基于RSM法優(yōu)化黑果腺肋花楸多酚提取工藝及抗氧化活性研究

高凝軒,李 斌,*,劉 輝,孟憲軍,矯馨瑤,雷 月,張 野,劉 元,陳世富,高 峰,劉志強(qiáng)

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866; 2.沈陽綜合保稅區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧沈陽 116001; 3.遼寧省富康源黑果腺肋花楸科技開發(fā)有限公司,遼寧海城 114200; 4.遼寧天惠農(nóng)業(yè)科技有限公司,遼寧鳳城 118100)

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基于RSM法優(yōu)化黑果腺肋花楸多酚提取工藝及抗氧化活性研究

高凝軒1,李 斌1,*,劉 輝2,孟憲軍1,矯馨瑤1,雷 月1,張 野1,劉 元1,陳世富3,高 峰3,劉志強(qiáng)4

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,遼寧沈陽 110866; 2.沈陽綜合保稅區(qū)出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧沈陽 116001; 3.遼寧省富康源黑果腺肋花楸科技開發(fā)有限公司,遼寧海城 114200; 4.遼寧天惠農(nóng)業(yè)科技有限公司,遼寧鳳城 118100)

確定了黑果腺肋花楸多酚的最佳提取工藝,并測(cè)定其抗氧化活性。以超聲波輔助提取,對(duì)乙醇濃度、液料比、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),在此基礎(chǔ)上以提取量為指標(biāo),利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件;通過對(duì)DPPH、ABTS及超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定,評(píng)價(jià)其多酚類物質(zhì)的抗氧化活性。結(jié)果表明:黑果腺肋花楸多酚最佳提取條件為液料比44∶1 (mL∶g)、乙醇濃度55%、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間90 min,在此條件下黑果腺肋花楸多酚提取量達(dá)19.549 mg/g。黑果腺肋花楸多酚對(duì)DPPH、ABTS及超氧陰離子自由基有較強(qiáng)清除作用,并與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系,說明其多酚具有良好的抗氧化活性。

黑果腺肋花楸,多酚,響應(yīng)面法,抗氧化

黑果腺肋花楸,又名野櫻莓、不老莓,屬薔薇科,原產(chǎn)于北美地區(qū),果實(shí)為深藍(lán)色小漿果,呈圓形,可用于加工果汁、果酒、果醬、罐頭、果脯等食品和飲料,是一種具有極高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新興小漿果[1-2]。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明,黑果腺肋花楸果實(shí)中富含黃酮、花青素和酚酸等多酚類物質(zhì),且多酚含量是目前已知植物果實(shí)中含量最高的,每100 g黑果腺肋花楸鮮果中所含多酚可達(dá)到2050～2560 mg沒食子酸當(dāng)量[3]。Bohkyung Kim等人[4]通過對(duì)黑果腺肋花楸與9種黑莓、3種樹莓、9種黑加侖、4種紅加侖等漿果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),黑果腺肋花楸中總酚的含量是其他漿果的數(shù)倍,而花青素含量也明顯高于以上幾種漿果[5]。黑果腺肋花楸多酚組成主要為原花青素聚合物及花青素,分別占總酚含量的66%和25%,綠原酸與新綠原酸含量占總酚含量的7.5%。研究表明,其多酚具有很強(qiáng)的清除自由基、降血脂、降血糖和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能[6]。

超聲波輔助提取技術(shù)作為一項(xiàng)新型的天然產(chǎn)物輔助溶劑提取技術(shù),與傳統(tǒng)提取工藝相比,利用超聲波所產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動(dòng)、高加速度及強(qiáng)烈的空化效應(yīng)可加速提取成分進(jìn)入溶劑,極大的提高提取率,縮短提取時(shí)間,避免長(zhǎng)時(shí)間熱處理對(duì)提取物質(zhì)的影響[7]。本實(shí)驗(yàn)以黑果腺肋花楸凍果為原材料,利用超聲波輔助提取黑果腺肋花楸多酚,運(yùn)用福林酚比色法測(cè)定多酚提取率,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化黑果腺肋花楸中多酚物質(zhì)的最佳提取工藝條件。同時(shí)通過黑果腺肋花楸多酚進(jìn)行體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn),分析黑果腺肋花楸多酚對(duì)DPPH、ABTS及超氧陰離子自由基的清除能力,評(píng)價(jià)其抗氧化活性[8-9]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于黑果腺肋花楸的食用研究正處于起步階段,對(duì)其中多酚類物質(zhì)的提取及抗氧化活性的研究相對(duì)較少,該實(shí)驗(yàn)旨在為黑果腺肋花楸多酚類物質(zhì)的相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)提供參考,并為黑果腺肋花楸多酚更多藥理作用的后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果腺肋花楸凍果,采自于遼寧省海城富康源黑果腺肋花楸科技開發(fā)有限公司,挑選出無病蟲害和機(jī)械損傷且成熟度一致的黑果腺肋花楸富康源1號(hào)果實(shí),清洗瀝干后速凍,并于-80 ℃超低溫冰箱中凍藏;維生素C標(biāo)準(zhǔn)品,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;一水合沒食子酸,福林酚試劑,無水碳酸鈉,無水乙醇,Tris,鹽酸,鄰苯三酚,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,過硫酸鉀,ABTS均為分析純。

SB25-12DTN超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;BSA224S分析天平SARTORIUS;JYL-C012九陽料理機(jī) 九陽股份有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;V5800紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑果腺肋花楸多酚類物質(zhì)的超聲波輔助提取 將黑果腺肋花楸凍果放置常溫解凍,使用料理機(jī)打漿。準(zhǔn)確稱取5.00 g黑果腺肋花楸果漿倒入燒杯,加入一定體積的乙醇溶液,將燒杯密封,在超聲波條件下加溫提取多酚類物質(zhì)。抽濾后,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,在40 ℃下蒸發(fā)除去乙醇,將提取液避光密封保存待測(cè)。

1.2.2 總酚的測(cè)定 總酚的測(cè)定采用福林酚比色法,使用一水合沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品。分別加入1 mL 50%福林酚試劑、3 mL 7.5%碳酸鈉溶液和5 mL蒸餾水,避光顯色2 h后于765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,以吸光度(y)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得線性回歸方程,利用公式(1)計(jì)算樣品中多酚含量(mg/g)[10]。

式(1)

式中:C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的質(zhì)量濃度mg/mL;V為待測(cè)提取液體積mL;N為提取液稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量g。

1.2.3 超聲波輔助提取黑果腺肋花楸總酚提取的單因素實(shí)驗(yàn) 取黑果腺肋花楸凍果,在常溫下解凍,打漿備用。選取提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度和液料比4個(gè)因素作為單因素實(shí)驗(yàn),以超聲波輔助提取過濾后,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去乙醇,測(cè)定多酚含量分別考察各單因素對(duì)多酚含量的影響[11]。

1.2.3.1 提取溫度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 精確稱取7份5 g黑果腺肋花楸果漿,分別放入燒杯,按40∶1 mL∶g液料比加入55%乙醇溶液,分別在30、35、40、45、50、55、60 ℃下,使用超聲波輔助提取90 min,出去濾渣及乙醇后,分別測(cè)定不同提取溫度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響。

1.2.3.2 乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 精確稱取7份5 g黑果腺肋花楸果漿,分別放入燒杯,按40∶1 mL∶g液料比加入乙醇溶液,乙醇濃度分別為40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%,使用超聲波輔助提取90 min,提取溫度設(shè)為40 ℃,除去濾渣及乙醇后,分別測(cè)定不同提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花秋多酚提取的影響。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 精確稱取5份5 g黑果腺肋花楸果漿,分別放入燒杯中,按40∶1 mL∶g液料比加入55%乙醇溶液,使用超聲波輔助提取,提取溫度設(shè)為40 ℃。分別提取30、60、90、120、150 min,除去濾渣及乙醇后,分別測(cè)定不同乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響[12]。

1.2.3.4 液料比對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 精確稱取8份黑果腺肋花楸果漿,分別放入燒杯中,加入55%乙醇溶液,液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1 mL∶g。使用超聲波輔助提取90 min,提取溫度設(shè)為40 ℃,除去濾渣及乙醇,分別測(cè)定不同液料比對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選擇對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取具有顯著性影響的單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[13],根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇液料比(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)三個(gè)單因素,以多酚得率為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),確定黑果腺肋花楸中多酚的最佳提取條件,實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見表1[14]。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因子與水平

Table 1 Variables and levels in response surface design

因素水平-101X1液料比(mL∶g)35∶140∶145∶1X2乙醇濃度(%)505560X3提取溫度(℃)404550

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

1.2.5.1 黑果腺肋花楸多酚清除DPPH自由基的測(cè)定 DPPH自由基抗氧化活性測(cè)定的方法參照MoLyneux 等人的方法略有改進(jìn),精確配制20、40、60、80、100 μg/mL黑果腺肋花楸多酚溶液及維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液待測(cè)。移取0.1 mL多酚溶液于1.9 mL的DPPH乙醇溶液中(0.1 mmol/L),避光反應(yīng)5 min,于517 nm處測(cè)定吸光度Ai;使用0.1 mL乙醇代替多酚待測(cè)液,同法操作,測(cè)定吸光度值A(chǔ)0;使用1.9 mL乙醇代替DPPH乙醇溶液,分別加入0.1 mL不同濃度的多酚待測(cè)液,同法操作,測(cè)得吸光度值A(chǔ)i0。使用相同方法測(cè)定維生素C對(duì)DPPH自由基的清除能力作為對(duì)照組[15]。

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(Ai-Ai0)]/A0×100

1.2.5.2 黑果腺肋花楸多酚清除ABTS自由基的測(cè)定 配制140 mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/L的ABTS溶液,并移取88 μL過硫酸鉀溶液與5 mL ABTS溶液混合制得ABTS母液,于室溫避光條件下靜置。使用蒸餾水稀釋ABTS母液至734 nm波長(zhǎng)下吸光值在0.700～0.720范圍內(nèi),并將此吸光值記為A0。精確配制20、40、60、80、100 μg/mL黑果腺肋花楸多酚溶液及維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液。使用旋渦震蕩器將0.1 mL多酚溶液與1.4 mL ABTS工作液混勻,室溫避光條件下反應(yīng)6 min,于734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)i。使用相同方法測(cè)定維生素C對(duì)ABTS自由基的清除能力作為對(duì)照組。

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100

1.2.5.3 黑果腺肋花楸多酚清除超氧陰離子自由基的測(cè)定 使用鄰苯三酚自氧化體系評(píng)價(jià)黑果腺肋花楸多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。為避免溫度條件影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,實(shí)驗(yàn)所需試劑均放置于25 ℃水浴中保溫。精確配制20、40、60、80、100 μg/mL黑果腺肋花楸多酚溶液及維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液待測(cè),移取0.2 mL多酚溶液于5.7 mL Tris-HCl緩沖液中(50 mmol/L,pH8.20),并加入0.1 mL鄰苯三酚溶液(6 mmol/L)后漩渦混合。在320 nm波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)物吸光值(時(shí)間掃描模式)。反應(yīng)進(jìn)行至6 min,測(cè)定反應(yīng)物的吸光度值A(chǔ)i;使用蒸餾水代替鄰苯三酚作為對(duì)照,同法操作,測(cè)定吸光度值A(chǔ)i0。使用等體積蒸餾水代替黑果腺肋花楸多酚溶液,作為自氧化對(duì)照組,同法操作,測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。使用相同方法測(cè)定維生素C對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力作為對(duì)照組。

超氧陰離子自由基清除能力(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)處理3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010進(jìn)行整理和制圖,并采用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,顯著性水平為p<0.05。同時(shí)采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 由圖1可知,隨著溫度的增加,多酚含量呈先增高后降低的趨勢(shì),當(dāng)提取溫度達(dá)到45 ℃時(shí),多酚提取量顯著高于其他提取溫度(p<0.05)。這是由于隨著溫度的升高,使細(xì)胞壁滲透性增強(qiáng),同時(shí)也使得多酚的擴(kuò)散速率及溶解度增加,進(jìn)而提高多酚的提取效率[16]。但當(dāng)溫度超過45 ℃時(shí),隨著溫度的增加,由于溫度過高引起多酚類物質(zhì)降解,化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞,使得多酚提取量顯著下降[17]。因此選擇提取溫度40～50 ℃,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖1 提取溫度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on polyphenols yield注：標(biāo)注不同字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖4同。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 由圖2可知,乙醇濃度對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取具有顯著影響(p<0.05)。在乙醇濃度40%～55%的范圍內(nèi),隨乙醇濃度的增加,多酚提取量呈上升趨勢(shì),并在55%時(shí)出現(xiàn)最大值。而后隨著乙醇濃度的增加,多酚提取量顯著下降。這是由于多酚在植物中常與蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過氫鍵的形式結(jié)合[18],低濃度的乙醇不足以破壞氫鍵結(jié)構(gòu),或破壞程度不夠,而高濃度乙醇會(huì)降低溶劑極性[19]。當(dāng)乙醇濃度為55%時(shí),溶劑極性與黑果腺肋花楸多酚最為接近,因此選擇乙醇濃度50%～60%,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 由圖3可知,提取時(shí)間在30～90 min時(shí),隨時(shí)間的增加,多酚含量逐漸增加,并在90 min時(shí)出現(xiàn)最大值。而后,隨著提取時(shí)間的增加,多酚含量逐漸減小(p>0.05)。這說明在90 min時(shí),多酚已經(jīng)被充分提取[20]。隨著處理時(shí)間的增加,使得其中一部分多酚被氧化、分解,導(dǎo)致多酚提取量逐漸下降[21]。由于不同提取時(shí)間下多酚提取量差異并不顯著(p>0.05),因此在后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中,提取時(shí)間選為90 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響Fig.3 Effect of ultrasound treatment time on polyphenols yield

2.1.4 液料比對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響 由圖4可知,液料比對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取存在顯著性差異(p<0.05),在液料比10∶1～40∶1的范圍內(nèi),隨液料比的增加,多酚提取量顯著上升,并在液料比為40∶1時(shí)出現(xiàn)最大值。當(dāng)液料比超過40∶1后,隨液料比的增加,多酚提取量開始下降。表明當(dāng)液料比達(dá)到40∶1時(shí)多酚類物質(zhì)已全部溶出,隨著液料比的加大,果渣中糖類與脂類物質(zhì)的溶出影響了多酚類物質(zhì)的提取[22]。因此選擇液料比35∶1～45∶1進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖4 液料比對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on polyphenols yield

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選擇三個(gè)對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取具有顯著性影響的三個(gè)單因素(p<0.05)進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇液料比(X1)、乙醇濃度(X2)、提取溫度(X3)3個(gè)單因素,以多酚含量為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),中心實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差,結(jié)果見表2。其中1～12號(hào)實(shí)驗(yàn)為析因?qū)嶒?yàn),13～17號(hào)實(shí)驗(yàn)為中心實(shí)驗(yàn)。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

實(shí)驗(yàn)號(hào)液料比(mL∶g)乙醇濃度(%)提取溫度(℃)多酚含量(mg/g)1-1-101494021-10150653-110177994110160315-10-115523610-1159627-1011855181011751690-1-1128331001-117108110-1115876120111571213000207921400020764150002047416000212151700021053

通過Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合并進(jìn)行方差分析,得出二次回歸模型:Y=20.86-0.28X1+0.99X2+0.78X3-0.47X1X2-0.37X1X3-1.11X2X3-1.70X12-3.20X22-2.27X32。其方差結(jié)果見表3。

由表3可知,除液料比、液料比與乙醇濃度的共同作用項(xiàng)、液料比與溫度的共同作用項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值影響不顯著外,方程中其他各項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響均達(dá)到極顯著水平。其各因素對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取量影響順序?yàn)?乙醇濃度(X2)>提取溫度(X3)>液料比(X1)。

表3 黑果腺肋花楸多酚提取量的二次回歸模型方差分析表

Table 3 Analysis of variance for each term of developed quadratic regression model

方差來源平方和自由度均方F值p值顯著性回歸模型10508911685273<00001?X1063106328301364X27871787355500006?X34851485219000023?X1X2090109040500842X1X3054105424501613X2X34931493222500022?X12121311213547900001?X2243201432019510<00001?X322177121779833<00001?失擬項(xiàng)122304150000769純誤差03340082總誤差1066316

圖5 各因素對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取量影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface for the effects of cross-interaction on extraction yield of polyphenols from aronia melanocarpa

注:*：差異極顯著(p<0.01)。

根據(jù)回歸模型,使用Design-Expert 8.0軟件制得響應(yīng)面分析圖和等高線圖。從響應(yīng)面分析圖中可清楚的看出各因素交互作用對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取量的影響。對(duì)多酚提取量影響越大的因素,其曲線走勢(shì)會(huì)相對(duì)越陡。在等高線圖中,各因素對(duì)多酚提取量的影響體現(xiàn)在其軸向等高線的密集程度上,軸向等高線越密集,說明該因素對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取量的影響越顯著[23]。通過比較圖5中響應(yīng)面分析圖與等高線圖可看出,乙醇濃度對(duì)多酚提取量影響最顯著,提取溫度對(duì)多酚提取量影響較為顯著,而液料比對(duì)多酚提取量的影響最弱。這也與之前方差分析的結(jié)果相吻合。

2.2.2 最佳條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0軟件分析得到最佳黑果腺肋花楸多酚提取工藝條件為:液料比44.49∶1 (mL∶g)、乙醇濃度55.37%、提取溫度45.40 ℃,此條件下多酚提取量的理論值為19.275 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可行性,將以上工藝條件調(diào)整為液料比44∶1 (mL∶g)、乙醇濃度55%、提取溫度45 ℃。根據(jù)此條件進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其理論值的可靠性,得黑果腺肋花楸多酚提取量平均值為19.549 mg/g,該實(shí)際值與理論值接近且穩(wěn)定,說明采用響應(yīng)面優(yōu)化法得到的最佳工藝條件可靠。

2.3 抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 黑果腺肋花楸多酚清除DPPH自由基的測(cè)定 如圖6所示,在20～100 μg/mL范圍內(nèi),黑果腺肋花楸多酚與VC對(duì)DPPH自由基的清除能力均隨濃度的上升而增大,基本呈正相關(guān)趨勢(shì)。當(dāng)濃度低于68 μg/mL時(shí),黑果腺肋花楸多酚對(duì)DPPH自由基的清除能力明顯高于VC;當(dāng)濃度高于68 μg/mL時(shí),VC對(duì)于DPPH自由基的清除能力高于黑果腺肋花楸多酚,隨質(zhì)量濃度的增加,差距逐漸加大。可知黑果腺肋花楸多酚對(duì)于DPPH自由基具有一定的清除能力,但相對(duì)于VC清除能力較弱。

圖6 DPPH自由基的測(cè)定Fig.6 DPPH free radical scavenging rates

2.3.2 黑果腺肋花楸多酚清除ABTS自由基的測(cè)定 如圖7所示,在20～100 μg/mL范圍內(nèi),黑果腺肋花楸多酚與VC對(duì)ABTS自由基的清除能力均隨濃度的上升而增大,總體上呈直線上升趨勢(shì)。但在相同質(zhì)量濃度下,黑果腺肋花楸多酚對(duì)于ABTS自由基的清除能力均高于VC。由此可知,黑果腺肋花楸多酚對(duì)ABTS自由基具有一定的清除能力,且清除能力顯著高于VC。

圖7 ABTS自由基的測(cè)定Fig.7 ABTS free radical scavenging rates

2.3.3 黑果腺肋花楸多酚清除超氧陰離子自由基的測(cè)定 如圖8所示,在20～100 μg/mL范圍內(nèi),黑果腺肋花楸多酚與VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力均隨濃度的上升而增大,總體上呈正相關(guān)趨勢(shì)。當(dāng)質(zhì)量濃度低于40 μg/mL時(shí),黑果腺肋花楸多酚與VC對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的上升增幅較大;當(dāng)質(zhì)量濃度高于40 μg/mL時(shí),對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力的增幅逐漸放緩。在相同的質(zhì)量濃度下,黑果腺肋花楸多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力略高于VC。

圖8 超氧陰離子自由基的測(cè)定Fig.8 Superoxide anion free radical scavenging rates

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)考察了液料比、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度4個(gè)因素對(duì)黑果腺肋花楸多酚提取量的影響,其影響順序?yàn)橐掖紳舛?提取溫度>液料比>提取時(shí)間。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面分析法得出黑果腺肋花楸多酚提取最佳工藝條件:液料比44∶1 mL∶g、乙醇濃度55%、提取溫度45 ℃條件下提取90 min。在此條件下多酚提取量可達(dá)到19.549 mg/g,與預(yù)測(cè)值十分接近,證明了響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的合理性,且對(duì)今后進(jìn)一步研究和實(shí)際生產(chǎn)具有一定的理論依據(jù)及實(shí)用價(jià)值。

通過測(cè)定黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)對(duì)DPPH、ABTS及超氧陰離子自由基的清除能力,其抗氧化能力與多酚質(zhì)量濃度基本呈正相關(guān)關(guān)系。與VC對(duì)照發(fā)現(xiàn),其清除自由基的能力在很大程度上高于VC。說明黑果腺肋花楸中多酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性,為其后續(xù)研究提供了參考,但其多酚組成及各組分含量還有待進(jìn)一步研究。

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Optimization of extraction process of polyphenols fromAroniamelanocarpaby response surface methodology and antioxidant activity evaluation

GAO Ning-xuan1,LI Bin1,*,LIU Hui2,MENG Xian-jun1,JIAO Xin-yao1,LEI Yue1, ZHANG Ye1,LIU Yuan1,CHEN Shi-fu3,GAO Feng3,LIU Zhi-qiang4

(1.Shenyang Agriculture University,Shenyang 110866,China; 2.Shenyang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenyang 116001,China; 3.Liaoning Fukangyuan Aroniamelanocarpa Technology Development Co. Ltd.,Haicheng 114200,China; 4.Liaoning Tianhui Agriculture Technology Co. Ltd.,Fengcheng 118100,China)

Objective:TodeterminetheoptimalextractiontechnologyofpolyphenolsfromAronia melanocarpa,andtodetermineitsantioxidantactivity.Methods:Byusingtheultrasonicassistedextractiontocarryoutsingle-factorexperimentofethanolconcentration,liquidratio,extractiontemperatureandextractiontime,basedontheexperimentalresultsobtained,RSM(ResponseSurfaceMethodology)wasusedtooptimizetheprocessconditions.BydeterminingthescavengingrateofDPPH,ABTSandsuperoxideanionfreeradical,itsantioxidantactivityofpolyphenolswasevaluated.Results:TheoptimalconditionsofextractingpolyphenolsfromAronia melanocarpaweretherawmaterialwitha44-foldvolumeof55%ethanol,extractiontemperature45 ℃,extractiontime,90min.ThescavengingeffectofpolyphenolsofAronia melanocarpaonDPPH,ABTSandsuperoxideanionwasstrong,andthescavengingcapitalwaspositivelyrelatedtothemassconcentrationofpolyphenols.Conclusion:TheamountofextractedpolyphenolsofAronia melanocarpawasupto19.549mg/gundertheoptimalconditions,andthepolyphenolshadstrongantioxidantcapacity.

aroniamelanocarpa;polyphenols;responsesurfacemethodology;antioxidantactivity

2016-04-01

高凝軒(1990-)，男，在讀碩士，研究方向：漿果深加工及功能性成分研究，E-mail：gaoningxuan1990@163.com。

*通訊作者:李斌(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：漿果深加工及功能性成分研究，E-mail：libinsyau@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(31671863);遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助(2014108)；沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)天柱山英才計(jì)劃項(xiàng)目資助(2014)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(201303073-04)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)19-0249-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.040