāo)分子。但是產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞和干細(xì)胞缺失CD20，并缺少抗原的下調(diào)現(xiàn)象。

轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)人CD20的B細(xì)胞研究顯示，Ⅱ型抗CD20單克隆抗體較Ⅰ型單克隆抗體更易清除B細(xì)胞。使用Ⅱ型抗體治療需要的時間較長，程度較大，Ⅰ型和Ⅱ型單克隆抗體藥物通過不同的通路獨立介導(dǎo)補體激活和細(xì)胞程序性死亡。體內(nèi)實驗顯示，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體被內(nèi)化并在轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞中降解，這和抗CD20單克隆抗體處理體外原代和治療人類惡性B細(xì)胞的細(xì)胞實驗結(jié)果相同，這一點和Ⅱ型抗CD20單克隆抗體的表現(xiàn)不同。內(nèi)化會縮短單克隆抗體藥物半衰期，并影響調(diào)理細(xì)胞的吞噬功能，這將直接導(dǎo)致單克隆抗體藥物治療效果降低和用藥費用增多。

2.1 單克隆抗體藥物的細(xì)胞內(nèi)化 Lim等[6]對抗CD20單克?、裥涂贵w的細(xì)胞內(nèi)化機制進(jìn)行了研究。實驗中利妥昔單抗F(ab′)2片段的結(jié)合反應(yīng)下降，表明可能有Fc受體參與了這個過程。當(dāng)B細(xì)胞只表達(dá)抑制性FcγRIIB或使用特異性抗體封閉FcγRIIB時，抗體的細(xì)胞內(nèi)化作用被抑制。另外，體外實驗表明，細(xì)胞表達(dá)的FcγRIIB同細(xì)胞結(jié)合的利妥昔單克隆抗體藥物呈負(fù)相關(guān)。研究還表明，mAb的Fc片段和FcγR的Fc結(jié)合區(qū)域相互作用增強了單克隆抗體藥物的內(nèi)化作用。

Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcγRIIB通過下述兩種方式發(fā)揮作用，與相鄰的細(xì)胞發(fā)生反式作用，在單細(xì)胞表面發(fā)生順式作用。Lim等[6]的重復(fù)實驗結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間發(fā)生的直接相互作用。結(jié)果表明，為了實現(xiàn)抗體的細(xì)胞內(nèi)化，需要Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcγRIIB的順式相互作用，這一過程被稱為抗體的雙極橋接。有研究表明，使用利妥昔單克隆抗體藥物治療時，腫瘤細(xì)胞高水平表達(dá)FcγRIIB的患者較低水平表達(dá)的患者的生存期明顯降低[6]。另外，利妥昔單克隆抗體藥物治療濾泡性淋巴瘤患者的研究也顯示，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體的細(xì)胞內(nèi)化作用影響了治療效果。

抗CD20的Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcγRIIB的順式相互作用與FcγRIIB和抗體包被抗原免疫復(fù)合物間的相互作用方式相似。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物與B細(xì)胞受體結(jié)合時，抗體的Fc片段和FcγRIIB通過順式發(fā)生相互作用，在細(xì)胞膜處將抑制型FcγR和B細(xì)胞受體結(jié)合；激活抑制型B細(xì)胞受體，對于抗原特異性B細(xì)胞反應(yīng)是一個負(fù)反饋。抑制型BCR的活化，IgG免疫復(fù)合物引導(dǎo)FcγRIIB的B2亞型的快速內(nèi)化，這個過程是不依賴細(xì)胞區(qū)域完整ITIM序列的。上述研究表明，抗CD20Ⅰ型單克隆抗體和FcγRIIB的相互作用引導(dǎo)復(fù)合物向細(xì)胞膜接近，與磷酸化的FcγRIIB ITIM形成三聚體復(fù)合物，增強了復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)化作用，過程與免疫復(fù)合物的內(nèi)化相似。然而，Vaughan等[7]的研究顯示，F(xiàn)cγRIIB的突變體缺乏完整的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，同樣可以完成對抗CD20的Ⅰ型單克隆抗體內(nèi)化的增強作用，與野生型的FcγRIIB效果相同。這表明FcγRIIB和免疫復(fù)合物之間的相互作用、抗體連接CD20的內(nèi)化并不是通過FcγR依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，F(xiàn)cγRIIB的作用可能僅限于物理結(jié)構(gòu)的相互作用。

2.2 脂筏的作用 Ⅰ型抗CD20單克隆抗體不僅與FcγRIIB相結(jié)合。事實上，B細(xì)胞靶標(biāo)的抗原抗體復(fù)合物通過順式反應(yīng)FcγRIIB結(jié)合到細(xì)胞表面，還包括單克隆抗體與MHC Ⅱ、CD40和CD38的結(jié)合。然而，這些內(nèi)化作用一般不會對抗體連接受體的內(nèi)化產(chǎn)生影響，只有抗CD38和CD19的抗體會產(chǎn)生較為明顯的影響。

為了進(jìn)一步闡明抗原調(diào)變機制，研究者對脂筏結(jié)構(gòu)FcγRIIB在單克隆抗體藥物鏈接CD20內(nèi)化過程中的增強作用進(jìn)行研究。Ⅰ型抗CD20單克隆抗體介導(dǎo)了CD20向脂筏的重分布，而Ⅱ型抗CD20單克隆抗體與其他單克隆抗體直接和B細(xì)胞表面受體結(jié)合。此外，在與BCR相互作用時，F(xiàn)cγRIIB也向脂筏重分布。向脂筏的重分布及后續(xù)的內(nèi)吞過程存在于許多受體配體復(fù)合物及病毒的內(nèi)化過程中。研究者推測，F(xiàn)cγRIIB和利妥昔單克隆抗體藥物在脂筏上的相互作用對于增強內(nèi)化是必需的，這就解釋了盡管FcγRIIB被磷酸化，Ⅱ型抗CD20單克隆抗體內(nèi)化和抗體直接與其他受體的內(nèi)化比例基本相當(dāng)[8]。

在脂筏的研究中，研究者使用具有CD20突變型的人骨髓瘤細(xì)胞作為研究對象，因為CD20的突變型不能重分布到脂筏上。在FcγRIIB缺失時，表達(dá)突變型CD20的細(xì)胞表現(xiàn)出比野生型細(xì)胞較慢的抗體內(nèi)化作用，這說明CD20向脂筏的重分布對于抗體內(nèi)化有重要影響。當(dāng)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染FcγRIIB時，抗體內(nèi)化開始加速，這說明轉(zhuǎn)染的FcγRIIB代替了突變的FcγRIIB引領(lǐng)突變的CD20向脂筏的重分布。為了驗證這種情況，研究者利用FcγRIIB得到不能向脂筏重分布的突變體FcγRIIA。突變體FcγRIIA可以增強CD20的內(nèi)化，這說明內(nèi)化過程中CD20向脂筏的作用中FcγRIIB可能不是必須的。CD20內(nèi)化過程中，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體和FcγRIIB相互作用的具體機制尚不清楚。

內(nèi)吞作用的前提是膜的曲率，這將形成內(nèi)吞小泡。Stachowiak等[9]對人工脂膜的研究顯示，高度擁擠的蛋白可以誘發(fā)膜形成褶皺及脂質(zhì)小管，褶皺的增加同蛋白質(zhì)濃度相關(guān)。研究者發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體、FcγRIIB和CD20在細(xì)胞膜上聚集，而Ⅱ型抗體沒有這種重分布的情況發(fā)生。Stachowiak等人工脂膜的研究顯示，Ⅰ型抗CD20單克隆抗體誘發(fā)CD20和FcγRIIB的重分布，這可能觸發(fā)膜褶皺和隨后的內(nèi)吞。這個過程中FcγRIIB可能與抗體受體復(fù)合物發(fā)生強烈的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞膜上高密度的蛋白招募反應(yīng)，進(jìn)而引起細(xì)胞膜的形變。但這并不能完全解釋在Ⅱ型抗CD20單克隆抗體的順式反應(yīng)中FcγRIIB和CD20也發(fā)生相互作用，但是并沒有觸發(fā)CD20的內(nèi)化。然而，Ⅱ型單克隆抗體GA101(Obinutuzumab)的晶體結(jié)構(gòu)的研究表明，Ⅱ型抗體結(jié)合CD20的定位同Ⅰ型抗體不同。這種差異可能是順式反應(yīng)中Ⅰ型和Ⅱ型單克隆抗體同F(xiàn)cγR的相互作用的親和力和密度不同。雖然Ⅱ型單克隆抗體和磷酸化的FcγRIIB相互作用，但是活化的水平不高。即使對Ⅱ型抗CD20單克隆抗體的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整，也不能啟動足夠的招募反應(yīng)使膜引發(fā)皺褶并發(fā)生內(nèi)吞反應(yīng)?；谏鲜龅难芯?，我們認(rèn)為，Ⅱ型單克隆抗體不能誘導(dǎo)CD20向脂筏的重分布，Ⅱ型單克隆抗體直接定向特異性的靶點蛋白，并保留在細(xì)胞表面而不被內(nèi)化。

3 單克隆抗體藥物的削除機制

另一種抗體耐藥性的解釋是抗體的削除機制或是Trogocytosis作用(細(xì)胞吞噬的一種機制)。Taylor等[10]基于使用利妥昔單克隆抗體藥物的慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)患者進(jìn)行研究，提出抗體削除機制可能是患者對單克隆抗體藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。這種機制有助于解釋在使用利妥昔單克隆抗體藥物治療初期循環(huán)CLL細(xì)胞數(shù)量降低，但是隨著藥物的持續(xù)使用，CD20陰性的CLL細(xì)胞數(shù)量逐步增加。

單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的FcγR依賴免疫反應(yīng)中，抗體和靶點復(fù)合物從靶細(xì)胞表面削除或拔掉。最初人們認(rèn)為FcγRI介導(dǎo)了這一過程，之后研究發(fā)現(xiàn)，抗原抗體復(fù)合物與效應(yīng)細(xì)胞FcγR的結(jié)合可以完成削除機制。抑制型FcγRIIB的小鼠實驗也證明了削除機制的存在。而使用腹腔腫瘤小鼠得到的關(guān)于FcγR的數(shù)據(jù)證實補體發(fā)揮了一定作用。認(rèn)為單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)的補體受體和補體自身介導(dǎo)了細(xì)胞的吞噬作用，這個系統(tǒng)的激活造成FcγR劃分困難。

Taylor等[10]提出，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞群趨于飽和疲勞時，易于發(fā)生削除效應(yīng)。削除機制后，由于單克隆抗體不在靶細(xì)胞上結(jié)合，因此，針對靶細(xì)胞的后續(xù)細(xì)胞效應(yīng)也無法完成。使用利妥昔單克隆抗體藥物后，補體成分和NK細(xì)胞被耗竭，但是沒有證據(jù)支持單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞功能下降或是衰竭。這可能是白血病或其他腫瘤細(xì)胞中豐富的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)執(zhí)行了細(xì)胞的攝取和清除功能。在正常穩(wěn)態(tài)條件下，肝臟和脾臟的吞噬細(xì)胞每秒可以清除200萬血紅細(xì)胞。

Griffin等[11]首次對細(xì)胞的削除機制進(jìn)行了描述，他發(fā)現(xiàn)，即使沒有調(diào)理細(xì)胞的吞噬和破壞作用，單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞也可以完成對的內(nèi)化。其之前的研究也表明，抗原抗體復(fù)合物覆蓋的細(xì)胞可以防止調(diào)理細(xì)胞的吞噬吸收(研究發(fā)現(xiàn)，被抗體有效覆蓋一半的靶向細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生緊密接觸),但不作用于調(diào)理抗體覆蓋一半的靶向細(xì)胞遠(yuǎn)端的裸露部分，因此，防止了巨噬細(xì)胞“拉鏈”吞噬的發(fā)生。雖然這些數(shù)據(jù)很好地解釋了抗體介導(dǎo)的這一過程，但是早期的研究證實，多克隆抗體較單克隆抗體的作用更大。這可能是因為多克隆抗體可以提高同受體(B細(xì)胞受體)的結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)產(chǎn)生超交聯(lián)效應(yīng)，如利妥昔單克隆抗體藥物可以識別更離散的抗原，并形成較早期研究更小的“帽”。幾個實驗室的研究都顯示出類似的結(jié)果，其他多種單克隆抗體(曲妥珠單克隆抗體藥物，西妥昔單克隆抗體藥物，T101，依帕珠單克隆抗體藥物，達(dá)利珠單克隆抗體藥物，CD22/CD20雙特異性抗體和CD3/TROP-2雙特異性抗體)的削除機制發(fā)生在靶細(xì)胞上[12]。

建立適合不同細(xì)胞類型、設(shè)計合理的單克隆抗體，可以有效避免耐藥性的產(chǎn)生。如：選用Ⅱ型抗CD20單克隆抗體，如obinutuzumab，或在注射rituximab的同時，注射降低內(nèi)化作用的單克隆抗體藥物，以克服內(nèi)化機制的影響。為了克服因抗原丟失造成的不利影響，有研究者提出多次低劑量注射抗體的用藥策略，試圖充分清除細(xì)胞，但沒有成功，其建議對效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行浸潤處理或使用其他直接靶向單克隆抗體，提高藥物在CLL患者中的響應(yīng)率。

在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，利妥昔單克隆抗體藥物的劑量遞增試驗對于CLL患者的有效率高于每周1次注射(劑量為2 250 mg/m2)[10]。此外，最近一項使用低劑量利妥昔單克隆抗體藥物針對之前治療無效的CLL患者的隨機Ⅱ期臨床試驗中，因其效果低于標(biāo)準(zhǔn)方法FCR，在實驗早期即終止。表明實驗中削除機制沒有限制藥物的有效性，低劑量利妥昔單克隆抗體藥物不增加CLL患者的療效，但是這些結(jié)果受米托蒽醌入的干擾。

CD20陰性細(xì)胞的出現(xiàn)是更大的問題，Taylor等[10]認(rèn)為，其是解除抑制的循環(huán)細(xì)胞，或被效應(yīng)細(xì)胞削除后逃脫免疫效應(yīng)細(xì)胞作用的循環(huán)和傳遞細(xì)胞，或最終被清除的是上述某類細(xì)胞。Taylor等[10]認(rèn)為，削除機制是一個次要而獨立的過程，只有當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞浸潤或耗盡時，才對耐藥循環(huán)細(xì)胞發(fā)揮作用[13]。

Boross等[14]的研究支持后者的觀點，清除的都是被削除的細(xì)胞，RTX誘導(dǎo)的CD20吞噬作用依賴于RTX的濃度，并和CD20的療效相關(guān)，兩個過程是密切相關(guān)的。如果在體外使用乳膠珠，人工造成小鼠或人類巨噬細(xì)胞的飽和，削除機制中飽和相關(guān)的損失減少，相應(yīng)的吞噬作用也下降。另外，Pedersen等[15]的研究表明，抗CD20的Ⅰ型和Ⅱ型單克隆抗體都可能介導(dǎo)發(fā)生削除機制。盡管兩者的削除機制類似，在體外和小鼠試驗中，Ⅱ型單克隆抗體較Ⅰ型單克隆抗體介導(dǎo)的削除機制更強，這可能與Ⅱ型單克隆抗體缺少內(nèi)化機制有關(guān)。最近，一項針對CLL患者的頭對頭臨床試驗中，Ⅱ型單克隆抗體Obinutuzumab和利妥昔單克隆抗體藥物聯(lián)合苯丁酸氮芥，使無進(jìn)展生存期延長近1倍(盡管obinutuzumab劑量較高)?？傊?，在抑制Ⅰ型抗CD20單克隆抗體有效性的過程中，細(xì)胞內(nèi)化作用較削除機制的影響更大。

4 單克隆抗體和抑制性FcγRIIB的其他相互作用 由于內(nèi)化和削除機制導(dǎo)致的靶細(xì)胞表面抗原丟失，單克隆抗體藥物的治療效果受到了影響，另外，抗體和抑制性FcγRIIB間的其他相互作用也可能加劇這種抑制。下面探討，順式或反式中抗體和FcγRIIB間的相互作用對單克隆抗體藥物的治療效果的影響。

4.1 靶細(xì)胞的順式作用 順式作用是指單克隆抗體藥物靶向特異細(xì)胞自身的表面受體FcγRIIB發(fā)生的相互作用，并發(fā)生后續(xù)效應(yīng)。首先，抗體和FcγRIIB之間的順式作用可以與反式細(xì)胞表達(dá)其他FcγR競爭，進(jìn)而降低后續(xù)的FcγR依賴的免疫效應(yīng)。有研究者使用腫瘤靶向治療抗體對轉(zhuǎn)染FcγRIIB的黑色素瘤的小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)染FcγRIIB的黑色素瘤的小鼠比較，使用轉(zhuǎn)染FcγRIIB的黑色素瘤的小鼠生存期明顯縮短。體外實驗證實，這種效應(yīng)獨立于FcγRIIB胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，具有較低的抗體依賴性的細(xì)胞毒作用。我們推測，F(xiàn)cγRIIB和治療性單克隆抗體間發(fā)生順式作用，于反式專業(yè)吞噬細(xì)胞表達(dá)的活性FcγR。通過加強FcγR活化，吞噬細(xì)胞可以作為輔助促進(jìn)免疫反應(yīng)，通過抗原提呈細(xì)胞降低吞噬細(xì)胞的攝取作用[16]，同時，也減低了針對腫瘤特異抗原的抗原特異性免疫反應(yīng)。

FcγRIIB和治療性單克隆抗體間的順式作用可能結(jié)合抗體的Fc片段，而與補體蛋白形成競爭。Ⅰ型抗CD20單克隆抗體與補體的高效作用，激活經(jīng)典的補體級聯(lián)反應(yīng)，其對于體內(nèi)的抗體治療是不必要的。研究表明，通過反式的FcγRIII表達(dá)，補體成分C1q和C3抑制Ⅰ型抗CD20單克隆抗體激活NK細(xì)胞，從而減少ADCC效應(yīng)。這可能是由于補體和FcγR對于Fc片段結(jié)合的競爭而形成的。雖然沒有實驗證明，但是類似情況發(fā)生在補體和順式表達(dá)的FcγRIIB之間，這兩種蛋白競爭結(jié)合治療性單克隆抗體的Fc片段。因此，對于單克隆抗體治療，補體激活具有重要意義，但是與FcγRIIB的順式相互作用會影響治療效果。

4.2 靶細(xì)胞的反式作用 研究顯示，靶向B細(xì)胞表面受體的單克隆抗體藥物通過順式和反式與FcγRIIB結(jié)合。與反式吞噬細(xì)胞表達(dá)的FcγRIIB的作用較直接靶向單克隆抗體藥物的治療效果差，可能是由于Fc上的結(jié)合位點和吞噬細(xì)胞的活化FcγR競爭，抑制了細(xì)胞活化，進(jìn)而對FcγRIIB產(chǎn)生了抑制作用。單克隆抗體藥物引起FcγR活化和FcγRIIB抑制的比率稱為活化抑制率，可以通過細(xì)胞FcγR的表達(dá)量和單克隆抗體藥物IgG的亞型進(jìn)行檢測。小鼠IgG1抑制FcγRIIB的結(jié)合能力高于IgG2a，因此，小鼠IgG1藥物的活化抑制率更低，藥物的治療效果差。Nimmerjahn等[17]利用小鼠轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系對單克隆抗體藥物和FcγRIIB相互作用對藥效的影響，以及活化抑制率的重要性進(jìn)行了研究。利用直接靶向腫瘤的單克隆抗體藥物、IgG2a亞型單克隆抗體藥物對小鼠進(jìn)行治療，這種藥物的活化抑制率為70，結(jié)果顯示，相對于沒有藥物治療的對照組動物，治療組的肺轉(zhuǎn)移率明顯下降，幾乎為零。相反，IgG1亞型單克隆抗體藥物活化抑制率較低(0.1)，IgG1亞型單克隆抗體藥物治療的小鼠肺轉(zhuǎn)移未減少。然而，將小鼠編碼FcγRIIB的基因敲除，單克隆抗體藥物只能和活性的FcγR結(jié)合，IgG1亞型單克隆抗體藥物的治療效果明顯增強。因此，單克隆抗體藥物和FcγRIIB之間的反相結(jié)合將直接影響治療效果。其機制與人類的多種腫瘤治療有關(guān)，如：40%惡性黑色素瘤的轉(zhuǎn)移性腫瘤中檢測到FcγRIIB的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞自身(或相關(guān)非造血細(xì)胞)FcγRIIB的異位表達(dá)，腫瘤細(xì)胞周圍中效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)的活化FcγR，和單克隆抗體藥物形成競爭結(jié)合，降低了治療性單抗活化抑制率和臨床治療效果。

5 單克隆抗體耐藥性的應(yīng)對策略

通過對抗CD20單克隆抗體藥物的研究，我們認(rèn)為，治療性單克隆抗體藥物和FcγRIIB的結(jié)合是導(dǎo)致單克隆抗體藥物耐藥的重要原因。Roghanian等[15]聯(lián)合使用FcγRIIB特異性封閉抗體6G11和利妥昔單克隆抗體藥物，對小鼠表達(dá)人CD20和FcγRIIB進(jìn)行細(xì)胞實驗。表明FcγRIIB特異性封閉抗體降低了體外實驗中B細(xì)胞表面CD20的內(nèi)化，提高了機體內(nèi)B細(xì)胞的耗竭。此外，觀察到類似的B細(xì)胞消耗增大，6G11突變體N297Q與利妥昔單克隆抗體藥物聯(lián)合使用時，利妥昔單克隆抗體藥物的Fc片段無法與FcγR結(jié)合。這表明通過防止單克隆抗體藥物在FcγRIIB和靶點間形成雙極抗體橋接，減少了部分的利妥昔單克隆抗體藥物介導(dǎo)的內(nèi)化，進(jìn)而增強治療效果。

除了抑制內(nèi)化，阻斷雙極抗體橋接形成也能增加單克隆抗體和反式表達(dá)FcγR的相互作用。使用FcγRIIB阻斷抗體，如6G11，也可以防止單克隆抗體藥物與反式的吞噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞FcγRIIB的結(jié)合，進(jìn)而提高活化抑制率，最終達(dá)到提高治療效果的目的。

治療單克隆抗體藥物同6G11聯(lián)合使用的臨床實驗結(jié)果，值得期待。如果成功，阻斷FcγRIIB的單克隆抗體藥物將可能用于多種靶向單克隆抗體藥物的聯(lián)合治療?？笷cγRIIB的單克隆抗體藥物可以阻斷下游抑制性信號通路，增加靶向單克隆抗體藥物的治療效果。然而，有研究表明，反向表達(dá)的FcγRIIB的交叉連接對于某些單克隆抗體藥物(如抗CD40的藥物)是必須的，阻斷FcγRIIB不利于單克隆抗體藥物發(fā)揮作用，因此，在使用這種方法之前需要對抗體發(fā)揮作用的機制進(jìn)行評估。

6 結(jié)論

單克隆抗體藥物已經(jīng)改變疾病治療的方式，尤其是在腫瘤領(lǐng)域。自1997年利妥昔單克隆抗體藥物上市，已有大量單克隆抗體藥物進(jìn)入臨床。這種治療不同于常規(guī)的化療，其耐藥機制也有所不同。我們對內(nèi)化機制、消除機制以及FcγRIIB介導(dǎo)的其他耐藥機制進(jìn)行了介紹，特別是抗CD20單克隆抗體藥物的耐藥機制的研究進(jìn)展。如果克服抗體耐藥的策略行之有效，將為抗體的臨床治療提供更廣闊的前景。

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Research progress on the mechanisms of therapeutic monoclonal antibodies resistance

ZHANG Huai-min1,FU Xiu-hui2,LIU Xiao-zhi3*

(1.Department of Pharmacy,the Fourth Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050019,China;2,Fifth Hospital of Shijiazhuang，Shijiazhuang 050021,China;3.State Key Laboratory of Antibody Research & Development;New Drug Research and Development Company Ltd.,North China Pharmaceutical Corporation，Shijiazhuang 050015，China)

The advent of monoclonal antibodies (mAb) has revolutionized the way we treat the disease.From cancer to autoimmunity,antibody therapy has been responsible for some of the most impressive clinical responses observed in the last 2 decades.A key component of this success has been their generally low levels of toxicity,and unique mechanisms of action.These two facets have allowed them to be integrated rapidly into clinical practice in combination with conventional radio- and chemo-therapies and to avoid the resistance mechanisms typically observed with classical small molecule drugs,such as upregulation of drug efflux transporters,dysregulation of apoptosis and mutations in key target enzymes/pathways.Although success with mAb therapies has been impressive,they are also subject to their own resistance mechanisms.In this perspective we discuss the various ways in which mAb therapeutics can be inhibited,concentrating mainly on the ways in which they can be removed from the target cell surface-a process called modulation.This can be achieved either in a cis-fashion on a single cell or in trans,precipitated by engagement with a second phagocytic cell.The evidence for each of these processes will be discussed,in addition to possible therapeutic strategies that might be employed to inhibit or reverse them.

Therapeutic monoclonal antibodies；Fc gamma receptor；Internalization；Shaving；Immunotherapy；CD20

2016-06-06

1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050019；2.石家莊市第五醫(yī)院，石家莊 050021；3.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，抗體藥物研制國家重點實驗室，石家莊 050015

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201701029