急性早幼粒細(xì)胞白血病小鼠動物模型建立的研究現(xiàn)狀

王藝潼 綜述 徐 雯 審校

急性早幼粒細(xì)胞白血病小鼠動物模型建立的研究現(xiàn)狀

王藝潼 綜述 徐 雯 審校

急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)是造血組織的一類惡性疾病。動物模型是探討人類相關(guān)疾病的重要工具。研究表明，APL小鼠模型可以通過轉(zhuǎn)基因、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)和白血病細(xì)胞移植的方法建立，且該三種方法建立的模型均可再移植。這些模型的建立為了解APL發(fā)病機(jī)制和療效研究奠定了基礎(chǔ)。判斷模型是否成功建立，可以通過血常規(guī)、血涂片和骨髓涂片檢查、免疫學(xué)、分子生物學(xué)及病理學(xué)的相關(guān)檢查完成。成功建立APL動物模型，可為研究人類APL發(fā)生、發(fā)展和評價藥物療效提供重要的實驗基礎(chǔ)及理論依據(jù)，從而有助于人們進(jìn)一步了解APL。

急性早幼粒細(xì)胞白血??；動物模型；FVB/NJ小鼠

急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)為急性髓細(xì)胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)M3型，是造血組織的惡性疾病。當(dāng)前對APL的研究已獲得很大成果，三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)和全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)聯(lián)合療法使患者的五年生存率升至95%。APL動物模型的建立有助于更全面地認(rèn)識白血病的本質(zhì)，為研究白血病的增殖、分化及其調(diào)控機(jī)制提供實驗依據(jù)，成為研究人類白血病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和評價某些藥物療效的極為重要的手段和工具，并且可作為探索白血病治療手段的重要方法。

1 APL概述

APL是AML的一種特殊類型，被法美英(France，American，Britain，F(xiàn)AB)協(xié)作組定義為AML-M3型[1]。APL以17號染色體上維A酸受體α(RARα)基因與15號染色體的早幼粒細(xì)胞白血病(PML)基因相互易位，即t(15；17)(q22；q21)而形成PML-RARα融合基因為主要特征[1-2]。PML-RARα融合蛋白可抑制早幼粒細(xì)胞的分化成熟，使血液系統(tǒng)中的成熟粒細(xì)胞減少，早幼粒細(xì)胞增多；使得PML抑制增殖和促進(jìn)凋亡的功能發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致增殖加快、凋亡減少，骨髓中異常早幼粒細(xì)胞的不斷增殖并大量堆積。

目前治療APL主要分為蒽環(huán)類藥物的傳統(tǒng)化療、ATRA誘導(dǎo)分化治療和砷劑的誘導(dǎo)凋亡治療三類。20世紀(jì)70年代哈爾濱醫(yī)科大學(xué)張亭棟教授等人率先使用ATO治療APL患者，并取得滿意療效[3]。多年實踐及大量實驗研究表明，ATO單劑治療APL的完全緩解(CR)率可高達(dá)85%～90%，同時可延長患者生存期，且不良反應(yīng)輕[1，4-5]。ATRA單劑治療APL，90%患者可獲得血液學(xué)緩解，但通常在數(shù)月后復(fù)發(fā)，再用ATRA無效且具有白細(xì)胞增多癥、維甲酸綜合征和維甲酸耐藥等弊端。而ATRA聯(lián)合蒽環(huán)類藥物為主的化療對于初診APL誘導(dǎo)治療有效，可使70%～75%的患者得到治愈。在保證療效情況下，使用ATO治療方案相比于ATRA聯(lián)合蒽環(huán)類藥物的化療方案，在經(jīng)濟(jì)上更能減輕患者負(fù)擔(dān)[6]。

2 APL小鼠模型

因小鼠在遺傳學(xué)與造血系統(tǒng)等方面與人類十分相似，且繁殖力強(qiáng)、生命周期短，因此選用小鼠作為研究人類白血病的實驗動物相對比較理想。目前建立小鼠APL模型的方法主要有以下三種：轉(zhuǎn)基因法、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)和移植APL白血病細(xì)胞。

2.1 APL轉(zhuǎn)基因小鼠模型

研究表明，將人類組織蛋白酶G(hCG)基因的質(zhì)粒進(jìn)行改造，在hCG基因的5′側(cè)翼區(qū)和第一外顯子間插入PML-RARα融合基因，使用相應(yīng)連接酶將PML-RARα和hCG連接，轉(zhuǎn)化，篩選可成功獲得含hCG-PML-RARα陽性基因的質(zhì)粒，經(jīng)酶切獲得hCG-PML-RARα轉(zhuǎn)基因構(gòu)件，將轉(zhuǎn)基因構(gòu)件hCG-PML-RARα通過顯微注射技術(shù)注入小鼠受精卵的雄性原核內(nèi)[7]，通過基因組DNA進(jìn)行PCR整合檢測hCG-PML-RARα轉(zhuǎn)基因小鼠，將獲得的陽性G0代轉(zhuǎn)基因小鼠與同品系正常小鼠交配得到F1代，即可構(gòu)建轉(zhuǎn)基因APL小鼠模型[8]。

在轉(zhuǎn)基因APL小鼠模型構(gòu)建過程中，在人組織蛋白酶G或遷移抑制因子相關(guān)蛋白8(MRP8)啟動子控制下表達(dá)PML-RARα，且在原始細(xì)胞向中幼粒細(xì)胞分化的過程中，活化的hCG啟動子和表達(dá)于髓系祖細(xì)胞和粒、單細(xì)胞分化過程中的hMRP8啟動子，可以有效地將原始細(xì)胞分化阻滯在早幼粒細(xì)胞階段[9]。對有明顯表征的小鼠可以通過外周血、骨髓象、病理學(xué)檢查以及使用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓細(xì)胞中融合基因的表達(dá)情況，結(jié)果證實hCG-PML-RARα轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了APL[7-8]。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠模型

APL的主要特征是染色體易位，累及的基因主要編碼轉(zhuǎn)錄因子為RARα轉(zhuǎn)錄因子家族。而17號染色體上的RARα基因融合到可變配偶體(如PML、PLZF、NPM、NuMA和STAT5B：X基因)，形成具有相同RARα部分的APL特異性融合蛋白的表達(dá)[10-11]。其中95%以上APL患者攜帶t(15；17)形成的PML-RARα融合基因，另有約2%患者攜帶t(11；17)形成的PLZF-RARα和RARα-PLZF基因。因APL的發(fā)生大多與PML-RARα融合基因有關(guān)，相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠模型都是基于PML-RARα融合基因，而PLZF-RARα基因的逆轉(zhuǎn)錄小鼠模型報道甚少[11-12]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建是建立逆轉(zhuǎn)錄病毒小鼠模型的第一步，是影響目的基因表達(dá)的關(guān)鍵因素[12]。研究表明，用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的以骨髓細(xì)胞為主的造血干細(xì)胞移植可建立三種模型：PML-RARα、PLZF-RARα和PLZF-RARα/RARα-PLZF[11，13-14]。即將PML-RARα、PLZF-RARα和PLZF-RARα/RARα-PLZF融合基因分別通過相應(yīng)酶切位點克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，構(gòu)建三種質(zhì)粒，而后經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備，將供體小鼠骨髓與逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液共培養(yǎng)，最后分別移植相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的小鼠骨髓細(xì)胞。經(jīng)鑒定這三種模型均可發(fā)生APL、可再移植且生存周期短，其中PLZF-RARα/RARα-PLZF最為典型，但對ATRA不敏感[15]。

2.3 移植APL細(xì)胞法

目前建立的多種腫瘤模型主要使用免疫缺陷動物，由于其免疫系統(tǒng)缺陷，異體移植的腫瘤成功率高，便于臨床研究。大量研究表明，目前建立APL小鼠模型大多使用重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(Severe combined immunodeficiency，SCID)或非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠[9，15-16]。SCID小鼠是由17號染色體隱性突變而來，1980年Bosma從C.B-17/lcr小鼠群中發(fā)現(xiàn)該突變。SCID小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的免疫缺陷癥狀，T、B淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺乏，導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫功能缺陷，并對外源性抗原不能產(chǎn)生抗體，也不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。而NOD/SCID小鼠相比于SCID小鼠，NK細(xì)胞缺陷，循環(huán)補(bǔ)體缺乏，是一種免疫缺陷更嚴(yán)重的實驗動物[16]。故選用免疫缺陷小鼠建立腫瘤模型成功率相對較高。在移植細(xì)胞的選擇上許多實驗室選用人源的NB4細(xì)胞(5×106～1×107/只)，經(jīng)尾靜脈注射至SCID小鼠體內(nèi)，從而建立APL小鼠模型[16-18]。因SCID小鼠仍存在一定的免疫功能，即存在NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，SCID小鼠建立模型之前，需要經(jīng)射線處理，使小鼠免疫系統(tǒng)損傷程度達(dá)到一致。若將小鼠分為照射組和非照射組，對比發(fā)現(xiàn)照射組小鼠更能模擬臨床白血病彌漫生長和累及器官的特點[9]。

目前為了研究藥物對APL作用的免疫學(xué)機(jī)制，則需要在免疫功能正常的小鼠中建立APL小鼠模型?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道，如果加大移植腫瘤細(xì)胞的注射劑量，可以用免疫功能正常小鼠成功建立模型[19-20]。研究顯示，用免疫功能正常小鼠建立模型所需要的白血病細(xì)胞劑量比SCID小鼠建模時所需的劑量要高100倍[14]。Pollock等在2005年的研究顯示，免疫功能正常小鼠(B6C3H)注射APL細(xì)胞(來源于表達(dá)PML-RARα基因的轉(zhuǎn)基因小鼠)的絕對致死劑量為104～106個細(xì)胞。細(xì)胞注射量為104時SCID小鼠的長期無白血病存活率為0，免疫功能正常小鼠為60%；細(xì)胞注射量為106時兩組小鼠無白血病存活率均為0[19]。有文獻(xiàn)報道，免疫功能正常的FVB/NJ小鼠注射同源的hMRP8-hPML-RARα APL轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟來源的APL細(xì)胞(1×104)，小鼠全部發(fā)病(潛伏期約為兩周)[20]。

3 模型鑒定

3.1 一般觀測指標(biāo)

據(jù)文獻(xiàn)報道[8-9，21]，小鼠若患APL，則出現(xiàn)體重下降、活動度下降、豎毛、皮膚潰瘍等變化，并常伴有精神萎靡、活動減弱、步態(tài)不穩(wěn)、行動緩慢等類似人白血病的癥狀，也可在腹腔內(nèi)觀察到實體瘤。

3.2 外周血檢查

Rego等[22]在2000年提出模型建成的輔助判斷標(biāo)準(zhǔn)，即外周血早幼粒細(xì)胞>1%；白細(xì)胞增多(白細(xì)胞>3×104/mm3)；貧血(血紅蛋白<10 g/dL)和/或血小板減少(血小板<5×105/μL)。

3.3 血涂片和骨髓涂片檢查

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查作為模型判定標(biāo)準(zhǔn)之一，可更為直觀反應(yīng)模型建立情況。其中APL小鼠血涂片標(biāo)準(zhǔn)為外周血中早幼粒細(xì)胞>1%[22]。血涂片中早幼粒細(xì)胞早期可占白細(xì)胞總量的1%～4%，后期占白細(xì)胞總量的3%～11%[23]。其中白細(xì)胞分類以異常早幼粒細(xì)胞為主，APL小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)明顯升高，粒系/淋巴系比例會明顯升高。APL小鼠骨髓涂片判斷標(biāo)準(zhǔn)為骨髓中早幼粒細(xì)胞≥30%。骨髓細(xì)胞分類以顆粒增多的早幼粒細(xì)胞為主，可高達(dá)60%～75%，紅系和淋巴系增殖受到抑制，紅系和巨核系均明顯減少[7-8]。

3.4 免疫學(xué)檢查

有文獻(xiàn)報道顯示[16，24-25]，使用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)病小鼠骨髓細(xì)胞CD33的陽性表達(dá)率高達(dá)90%，且特異性較高。尤其在白血病細(xì)胞浸潤的肝、脾、肺等臟器中，CD33均強(qiáng)表達(dá)。

3.5 分子生物學(xué)檢查

約95%的APL具有特異性的染色體易位t(15；17)(q22；q21)，此易位導(dǎo)致7號染色體上維A酸受體α(RARα)基因與15號染色體的早幼粒細(xì)胞白血病(PML)基因相互融合而形成PML-RARα融合基因。研究表明，取患病小鼠脾臟細(xì)胞，通過Western blot、RT-PCR等檢測方法，可在發(fā)病小鼠體內(nèi)檢測到PML-RARα融合基因的表達(dá)[12，16]。

3.6 病理學(xué)檢查

通過對瀕死APL小鼠相應(yīng)臟器進(jìn)行病理檢查，可見早幼粒細(xì)胞在肝、脾、骨髓等器官及組織內(nèi)浸潤增殖。其中脾臟的正常結(jié)構(gòu)被破壞，脾小結(jié)破壞，紅髓內(nèi)有大量早期粒細(xì)胞浸潤；肝臟內(nèi)組織結(jié)構(gòu)破壞，有散在灶狀分布的粒細(xì)胞浸潤，血管腔、血竇內(nèi)可見大量粒細(xì)胞；肺臟組織切片顯示肺泡塌陷，肺泡壁、肺血管內(nèi)可見許多粒細(xì)胞浸潤；骨髓腔變小，細(xì)胞的正常分布消失，可見有大量的早幼粒細(xì)胞[13，16，26]。

4 小結(jié)與展望

通過轉(zhuǎn)基因、逆轉(zhuǎn)錄病毒和細(xì)胞移植的方法可以建立APL小鼠模型，并通過相應(yīng)判定指標(biāo)來判斷模型是否成功建立。建立具有APL表型的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，可以從動物整體水平上證實PML-RARα融合蛋白對APL發(fā)生的作用[6]。在逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的APL小鼠模型中，小鼠均發(fā)生類似人白血病癥狀。相比于轉(zhuǎn)基因小鼠APL模型，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的小鼠APL模型周期短、耗時少，有利于白血病的克隆和移植的分析，并且可以檢測癌基因在不同的造血干細(xì)胞中的表達(dá)和影響[27]。細(xì)胞移植法建立的動物模型，具有經(jīng)濟(jì)簡便、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、成功率高的特點。由于免疫系統(tǒng)嚴(yán)重缺陷，SCID小鼠比免疫功能正常的小鼠更容易誘導(dǎo)致命的APL。但是，因SCID小鼠仍存在一定的免疫功能，建立腫瘤模型前需經(jīng)照射處理。SCID小鼠建立APL模型的研究較多，相對成熟。而使用免疫功能正常小鼠建立APL模型的研究較少，但因免疫系統(tǒng)健全，更適用于免疫學(xué)機(jī)制的相關(guān)研究。因此，建立APL動物模型能很好的模擬臨床APL發(fā)病特點，為研究藥物篩選和臨床治療提供良好的動物模型。

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Currentstatusoftheestablishmentofacutepromyelocyticleukemiainmousemodels

WANGYitong，XUWen

Department of Immunology，Harbin Medical University，Harbin 150086，China

Acute promyelocytic leukemia(APL)is a class of malignant disease of hematopoietic tissue.Animal models are important tools for exploring human-related diseases.Many studies have beer shown that APL mouse models can be established by transgenic，retroviral-mediated and leukemia cell transplantation.These models established by these three methods can be re-transplanted.The establishment of these models lays the foundation for understanding the pathogenesis and efficacy of APL.In order to determine whether the model is successfully established，these methods can be used for blood tests，blood smear and bone marrow smear，immunology，molecular biology and pathology related to complete the examination.Successful establishment of APL animal model can provide important experimental basis and theoretical basis for the study，development and evaluation of drug efficacy in APL，which will help people to understand human APL further.

Acute promyelocytic leukemia；Animal model；FVB/NJ mice

黑龍江省教育廳海外學(xué)人科研資助項目(1155h015)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室(哈爾濱 150086)

王藝潼，女，(1991-)，碩士研究生，從事免疫學(xué)的研究。

徐雯，E-mail：wenxu2006tokyo@163.com

R733.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.013

(收稿：2017-04-11)