關(guān)于體外光化學(xué)療法與器官移植研究進(jìn)展

楊紹臻，杜國(guó)盛（解放軍第309 醫(yī)院全軍器官移植研究所肝膽外科，北京 100091）

1 前 言

體外光化學(xué)療法（extracorporeal photopheresis， ECP）是一種細(xì)胞治療方法，由Edelson于1986年第一次提出并且首次應(yīng)用于皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，隨后廣泛應(yīng)用于T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病治療［1］。目前，ECP作為一種新型療法已廣泛應(yīng)用于包括心、肺在內(nèi)的多種同種異體移植物抗宿主排斥反應(yīng)疾病中［2］。ECP的應(yīng)用前景廣闊，被認(rèn)為是一種新型免疫調(diào)節(jié)療法，與抗排異藥物相比，它的應(yīng)用具有不良反應(yīng)少、安全性高、應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。本文將近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)ECP在器官移植方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 作用機(jī)制

體外光化學(xué)療法由3部分組成：① 從患者濃縮的白細(xì)胞中收集單核細(xì)胞；② 在8-甲氧基補(bǔ)骨脂素（8-methoxypsoralen， 8-MOP）存在的情況下，用長(zhǎng)波紫外線即紫外線A（ultraviolet A， UVA）照射收集的單核細(xì)胞；③ 將光照后的細(xì)胞重新回輸?shù)酵换颊唧w內(nèi)［3］。

8-MOP屬呋喃香豆素類(lèi)化合物，最早用于治療白癜風(fēng)，現(xiàn)與UVA聯(lián)合應(yīng)用于ECP治療。未經(jīng)UVA照射時(shí)，8-MOP作為一種DNA插入分子處于惰性狀態(tài)。當(dāng)暴露于UVA （320～400 nm）時(shí)，8-MOP被激活并插入兩DNA之間與核酸堿基形成共價(jià)鍵。當(dāng)UVA光照持續(xù)存在時(shí)，另一個(gè)共價(jià)鍵在DNA反向鏈的胸腺嘧啶核苷與另一側(cè)的8-MOP之間形成，從而產(chǎn)生一種多聚體交聯(lián)產(chǎn)物并啟動(dòng)凋亡［4］。細(xì)胞凋亡或程序性細(xì)胞死亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)，該反應(yīng)早期啟動(dòng)的凋亡包括線粒體功能的破壞，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比例的反向逆轉(zhuǎn)。遲發(fā)凋亡包括CD95、FasL水平升高［5］。通過(guò)上述機(jī)制加速細(xì)胞凋亡。

與淋巴細(xì)胞的反應(yīng)相反，單核細(xì)胞似乎對(duì)由ECP治療導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有抵抗性。單核細(xì)胞被激活并釋放細(xì)胞激素，如白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［6］。最近一項(xiàng)研究表明，ECP可以減少被治療的單核細(xì)胞變異成不成熟的DC細(xì)胞。同時(shí)，不成熟的DC細(xì)胞也會(huì)失去他們?cè)贓CP之后因脂多糖刺激而成熟的能力［7］。研究表明，CD36標(biāo)志物會(huì)在單核細(xì)胞表面大量擴(kuò)增，而且CD36為攝取凋亡物質(zhì)的主要受體，這也同時(shí)說(shuō)明ECP治療可以提高細(xì)胞清除率［8］。

Daniele等［9］對(duì)13例被診斷為慢性移植物抗宿主病的患者應(yīng)用ECP治療，通過(guò)流式分析儀對(duì)其血液樣本進(jìn)行分析，證實(shí)了ECP治療可使光敏化的單個(gè)核細(xì)胞的壞死及凋亡率顯著升高?；剌敽蟮牡蛲黾?xì)胞將被抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）吞噬，后者被激活并在其表面表達(dá)抗原，隨后產(chǎn)生抗炎因子IL-10，并促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）的產(chǎn)生［10-11］。在 ECP治療中進(jìn)一步的免疫變化為 CD81［12］和 Th17［11］細(xì)胞數(shù)量減少，可溶性的IL-2-Ra和TNF-a R1水平減少［13］，分泌γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的Th1細(xì)胞會(huì)減少80%以上；另一方面分泌 IL-4、IL-5、 IL-10的 Th2細(xì)胞增多［14］。這一系列變化可導(dǎo)致Th1/Th2水平的恢復(fù)和CD4/CD8比值的正?；?5］。通過(guò)上述機(jī)制會(huì)降低移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生率。

3 ECP在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.1 肺移植：肺移植是一種針對(duì)終末期呼吸衰竭患者的有效治療方法［16］，并且在近15年的時(shí)間內(nèi)顯著提高了呼吸衰竭患者的生存率。慢性同種移植物功能紊亂也被稱(chēng)作閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrom，BOS），它是威脅接受肺移植患者長(zhǎng)期生存和生活質(zhì)量的主要因素。1995，年Andreu等［17］第一次創(chuàng)造性的將ECP治療應(yīng)用于肺移植后急性排斥反應(yīng)（acute rejection，AR）與嚴(yán)重感染的治療，3周后患者的臨床癥狀得到改善。

Jaksch等［18］隨訪了1989-2010年1 012例肺移植患者，其中194例患者平均（1 293±1 008）天發(fā)展為BOS，51例患者接受了ECP治療，研究發(fā)現(xiàn)，接受ECP治療的患者中有31例患者通過(guò)ECP治療，在超過(guò)6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出持續(xù)穩(wěn)定的肺功能。與未經(jīng)ECP治療的患者相比，接受ECP治療的患者生存率提高且再移植發(fā)生率低（P=0.001）。此項(xiàng)研究證實(shí)了早期應(yīng)用ECP對(duì)于肺移植后患有BOS的患者是一項(xiàng)有效的輔助治療。

Greer等［19］于2013年回顧性分析了自2007年10月1日- 2011年9月1日通過(guò)ECP治療慢性移植后肺功能障礙（chronic lung allograft dysfunction，CLAD）的患者，其中65例被納入此項(xiàng)研究，此外，64例在接受阿奇霉素治療的情況下病情仍持續(xù)惡化。經(jīng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，其中8例患者的第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volumn one second，F(xiàn)EV1）提高≥10%，27例患者FEV1處于穩(wěn)定狀態(tài)，30例患者FEV1下降≥10%，且經(jīng)過(guò)ECP治療的患者生存率較未經(jīng)ECP治療的患者明顯提高（401天比133天）。此研究證實(shí)了ECP治療可作為一種有效的二線治療方法，廣泛應(yīng)用于CLAD患者治療中。

Brownback等［20］通過(guò)統(tǒng)計(jì)患者FEV1值來(lái)評(píng)價(jià)ECP對(duì)肺部移植物抗宿主排斥反應(yīng)的治療效果。此項(xiàng)研究共納入8例患者，且8例患者均為肺移植后新發(fā)氣道阻滯疾病且接受糖皮質(zhì)激素治療后FEV1值仍持續(xù)下降。8例患者接受ECP治療并記錄1年FEV1值的變化情況。在ECP治療的最初3個(gè)月，其中7例患者FEV1未繼續(xù)下降。然而1年后，只有2例患者FEV1值穩(wěn)定在正常范圍內(nèi)。盡管通過(guò)1年的ECP治療，患者FEV1的平均值仍會(huì)繼續(xù)下降，但與未接受ECP治療的患者相比，接受ECP治療后FEV1下降率會(huì)大幅度減小。經(jīng)過(guò)1年ECP治療，所有8例患者全部存活且期間內(nèi)潑尼松的平均用藥量明顯減少。此研究表明，ECP能明顯降低肺移植患者FEV1的下降率。

3.2 心臟移植：心臟移植是治療各種原因?qū)е碌男呐K疾病的有效方法［21］。根據(jù)最新國(guó)際心肺移植協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，在2011年已經(jīng)有超過(guò)4 000例心臟移植［22］。有超過(guò)25%接受心臟移植的患者會(huì)在1年內(nèi)出現(xiàn)AR，其中約有5%的患者會(huì)出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)損害［23］。1992年第一次報(bào)道了ECP療法應(yīng)用于心臟移植患者治療，此項(xiàng)報(bào)道也最早闡述了接受2 ～ 4次ECP治療后，通過(guò)快速活組織檢查可發(fā)現(xiàn)AR發(fā)生了逆轉(zhuǎn)［24］。

1998年，Barr等［25］在多個(gè)研究中心開(kāi)展了一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)。在此次研究中，60例心臟移植患者在移植后隨機(jī)接受三聯(lián)免疫抑制治療，或是三聯(lián)免疫抑制治療并在移植30小時(shí)內(nèi)進(jìn)行ECP治療。隨訪6個(gè)月顯示，ECP（第1個(gè)月接受10次治療，第2個(gè)月和第3個(gè)月接受4次治療，第4 ～ 6個(gè)月接受2次治療）會(huì)明顯減少心臟排斥的發(fā)生率（P=0.03）。第一次出現(xiàn)排斥發(fā)作的時(shí)間并無(wú)明顯差別，排斥反應(yīng)的發(fā)生率與血流動(dòng)力學(xué)異常或6個(gè)月、12個(gè)月的生存率有關(guān)。而用PCR檢測(cè)血漿中巨細(xì)胞病毒DNA含量，發(fā)現(xiàn)其含量值在ECP治療組有明顯降低（P=0.036）。這項(xiàng)研究表明，ECP治療并不會(huì)促進(jìn)免疫移植患者感染的發(fā)生，反而起到抑制作用。

2006年，Kirklin等［26］的回顧性研究對(duì)13年來(lái)的心臟移植排斥經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了總結(jié)。研究包括36例患者有血流動(dòng)力學(xué)異常（hemodynamic compromise，HC）或頑固性排斥反應(yīng)，接受了至少3個(gè)月的ECP治療，307例未接受ECP治療。通過(guò)對(duì)生存率及危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的ECP治療，排斥反應(yīng)發(fā)生率降低（P=0.04），而且隨后的排斥反應(yīng)危害也顯著降低。這是第一個(gè)證實(shí)ECP治療可減少有高排斥風(fēng)險(xiǎn)患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的研究。

2009年，Zheng 等［27］探究了DC細(xì)胞吞噬經(jīng)體外光化學(xué)療法（psoralen combined with A-band ultraviolet，PUVA）處理的脾淋巴細(xì)胞（sp）后對(duì)心臟移植大鼠外周血Treg細(xì)胞及移植后大鼠存活率的影響。此實(shí)驗(yàn)以DA大鼠為供體，Lewis大鼠為受體。取DA大鼠脾細(xì)胞通過(guò)PUVA處理后與受者DC細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，獲得PUVA-SPDC。分別建立：① 對(duì)照組（n=7）：注射PBS；② SPDC組（n=8）：注射受者SP與受者DC共培養(yǎng)細(xì)胞；③ PUVA-SPDC組：注射PUVA-SP細(xì)胞與DC共培養(yǎng)細(xì)胞（n=8）。研究發(fā)現(xiàn)，PUVA-SPDC組外周血Treg細(xì)胞占CD4+T的比例為（29.00±1.73）%，明顯高于對(duì)照組的 （12.00±0.58） %和SPDC組（16.30±0.88）%。流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)分析表明，SPDC組表面分子CD80、CD86以及OX6的表達(dá)分 別 為（16.60±0.72）%、（36.50±0. 87）% 及（65.60±1.45）%明顯高于PUVA-SPDC組CD80、CD86以及OX6的表達(dá)分別為（3.90±0.12）%、（13.40±0.59）%及（28.00±1.73）%，該結(jié)果表明PUVA-SPDC可提呈供者抗原的imDC細(xì)胞。由此推論，PUVA-SPDC可以誘導(dǎo)移植物受者對(duì)供者抗原特異性負(fù)向免疫調(diào)節(jié)。

在另一項(xiàng)研究調(diào)查中，有7例心臟移植患者接受了超過(guò)6個(gè)月的ECP治療。其中6例患者患有慢性左心室功能不全，經(jīng)ECP治療后心功能得到明顯改善，1例患者發(fā)生復(fù)發(fā)性抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)（antibody mediated rejection，AMR），經(jīng)ECP治療后未再次發(fā)生［28］。此外， 群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody，PRA）的平均峰值由（83±17）%降至（38±42）%（P=0.022），經(jīng)ECP治療后炎性細(xì)胞因子同時(shí)也顯著下降。

3.3 腎移植：2011年，Kusztal等［29］將 ECP治療與常規(guī)的免疫抑制劑治療聯(lián)合應(yīng)用，作為一種預(yù)防性的治療手段，并將此方法應(yīng)用于10例腎移植術(shù)后患者，通過(guò)與單純應(yīng)用免疫抑制劑治療的10例腎移植術(shù)后患者對(duì)比做出一項(xiàng)驗(yàn)證性研究。ECP治療組在2.5個(gè)月接受12 ～ 16次治療，ECP治療組與對(duì)照組均定期復(fù)查腎小球?yàn)V過(guò)率（glomerular filtration rate，GFR），定期記錄外周血 T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、Treg細(xì)胞、NK細(xì)胞等計(jì)數(shù)值。研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，ECP治療組在第3個(gè)月（53±11比47.1±9.0； P=0.17）和第6個(gè)月（67.5±10.0比53.6±3.0； P=0.03）GFR值顯著升高。Treg細(xì)胞（CD3+CD4+CD25+）占總CD3細(xì)胞數(shù)的比值在接受3個(gè)月ECP治療后顯著升高。與對(duì)照組相比，ECP治療組患者外周血Treg比例明顯升高〔（9.4±15.0）% 比（3±1）%，P=0.01）〕。雖然該研究患者病例數(shù)少，研究隨訪時(shí)間短，但可得出初步結(jié)論：ECP可作為早期輔助治療來(lái)減少腎移植排異反應(yīng)發(fā)生率。

3.4 肝移植：Urbani等［30］評(píng)估了鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（calcineurin inhibitor，CNI）與不同種免疫抑制劑聯(lián)應(yīng)用后神經(jīng)性腎毒性并發(fā)癥的發(fā)生率。從2006年1月-10月，對(duì)所有腎臟或神經(jīng)學(xué)并發(fā)癥的肝移植受者進(jìn)行了ECP+嗎替麥考酚酯+類(lèi)固醇以及CNI治療，并將其與使用標(biāo)準(zhǔn)的CNI治療的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比。ECP組包含24例患者，他們的終末期肝病的平均評(píng)分為（19.9±11.1）分。對(duì)照組包含18例患者，平均評(píng)分為（12.5±5.2）分 （P=0.012），對(duì)于ECP組，肝移植后開(kāi)始應(yīng)用CNI的平均水平為（9.2±6.2）天 （4～31天）。在第一次CNI治療后，ECP組中5例患者分別在移植后第4、5、6、6、14天出現(xiàn)急性神經(jīng)性中毒性腎損害。ECP組患者在第1、6、12個(gè)月的生存率分別為100%、95.8%、95.8%，對(duì)照組患者的生存率分別為94.4%、77.7%、72.2% （P＜0.001）?？傊?，ECP治療對(duì)于控制CNI引起的病癥有效，并且可降低早期移植術(shù)后階段的病死率。

4 總結(jié)與展望

已有大量研究證實(shí)ECP作為一種輔助治療，應(yīng)用于移植術(shù)后患者，可抗排異反應(yīng)發(fā)生從而降低患者病死率。然而關(guān)于ECP治療仍存在很多問(wèn)題，如ECP治療的最佳應(yīng)用時(shí)間、停用時(shí)間、如何監(jiān)控治療情況以及是否可以替代藥物治療等，也未有相關(guān)研究指出患者應(yīng)用ECP治療的適應(yīng)證。此外，長(zhǎng)期應(yīng)用ECP治療對(duì)患者是否有害。針對(duì)上述問(wèn)題，各研究機(jī)構(gòu)仍未得到一致的答案。因此，盡管ECP治療已取得令人鼓舞的臨床治療效果，但其有關(guān)作用機(jī)制還未明確，還需大量研究，從而制定出更完善的治療方案。