術(shù)前供者特異性抗體分層分析在致敏腎移植患者中的應(yīng)用

趙杰，付迎欣，馮剛，莫春柏（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植重點實驗室，天津 300192）

腎移植是治療終末期腎病首選和有效手段［1-2］。高致敏患者體內(nèi)預(yù)存的供者特異性抗體（donor specific antibody，DSA）是術(shù)后早期發(fā)生抗體介導(dǎo)排斥（antibody mediated rejection，AMR）和移植腎失功的主要危險因素［3］。致敏患者術(shù)前等待合適供體時間長，因此，準(zhǔn)確判斷患者術(shù)前抗體水平和類別非常重要。目前采用的單抗原磁珠法檢測人類白細(xì)胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）抗體方法比傳統(tǒng)的交叉反應(yīng)敏感性高［4］，能在交叉反應(yīng)陰性的患者或者脫敏治療后交叉反應(yīng)轉(zhuǎn)陰的患者中檢測到DSA［5］。采用敏感的單抗原磁珠法檢測HLA抗體，術(shù)前確定不能接受的供者抗原，減少了AMR的發(fā)生風(fēng)險［6］。然而也有應(yīng)用該方法檢測到術(shù)前存在DSA的患者成功進行了移植的報道［7-8］。并且單抗原磁珠法檢測DSA的熒光強度的閾值尚不統(tǒng)一，各移植中心報道的與抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)熒光強度的閾值為3 000～10 000不等［9-11］。在淋巴細(xì)胞毒陰性的患者中應(yīng)用敏感的單抗原磁珠法檢測到的預(yù)存DSA對腎移植的影響報道尚不統(tǒng)一［12］。因此，有必要對應(yīng)用單抗原磁珠法檢測到的術(shù)前預(yù)存的DSA進行危險性分層分析，增加高致敏患者接受腎移植的機會。

本研究通過回顧性分析致敏腎移植患者術(shù)前預(yù)存DSA對臨床結(jié)果的影響，進一步分層分析DSA抗體的類別及平均免疫熒光強度（mean fluorescent intensity， MFI）與預(yù)后的關(guān)系，從而增加高致敏患者接受腎移植的機會。

1 材料與方法

1.1 研究對象：回顧性分析2011年1月-2014年1月天津市第一中心醫(yī)院30例術(shù)前致敏的腎移植患者，其中男性13例，女性17例，平均年齡（45±12）歲。酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測術(shù)前群體反應(yīng)性抗體（panel reactive antibody， PRA）水平均大于20%。其中二次腎移植患者17例。親體腎移植2例，其余均為尸體腎移植。24例術(shù)前接受脫敏治療，其中15例二重濾過，9例蛋白A免疫吸附。術(shù)前淋巴細(xì)胞毒交叉配合實驗陰性。

1.2 Luminex技術(shù)檢測術(shù)前HLA抗體：脫敏治療患者留取脫敏治療后血清，其余留取術(shù)前血清，凍存于-20℃冰箱。將待測血清12 000 rpm〔（8 000～10 000）×g〕離心15分鐘，在96孔板中每孔中加入2 μl微珠，然后每孔加入14 μl磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS）?？字屑尤?7 μl血清樣本，樣本 1：3 稀釋后總體積為 21 μl，混勻。室溫避光孵育30分鐘，孵育結(jié)束后，每孔加入180 μl Labscreen洗液清洗3次。每孔加入50 μl二抗，混勻。室溫避光孵育30分鐘，二次孵育后，3 500 rpm（1 500×g） 離心5分鐘，清洗2次后，每孔加入60 μl PBS，混勻后將樣本轉(zhuǎn)移到讀板中，上機讀取結(jié)果。將讀取到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入HLA Fusion軟件分析結(jié)果。

檢測結(jié)果以MFI表示，大于1000為陽性，其中1 000＜MFI＜8 000定義為輕至中度陽性，MFI≥8000定義為強陽性，將檢出陽性的抗體位點與供者HLA位點進行比對，分析是否為DSA。

1.3 AMR的診斷：移植后根據(jù)患者的臨床癥狀、體征、實驗室檢查指標(biāo)、移植腎病理表現(xiàn)，C4d結(jié)果，進行綜合判斷。

1.4 免疫誘導(dǎo)方案及AMR的治療：所有患者均采用兔抗人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白（1.5 mg/（kg·d），共用4天），甲強龍術(shù)中1 000 mg， 術(shù)后3天之內(nèi)為500 mg/d。診斷為AMR后給予血漿置換4次+甲潑尼龍沖擊治療（500 mg，3 天）

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)前DSA與術(shù)后AMR結(jié)果（表1）：30例PRA陽性患者中，22例（占73.3%）患者術(shù)前存在DSA，其中單純Ⅰ類抗體陽性9例， 單純Ⅱ類抗體陽性7例，Ⅰ、Ⅱ類抗體均為陽性6例。含有Ⅰ類強陽性（MFI≥8 000）DSA的患者有7例，Ⅱ類強陽性（MFI≥8 000）DSA的患者10例。術(shù)前DSA陽性患者中有10例（占45.5%）術(shù)后早期發(fā)生AMR。而8例術(shù)前DSA陰性患者術(shù)后均未發(fā)生AMR。術(shù)前DSA陽性組與DSA陰性組在受者年齡、術(shù)前PRA水平、HLA錯配、冷缺血時間、移植腎功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）、急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)（acute cellular rejection，ACR）、1年移植腎存活率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 對術(shù)前DSA陽性患者進行分層分析（表2）：根據(jù)術(shù)后早期是否發(fā)生AMR，將術(shù)前DSA陽性的22例患者分為2組，比較兩組的臨床資料。受者性別、 受者年齡、 移植次數(shù)、 HLA錯配數(shù)、 冷缺血時間、PRA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。AMR陽性組Ⅰ類DSA MFI值高于AMR陰性組（11 504±4 494比 5 205±3 786，P=0.012），而兩組Ⅱ類DSA MFI值分別為 13 814±4 481、11 066±4 920，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.362）。AMR陽性組和AMR陰性組Ⅰ類強陽性DSA（MFI ≥8 000）患者比例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （75%比14.3%，P=0.04）。而兩組之間Ⅱ類強陽性DSA患者差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （100%比66.7%， P=0.497）。

表1 DSA陽性組與DSA陰性組患者基線資料

表2 AMR陽性組與AMR陰性組各項指標(biāo)差別

2.3 術(shù)前Ⅰ類強陽性DSA對術(shù)后AMR的預(yù)測價值：術(shù)前含有Ⅰ類強陽性DSA患者有7例，其中6例（占85.7%）發(fā)生AMR，而術(shù)前Ⅰ類DSA輕至中度陽性（1 000＜MFI＜8 000）8例患者中有2例（占25%） 發(fā)生AMR，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.04）。術(shù)前Ⅰ類強陽性DSA預(yù)測AMR的敏感度為75%，特異度為85.7%，陽性預(yù)測值為85.7%，陰性預(yù)測值為75%。

2.4 預(yù)后：術(shù)前DSA陽性的22例患者中，3例因AMR導(dǎo)致移植腎失功，這3例均有Ⅰ類強陽性的DSA。1例術(shù)后9個月死于肺感染，1例因腎周感染行移植腎切除術(shù)，1例死于腦出血，術(shù)后1年的移植腎存活率為72.7%。8例術(shù)前DSA陰性的患者中，1例因移植腎周感染、移植腎動脈破裂出血行移植腎切除術(shù)，術(shù)后1年移植腎存活率為87.5%。

3 討 論

高致敏患者移植后發(fā)生急性AMR的風(fēng)險高，仍為移植界的難題，盡管近來有多種脫敏方案，但效果仍然不理想，急性AMR的發(fā)生率為20%～50%［7］。目前大多數(shù)移植中心是通過檢測受者PRA及補體依賴的細(xì)胞毒性試驗（complement dependent cytotoxicity， CDC）來判斷受者體內(nèi)的致敏狀況， CDC交叉反應(yīng)陽性是腎移植的絕對禁忌證。而CDC陰性患者中，采用敏感的單抗原磁珠法檢測到的術(shù)前預(yù)存的DSA的臨床相關(guān)性仍存在爭論［12］。因此，評價高致敏患者體內(nèi)預(yù)存抗體情況，例如抗體類別、抗體強度等與術(shù)后AMR以及預(yù)后的相關(guān)性至關(guān)重要。

大多數(shù)研究認(rèn)為，術(shù)前預(yù)存的DSA是術(shù)后發(fā)生AMR的危險因素，術(shù)前DSA陽性患者的預(yù)后比DSA陰性患者差。然而也有研究顯示，在淋巴毒陰性的患者中，術(shù)前有沒有DSA，急性排斥反應(yīng)、DGF，1年的移植物存活沒有顯著差別［13］。另外一項大型的回顧性研究表明，移植腎丟失與單抗原磁珠法檢測到的抗HLA抗體沒有相關(guān)性［14］。說明不是所有應(yīng)用單抗原磁珠法檢測到的DSA都有同樣的臨床作用，不同類別和不同強度的DSA可能發(fā)揮不同作用，分析原因可能是IgG抗體存在不同的亞型（IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4），IgG1/IgG3 能結(jié)合補體，而IgG2/ IgG4結(jié)合補體的能力差。

Mujtaba等［5］報道了 DSA 的 MFI值是預(yù)測AMR較好的指標(biāo)。發(fā)生AMR組Ⅰ類DSA比例高，與MFI＜9 500組相比，MFI＞9 500組具有更高的AMR發(fā)生率和更差的3年移植腎存活率。DSA的MFI值大于9 500預(yù)測AMR的敏感度為94%，特異度為76%。同樣Gloor等［15］報道DSA的MFI＞10 000比低水平的DSA具有更高的AMR的發(fā)生率。而這些研究沒有關(guān)于抗體類別與術(shù)后抗體介導(dǎo)排斥反應(yīng)發(fā)生的報道。本組研究發(fā)現(xiàn)AMR陽性組與AMR陰性組相比，Ⅰ類DSA的MFI、強陽性的Ⅰ類DSA比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而Ⅱ類DSA差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明Ⅰ類DSA具有更大的危害性。強陽性的Ⅰ類DSA預(yù)測AMR的敏感度為75%， 特異度85.7%，陽性預(yù)測值為85.7%。

因此筆者認(rèn)為在淋巴細(xì)胞毒陰性的患者中術(shù)前應(yīng)用單抗原磁珠法檢測到DSA不是腎移植的絕對禁忌證，而是一個危險因素，應(yīng)該進一步的分層分析。為致敏患者選擇供體時，應(yīng)該術(shù)前對預(yù)存的HLA抗體進行危險性分層分析，一定要避開Ⅰ類強陽性的HLA位點，可以大大降低術(shù)后AMR的發(fā)生，同時可減少高致敏患者等待時間。

本研究為小樣本、回顧性研究，并且隨訪期短，存在一定的局限性，需進一步多中心、大樣本、長期的深入研究。應(yīng)用單抗原磁珠法檢測HLA抗體具有重要的作用，有利于高致敏患者尋找合適供體，減少術(shù)后AMR。