慢性乙型肝炎抗病毒治療新進展

侯春艷 綜述，楊永峰 審校

慢性乙型肝炎抗病毒治療新進展

侯春艷 綜述，楊永峰 審校

慢性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒感染引起的、以肝臟炎癥和壞死病變?yōu)橹鞯囊环N全身性感染病。目前，治療乙型肝炎的抗病毒藥物主要包括干擾素和核苷酸類似物兩類。現(xiàn)在正在探索開發(fā)新藥及優(yōu)化聯(lián)合、免疫療法或凋亡療法（促進感染細胞凋亡）來徹底根除慢性HBV感染。

慢性乙型肝炎；抗病毒治療；進展

乙型肝炎病毒感染是人類主要的傳染病之一，目前全球已批準用于治療慢性乙型肝炎的藥物包括干擾素類（IFN）及核苷（酸）類似物（NA）。干擾素的主要作用是增強抗乙型肝炎病毒的特異性免疫應答和抗病毒蛋白，抑制HBV復制；核苷酸類似物則通過競爭性結合HBV聚合酶的逆轉錄酶結合位點，抑制逆轉錄酶活性，從而抑制病毒復制。國內外開展NA和IFN優(yōu)化及聯(lián)合治療，積極研發(fā)新型NA和針對病毒復制周期和感染環(huán)節(jié)抗HBV藥物。本文對近年抗乙型肝炎病毒治療新進展進行簡要介紹。

1 現(xiàn)有藥物的優(yōu)化、聯(lián)和及新型核苷（酸）類似物

1.1 NA優(yōu)化治療 NA通過競爭性結合HBV聚合酶的逆轉錄酶結合位點，抑制逆轉錄酶活性，同時阻止其延長，但長期服用可引發(fā)病毒突變產(chǎn)生的耐藥性，甚至引起更嚴重肝病，且治療周期長，停藥指征嚴格[1]。目前指南推薦選用高效、低耐藥的恩替卡韋和替諾福韋酯作為一線藥物。

1.2 NA+IFN序貫或聯(lián)合治療 IFN的主要作用是增強抗乙型肝炎病毒的特異性免疫應答和抗病毒蛋白，抑制HBV復制，抗肝纖維化，此類藥物并不能徹底清除病毒且復發(fā)率較高，治療效果因HBV基因型而異[2]。IFN和NA作用機制的不同決定兩者可序貫或聯(lián)合治療。2015年乙型肝炎抗病毒防治指南首創(chuàng)根據(jù)“路線圖概念”設計個體治療新策略，強調治療病毒早期應答的重要性。第24周應答療效差的病人搶先干預，調整后續(xù)治療方案（根據(jù)患者病情，加用NA/IFN序貫治療），使耐藥患者持久應答率升高。

1.3 新型核苷（酸）類似物

1.3.1 貝西福韋（besifovir） Besifor是一種新型的鳥嘌呤核苷單磷酸鹽類核苷類似物，化學結構與阿德福韋相似。一項Ⅱb期臨床試驗比較[3]，使用Besifor 90和150 mg/d和ETV 0.5mg/d治療96周，對初治的慢性乙型肝炎患者的療效差異無統(tǒng)計學意義。該藥不良反應有卡尼?。ㄈ舛緣A）的減少，但補充卡尼汀后恢復正常。目前已進入Ⅲ期臨床試驗。

1.3.2 十六烷氧丙基替諾福韋酯（bexadecyloxy propyl tenofovir，CMX157） CMX157是替諾福韋前藥，給藥后能轉化為天然脂類類似物，改善TDF口服生物利用度差特性，減少替諾福韋的血藥濃度，以減少潛在的腎毒性[4]。此藥Ⅰ期臨床試驗結果未發(fā)表，目前已進入Ⅱ期臨床試驗階段。

1.3.3 替諾福韋艾拉酚胺（tenofovir alafenamide，TAF） TAF（GS-7340）是一種替諾福韋磷酸化前藥。由于含有酚和丙氨酸異丙酯結構使其血漿穩(wěn)定性更好，進入HBV感染的細胞后還可保持最大程度的完整性[5]。當TAF進入肝細胞后，在羧酸酯酶1（CES1）等酶的作用下轉變?yōu)樘嬷Z福韋[6]，因CES1主要在感染HBV的肝細胞內表達，所以TAF治療乙型肝炎具有一定的靶向性。1b期臨床研究結果表明：TAF 25 mg的抗病毒效果與TDF300mg相當，病毒動力學結果也相似。該劑量的安全性較現(xiàn)在TDF安全性高，將以該劑量進行下一步臨床研究[5]。目前進入Ⅲ期臨床試驗階段。

1.3.4 十八烷氧乙基替諾福韋酯（octadecyl oxyethyl tenofovir，AGX-1009） 該藥是替諾福韋的十八烷氧乙基單酯衍生物，也是替諾福韋前藥，化學結構改變使其口服吸收率顯著上升[4]。已進行Ⅰ期臨床試驗，試驗結果尚未發(fā)表。

2 針對HBV生命周期各靶點的新藥

2.1 入胞抑制劑 代表藥物：Myrcludex；Cyclosporin A&B；Oxysterols。HBV入胞由細胞表面特異性分子（受體）介導，通過直接穿過細胞質膜或細胞吞噬作用而進入細胞內。HBV的宿主特性及嗜肝性與肝細胞受體有關，病毒入侵肝細胞的關鍵部位是表面抗原前S1區(qū)，與其特異性結合的受體是一種膽汁酸受體（鈉離子?；悄懰峁厕D運多肽，NTCP），NTCP與?；谋砻婵乖禺愋越Y合，為乙型肝炎及丁型肝炎的功能性受體。通過NTCP與膽汁酸底物結合，可以抑制HBV的攝取，反之NTCP與?；疕BsAg特異性結合促進HBV入胞[7]。

Myrcludex B是一種來源于HBsAg的LHBs preS1域的合成脂多糖。?；陌被幔╝a）2-48 pre-S1域的L蛋白已被證明能夠有效地阻止乙型肝炎病毒和丁肝病毒感染肝細胞，其機制可能是通過參與一個未知的細胞成分,最有可能是病毒受體，即促進NTCP與膽汁酸底物結合[8]。Myrcludex B已通過1期臨床試驗[9]。在2a期臨床試驗研究Myrcludex B證實HBV DNA劑量呈劑量依賴性下降，對于丁型肝炎病毒（HDV）合并感染同樣有效，安全和耐受性良好。

Myrcludex（藥物名）B,環(huán)孢菌素A和其他底物類似物通過NTCP抑制膽汁鹽運輸。因此，這些分子可能提高血清中膽汁鹽和其他運送基質水平，臨床需要監(jiān)測。此類藥物防止感染新的肝細胞,將來有希望用于聯(lián)合抗病毒方案中。

2.2 抑制cccDNA形成及穩(wěn)定性 cccDNA是病毒轉錄的模板，使HBV感染持續(xù)存在，所以目前眾多新藥物選擇cccDNA作為作用的靶點。雙鏈cccDNA相當穩(wěn)定，到目前為止，只能通過裂解感染細胞、抑制轉錄因子及使cccDNA退化去除肝毒性等方法。

cccDNA轉錄是由大量表觀遺傳因素控制，包括H3和H4組蛋白，HBc和HBx蛋白，轉錄因子包括CREB、ATF，STAT1和STAT2，染色質修飾酶[10]。另外可通過抑制/綁定調節(jié)組蛋白乙酰化作用進而控制[11]。一些化合物可以抑制/綁定這些因素，可能被用來對抗乙型肝炎病毒，但這些因素也參與正常細胞過程中，細胞毒性是一個真正的風險。乙型肝炎病毒感染細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（HepG2和HepAD38細胞系）最終可能用于cccDNA目標抗病毒藥物的高通量篩選。目前開發(fā)藥物有EML2M（抑制p300和PCAF組蛋白乙酰轉移酶活性），MC2791（刺激hSirt1/2脫乙酰酶活性）和MC3119（抑制JMJD3組蛋白脫甲基酶活性）[12]。

高劑量IFN-α（500或1000 IU/ml）和中等劑量的腫瘤壞死因子超家族成員淋巴毒素D受體（LTbR）激動劑可以促進HBV感染肝細胞內cccDNA降解。其機制可能是通過上調細胞核APOBEC（載脂蛋白 B mRNA編輯酶催化多肽）3A及3B胞嘧啶核苷脫氨酶的表達，而APOBEC3A與HBV核心蛋白、cccDNA結合，最終因胞嘧啶脫氨導致cccDNA的降解，而且對人體基因組DNA并沒有影響[13]。

2.3 抑制HBV基因表達 針對病毒轉錄和翻譯過程的小分子干擾RNA【siRNA（代表藥物ARC520）】，RNA干擾（RNAi）是指真核細胞針對外來的雙鏈小RNA（dsRNA）誘發(fā)的對外來dsRNA轉錄的mRNA高效特異性降解現(xiàn)象，又稱轉錄后基因沉默，是細胞的自我保護機制。1998年在利用外來dsRNA調節(jié)線蟲基礎的功能時，發(fā)現(xiàn)導入外源性基因未能取得想要的改變，就此首次發(fā)現(xiàn)真核細胞有轉錄后基因沉默功能[14]。基于siRNA這種沉默目標基因的特異性，而且對其他基因的作用無交叉作用，采用病毒mRNA上符合內部穩(wěn)定的序列作為靶點，與活躍RNAi和其觸發(fā)器連接合成并篩選出高效的siRNA片段，后期通過載體遞送到感染HBV的靶細胞中，可達到沉默病毒基因的目的[15]。

RNA干擾技術發(fā)展限制包括siRNA的毒性（過量的siRNA誘發(fā)更強烈的免疫反應及導致與非目標mRNA不完全互補配對的概率增加）、脫靶效應（siRNA引起非目標基因的非特異性沉默，引起細胞的凋亡或生長抑制，考慮與非目標基因不完全互補配對所致）、免疫刺激（激活機體天然免疫系統(tǒng)）、傳送問題（外源性siRNA導入細胞的效率很低）?，F(xiàn)在通過選擇合適劑量，化學修飾，納米顆粒傳送等方式提高其效率及安全。siRNA是很有希望的一項技術，在病毒性疾病的研究中應用廣泛，前景可觀[16]。

ARC-520是由一個黏附在N．乙酰葡糖胺配體上的膜溶解肽和兩個靶點為HBV mRNA的小分子干擾RNA（siRNA）組成的復合物，通過日漸成熟的 DPCs（Dynamic PolyConjugates）輸送系統(tǒng)，以mRNA為目標，現(xiàn)由Arrowhead公司生產(chǎn)，通過膽固醇靶向配體至靶細胞發(fā)揮作用。ARC-520通過成熟的輸送系統(tǒng)人工導入細胞的dsRNA，而dsRNA作用機制目前被廣泛接受的分起始階段和效應階段。在起始階段，dsRNA在核酸酶（Dicer酶：核酸內切酶III家族的一員）作用下切割成21～23 nt siRNA。在效應階段與siRNA Agohaute 2（AGO2）蛋白酶等通過復雜的組裝和催化下結合，形成RNA誘導的沉默復合物（RISC），隨后解旋形成單鏈含siRNA的RISC，又稱有活性的RISC?；罨腞ISC與目標mRNA分子依最高優(yōu)先序列互補反義結合，抑制基因表達[17]。

ARC-520研究進展。前期小鼠實驗證實單一注射RNAi可有效減少3-4log病毒DNA載量及病毒s、e抗原。在對黑猩猩實驗上，與對照組相比，實驗組HBV-DNA、HBsAg和HBeAg水平減少90%-95%。而在迄今為止到2a期的臨床藥物應用上沒有出現(xiàn)任何不良反應。目前加用3mg的劑量，安全性和耐受性和前兩組一樣安全且效果表現(xiàn)良好[18]。siRNA治療作用于cccDNA減少病毒DNA載量，但不能實現(xiàn)病毒的清除。免疫治療是打破免疫耐受，調動機體免疫功能，清除病毒，但其有效作用的先決條件是減少病毒載量。故而也有建議采用聯(lián)合免疫治療[19]。

2.4 衣殼抑制劑 HBV DNA的合成是在病毒的核衣殼。核衣殼的作用包括保護HBV基因組免受降解，并介導病毒基因組的釋放。乙型肝炎病毒的核殼化過程是有病毒P蛋白的前基因組RNA（pgRNA）在HBV多聚酶作用下表達核心蛋白HBcAg形成核衣殼的過程。該類藥物作用于pgRNA逆轉錄前的衣殼化階段，其阻礙衣殼化成熟和穩(wěn)定過程，從而抑制病毒的有效復制。衣殼抑制劑目前包括heteroaryldihydropyrimidines（HAPs）和phenylpropenamides兩類。HAPs誘導核心蛋白錯誤裝配，而Phenylpropenamides類加速沒有前基因組RNA和逆轉錄酶的空心衣殼形成，兩者達到乙型肝炎病毒復制的不穩(wěn)定組裝。HAPs代表藥物有Bay41-4109和GLS4。Phenylpropenamides代表藥物是AT-61及AT-130[20-22]。

HAP類藥物作用機理的最新研究顯示是結合到裝配過程中形成的多聚體核心蛋白，導致其錯誤裝配，從而達到抗HBV的效果。體外實驗研究證實，Bay 41-4109和GLS4能夠有效地抑制一些對拉米夫定和阿德福韋耐藥的HBV毒株[23]。

Phenylpropenamides阻止HBV pgRNA的核殼化、細胞核內DNA的復制和細胞外病毒顆粒的成熟，進而抑制HBV的復制[22，23]。研究顯示，AT-61和AT-130不僅能抑制野生型HBV，還能抑制對拉米夫定耐藥的HBV毒株[24]。

3 免疫療法

免疫療法包括治療性疫苗及免疫調節(jié)劑。抑制病毒復制藥物，可能在清理感染肝細胞證明并無良好效果。因此，消除cccDNA池仍然有挑戰(zhàn)。因此包括免疫治療方法的聯(lián)合治療可能是必要的。

3.1 免疫性疫苗 免疫性疫苗的理論基礎：1、在慢性乙型肝炎攜帶者身上建立強大的CD4+和CD8+T細胞反應，消除被感染的肝細胞；2、誘導B細胞反應，中和病毒釋放傳染肝細胞，以防止現(xiàn)存幼稚肝細胞的再次感染[25]。免疫性疫苗包含蛋白類疫苗、DNA疫苗、其他疫苗等。

蛋白類疫苗的主要原理是將HBV衣殼蛋白經(jīng)修飾后接種給患者，誘發(fā)較強的特異性細胞免疫，激活B淋巴細胞和CD4T細胞應答。目前研究熱點有亞單位疫苗、抗原抗體復合物疫苗和基于表位的多肽疫苗。包括ClaxoSmithKIine生物公司（重組HBsAg與AS02B液體佐劑）、NASVAC（HBs蛋白和HBe蛋白連用）。乙型肝炎表面抗原抗體復合物疫苗是由適當比例的HBsAg-HBIG組成的復合物，抗原呈遞細胞（APC）吸收后通過FC受體，將HBsAg有效遞呈給T細胞使機體對乙型肝炎病毒有效反應[26]。目前實驗以HBsAg-HBIG復合物用明礬作為佐劑免疫原性復雜（YIC）測試：三期臨床試驗的450名慢性乙型肝炎病毒是無效的，實驗組經(jīng)過12針注射只有14.0%的血清轉化，對照組明礬單獨注射實現(xiàn)21.9%血清轉化。III期臨床實驗失敗，考慮使用疫苗過度刺激，機體免疫疲勞反而導致其有效性下降。而多次注射明礬可能刺激炎癥反應和先天免疫反應導致其治療效果，具體不詳[27]。

DNA疫苗是將HBV抗原蛋白的相應DNA序列重組成為真核表達質粒，導入機體后不斷產(chǎn)生質粒編碼抗原，誘導機體產(chǎn)生免疫反應。其能夠誘發(fā)Th1型細胞介導CTL細胞毒反應，而且該疫苗生產(chǎn)相對簡單且成本低，但導入質粒表達水平低仍是重大問題。目前有巴斯德所研發(fā)的pCMV—s2．S表達載體DNA疫苗、韓國浦項（Pohang）科技大學開發(fā)HBl00 DNA疫苗、Oxxon Therapeutics Ltd開發(fā)的安卡拉痘病毒載體DNA疫苗。目前通過體內電穿孔的質粒DNA（EP），大大提高疫苗誘導能力[28]。然而目前有研究結果顯示DNA疫苗并沒有明顯改善特異性T淋巴細胞應答及抗病毒療效，其作用效果與患者一般狀況、肝病嚴重程度、HBV感染階段、甚至HBV DNA水平、以前的治療等多方面有關[29]。

其他治療性疫苗。GS4774，重組酵母疫苗表達乙型肝炎病毒S，核心，HBx融合蛋白。研究在健康的志愿者表示，三個劑量的10個酵母單位每月給耐受性良好，引起HBV特異免疫反應[30]。

3.2 免疫調節(jié)劑 免疫調節(jié)劑包括模式識別受體Toll樣受體激動劑（TLRS）、PD1和其他共抑制阻滯劑、HBV特異性修改T細胞。

TLRS。模式識別受體Toll樣受體激動劑（TLRS）是促進慢性乙型肝炎病毒患者建立足夠的HBV特異性免疫應答一個重要環(huán)節(jié)。該受體為病原識別受體，激活自然殺傷細胞和細胞毒性T細胞的啟動，限制感染擴散、促進先后天性免疫應答[31]。在黑猩猩實驗中發(fā)現(xiàn)口服的toll樣受體激動劑receptor-7（gs -9620）有長期抑制乙型肝炎病毒慢性感染作用。在為期十周的治療中，發(fā)現(xiàn)HBV-DNA定量下降2.2 log水平，而于肝細胞活檢發(fā)現(xiàn)HBsAg、HBeAg水平下降，且乙型肝炎病毒感染肝細胞數(shù)量下降[32]。

PD1（Programmed Death-1）和其他共抑制阻滯劑。因為乙型肝炎病毒持久性、病毒控制被解釋為T細胞疲憊的結果。PD1與CTLA-4一樣（與B7家族結合）作為T細胞活化協(xié)同刺激（第二）信號的陰性選擇，即抑制T細胞活化。而且PD1和PDL1（存在腫瘤細胞表面）結合后是腫瘤發(fā)生免疫逃逸機制的一部分。通過封鎖PD1可提高第二信號陽性選擇，促進T細胞活化及提高腫瘤細胞的免疫。PD1單克隆抗體是以PD1為抗原的人工生產(chǎn)的特異性抗體，與PD1特異性結合，封鎖PD1功能。PD1單克隆抗體作為抗癌明星，有研究提示在癌癥治療領域通過PD1封鎖恢復T細胞活化及提高抗腫瘤免疫力，延長腫瘤病人的生存期[33]。在土撥鼠肝炎病毒（Woodchuck Hpatitis Virus）感染旱瀨的模型中，采用恩替卡韋抗病毒28周，于12周加用DNA疫苗（WHcAg-WHsAg復合物）聯(lián)合治療到24周，加PDL1單克隆抗體三針，與其他三組比較，三聯(lián)療法治療有效增強T細胞特異性免疫和抑制病毒復制[34]。在該實驗發(fā)現(xiàn)單用PDL1單克隆抗體沒有任何增強T細胞特異性免疫和抑制病毒復制的能力，具體機制不詳。

HBV特異性T細胞免疫。這種治療方法旨在提供轉基因T細胞和消除HBV感染的肝細胞。目前技術來說，個體差異及受體配體的免疫排他性可能限制這種方法的臨床應用，而且該法的安全性也受到質疑。新興技術的嵌合抗原受體（CAR）能生成一個細胞外表達的嵌合受體。對于乙型肝炎病毒，目標可能是細胞表面的HBsAg和高親和性anti-HBs的單鏈可變片段。即通過將識別乙型肝炎表面蛋白和胞內信號域（免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM）在體外進行基因重組,生成重組質粒,再通過轉染技術轉染到患者的T細胞，使患者T細胞表達乙型肝炎表面蛋白受體，轉染后經(jīng)過純化和大規(guī)模擴增后的T細胞，稱之為嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）[35]。HBV感染CAR-T細胞的肝細胞可以觸發(fā)增殖或激活信號啟動有效T細胞反應。這種策略被應用于乙型肝炎病毒動物模型，但該法存在脫靶效應（見前RNAi解釋），需要嚴密細胞毒性，能否實現(xiàn)CHB患者的病毒清除還有待觀察[36]。

4 Birinapant

Birinapant是一種SMAC（second mitochondria-derived activator of caspases）模擬拮抗劑，拮抗cIAP作用，對cIAP1最有效，能刺激和恢復抗病毒免疫，以根除慢性HBV感染。凋亡抑制因子（IAPs）是一類高度保守的內源性抗細胞凋亡因子家族，主要通過抑制Caspase活性和參與調解核因子NF-κB的作用而抑制細胞凋亡。在科學家采用慢性HBV感染免疫功能正常的小鼠模型中明確細胞凋亡抑制蛋白（cIAPs）抑制TNF信號在乙型肝炎感染，其限制感染肝細胞死亡，從而使病毒持續(xù)存在。同時相關數(shù)據(jù)表示拮抗cIAPs功能可促進HBV感染的細胞死亡，促進清除[37]。

目前有研究提示合成和天然（Smac和Grim）IAP拮抗劑通過cIAP1拮抗作用殺死敏感腫瘤細胞，導致NF-kB激活，使 TNFa生產(chǎn)和通過增強 TNF-R1殺死腫瘤細胞[38]。Birinapant清除感染的機制是減少老鼠的不能應對乙型肝炎病毒CD4+T細胞及促進TNF生成及他們的化學作用。乙型肝炎病毒感染的動物實驗中，與恩替卡韋聯(lián)用，birinapant促進HBsAg的清除和獲得HBsAb，并能夠提高抗病毒核苷模擬，以減少病毒DNA產(chǎn)量。該藥通過促進感染肝細胞的死亡，從而清除在肝臟的儲藏的乙型肝炎病毒DNA，促進消除病毒[39]。該藥對細胞特異性選擇方面目前沒有證據(jù)，在劑量遞增階段IB/IIA乙型肝炎試驗birinapant在第一次給藥組觀察出現(xiàn)后顱神經(jīng)麻痹。該嚴重的安全問題迫使國內停止在I期乙型肝炎的藥物試驗招生。

5 結語與展望

近年來對乙型肝炎的發(fā)病機制和病理認識的不斷深入，治療更全面，目前治療多著重于HBV生命周期階段的清除，免疫療法，新技術支持治療方面。在未來五到十年里，功能性治療乙型肝炎將不是人類遙遠的夢想。

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（收稿：2016-03-25）

（本文編輯：朱傳龍）

Antiviral therapy for chronic hepatitis B

Hou Chunyan，Yang Yongfeng.Department of Liver Diseases,Nanjing Second Hospital，Medical School，Affiliated to Southeast University，Nanjing 210009，Jiangsu Province，China

Chronic hepatitis B is caused by hepatitis B viral infection.It is a systemic infections mainly including inflammation and necrosis lesions of liver.At present，antiviral drugs to treat hepatitis B mainly include two categories，e.g.interferon and nucleotide analogues.Now，scholars are exploiting new agents，the optimization of combination therapy，immune or apoptosis therapy to eradicate chronic HBV infection.

Chronic hepatitis B；Antiviral therapy；Progress

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.01.035

210000南京市 東南大學醫(yī)學院感染病學研究生（侯春艷）；附屬第二醫(yī)院肝病科（楊永峰）

侯春艷，女，25歲，碩士研究生，主要從事病毒性肝炎等肝臟病防治研究

楊永峰 E-mail：yyf1997@163.com