結(jié)核分枝桿菌H37Rv蛋白Rv2364c的表達(dá)純化與生物信息學(xué)分析

徐宛玲，付陳增

結(jié)核分枝桿菌H37Rv蛋白Rv2364c的表達(dá)純化與生物信息學(xué)分析

徐宛玲，付陳增

目的 在大腸桿菌中表達(dá)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv2364c蛋白，為研發(fā)抗結(jié)核分枝桿菌的藥物提供材料。方法 PCR擴(kuò)增目的基因Rv2364c。將PCR產(chǎn)物克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Rv2364c。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)中，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析柱純化，并對該蛋白做生物信息分析。結(jié)果 雙酶切和基因測序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了含有Rv2364c基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。SDS-PAGE結(jié)果顯示，目的蛋白在大腸桿菌中得到了大量表達(dá)，經(jīng)鎳親和層析柱純化后目的蛋白的純度達(dá)到了90%以上。生物信息學(xué)分析表明Rv2364c為穩(wěn)定酸性蛋白，α-螺旋和無規(guī)卷曲為其主要二級結(jié)構(gòu)元件，主要結(jié)構(gòu)域類型有Era結(jié)構(gòu)域和KH結(jié)構(gòu)域兩種。結(jié)論 成功表達(dá)和純化了Rv2364c蛋白，并利用生物信息學(xué)方法初步預(yù)測其結(jié)構(gòu)域等，為進(jìn)一步研究Rv2364c在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌H37Rv；Rv2364c；轉(zhuǎn)染；生物信息分析

結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染者約占全球總?cè)丝诘?/3，其中約有5%～10%的患者會發(fā)展成活動性肺結(jié)核，從而導(dǎo)致每年約150萬人的死亡，目前結(jié)核病已成為全球最致命的傳染病之一[1]。耐藥菌的出現(xiàn)及HIV合并感染使得控制這種疾病變得非常困難，據(jù)報(bào)道，2015年約有9.7%的患者表現(xiàn)出了對多種抗生素的耐受[2]，因此迫切需要研發(fā)新型抗結(jié)核藥物、疫苗和診斷方法。Mtb致病株H37Rv中Rv2364c發(fā)現(xiàn)較晚，目前對其研究較少。本研究克隆、表達(dá)和純化Rv2364c蛋白，并對其理化性質(zhì)等進(jìn)行了分析預(yù)測，希望能為研發(fā)新的抗結(jié)核藥物提供幫助?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組(NC_000962.3)中Rv2364c的序列，在其上下游設(shè)計(jì)一對引物，引物由生工生物公司合成。載體pET-28a為本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌菌株DH(5α)和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司。EcoRⅠ,BamHⅠ和T4連接酶購自賽默飛世爾科技公司, DNA marker和Protein Marker購自北京全式金公司，質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自北京萊科百奧公司。

1.2 方法

1.2.1 Rv2364c基因的擴(kuò)增 利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物。引物為正向-CGGGATCCATGACCGAATTCCA-TTCTGGCTTT，反向-CGGAATTCCTAAAACCCCAGT-CGGCCAA。以合成的Rv2364c序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性10 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將回收的目的片段與pET-28a載體分別用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，將酶切產(chǎn)物按比例16 ℃連接5 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH(5α)感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素篩選陽性克隆，對陽性克隆做雙酶切鑒定和測序鑒定。

1.2.3 目的基因在大腸桿菌中的融合表達(dá) 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。再取過夜的菌液接種至1L LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液濃度OD600值達(dá)到0.6時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)至終濃度為0.1 mmol· L-1，16 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。

1.2.4 融合蛋白的純化 收集菌體，用PBS重懸菌體沉淀，超聲破碎后15 000 r· min-1，4 ℃離心30 min，將上清過Ni-NTA親和柱純化，并分別取上清、沉淀、穿過、50 mmol· L-1咪唑洗雜、500 mmol· L-1咪唑洗脫和洗脫后的柱料制樣。SDS-PAGE電泳分析，收集500 mmol· L-1咪唑洗脫液并超濾濃縮。

1.2.5 Rv2364c的生物信息學(xué)分析 利用ProtParam對Rv2364c的氨基酸序列及理化性質(zhì)進(jìn)行分析，SOPMA對其二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，最后用CD-search預(yù)測Rv2364c的功能結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的蛋白的表達(dá)與純化

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 構(gòu)建的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和BamHⅠ作雙酶切鑒定(圖1)，獲得5 369 bp的載體片段和約900 bp的目的基因片段，結(jié)果表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

圖1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

2.1.2 重組蛋白的表達(dá)及純化 在0.1 mmol· L-1IPTG, 16 ℃條件下誘導(dǎo)8 h后收集菌體，超聲裂解后，融合蛋白經(jīng)鎳柱純化、SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示大部分蛋白位于沉淀中，少部分蛋白位于上清中，將上清中的蛋白過鎳柱后得到純度大于90%的蛋白(圖2)。

圖2 融合蛋白親和層析后的SDS-PAGE分析

2.2 Rv2364c的生物信息學(xué)分析

2.2.1 Rv2364c的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析 ProtParam分析表明Rv2364c分子量為32.5 kDa，有300個氨基酸殘基，含量較高的是亮氨酸(11.0%)、纈氨酸(11.7%)，含量較少的氨基酸有半胱氨酸(0.7%)、色氨酸(0.7%)。理論等電點(diǎn)5.76為酸性蛋白。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為26.48，是穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性為0.003。

2.2.2 Rv2364c的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：α-螺旋的比例最高，達(dá)到42%，無規(guī)卷曲次之，為31.67%，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比例分別為20%和6.33%。因此α-螺旋和無規(guī)卷曲是該蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)元件。無規(guī)卷曲主要分布于氨基酸殘基的13-20、36-42、92-100、177-190這4個區(qū)域。

2.2.3 Rv2364c的功能結(jié)構(gòu)域分析 利用CD-search預(yù)測Rv2364c的功能結(jié)構(gòu)域，得到兩種結(jié)構(gòu)域類型：①Era結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸殘基4～169位。②KH結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸殘基210～288位。

3 討論

本研究以質(zhì)粒pET-28a為表達(dá)載體，在大腸桿菌中融合表達(dá)Rv2364c蛋白。菌液濃度OD600為0.6時加入IPTG開始誘導(dǎo)，8 h后收集細(xì)菌。細(xì)菌經(jīng)超聲破碎后，上清中可見可溶性蛋白存在，但沉淀中也有大量蛋白。蛋白不溶解的原因可能是蛋白的表達(dá)量過高，pET系統(tǒng)的T7啟動子是原核表達(dá)系統(tǒng)中最強(qiáng)的啟動子，強(qiáng)啟動容易引起目的蛋白沒有足夠時間正確折疊而聚集成沒有生物活性的不溶結(jié)構(gòu)，即包涵體[3]。目前實(shí)驗(yàn)室常用的增加蛋白溶解度的方法有：①降低蛋白合成速度，比如降低誘導(dǎo)溫度和IPTG濃度；②在裂解緩沖液中加入非離子型去污劑(如Triton X-100)或雙性去污劑；③選用帶有親水標(biāo)簽的載體，比如pGEX-6p-1等[4]。

經(jīng)CD-search預(yù)測，Rv2364c含有Era結(jié)構(gòu)域和KH結(jié)構(gòu)域，其應(yīng)屬于Era GTP酶家族。Era(E.coli Ras-like protein)是一種存在于所有細(xì)菌中的多功能GTP酶，能將GTP水解成GDP[5]，其在16 s rRNA的加工和核糖體30 s小亞基的合成中扮演了重要角色[6]。大腸桿菌中的Era蛋白可能還參與了細(xì)胞周期的調(diào)控[7]和能量代謝[8]，Era不止存在于原核生物，其同源蛋白也存在于哺乳動物中，稱之為ERA蛋白，目前對其功能知之甚少[9]。Era的N端為GTP酶結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合鳥苷酸和水解GTP的活性，C端為KH結(jié)構(gòu)域。Era不屬于Ras家族，因其C端存在KH結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域使其成為一個新的G蛋白亞家族。KH結(jié)構(gòu)域是一種在真核生物和原核生物中都存在的核酸識別結(jié)構(gòu)域，大小約為70個氨基酸殘基[10]， 能和單鏈核酸特異性結(jié)合[11]。含KH結(jié)構(gòu)域的蛋白一般具有多種生物學(xué)功能，研究表明一些癌癥副腫瘤綜合征及脆性x染色體的發(fā)生可能與KH結(jié)構(gòu)域的功能缺失有關(guān)[12]。結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv2364c蛋白可能也具備以上功能。

本研究成功構(gòu)建pET-28a-Rv2364c重組原核表達(dá)載體并表達(dá)出融合蛋白，通過親和層析獲得了純度較高的目的蛋白，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步探索該蛋白在結(jié)核病致病過程中的作用及研究新抗結(jié)核分枝桿菌的治療方法奠定了基礎(chǔ)。

[1] Yuen CM,Amanullah F,Dharmadhikari A,et al.Turning off the tap: stopping tuberculosis transmission through active case-finding and prompt effective treatment[J].Lancet,2015,386(10010):2334-2343.

[2] Moore DA.What can we offer to 3 million MDRTB household contacts in 2016[J].BMC Med,2016(14):64-68.

[3] Singh A,Panda AK.Solubilization and refolding of inclusion body proteins[J].Methods Mol Biol,2015(1258):283-291.

[4] Young CL,Britton ZT,Britton ZT,et al.Recombinant protein expression and purification: a comprehensive review of affinity tags and microbial applications[J].Biotechnol J,2012,7(5):620-634.

[5] Wu YM,Zhang XN,Xin XH,et al.Soluble expression, purification and bioactivity of recombinant human Era protein[J].Chin J Cell Mol Immunol,2008,24(6):560-563.

[6] Meier TI,Peery RB,McAllister KA,et al.Era GTPase of Escherichia coli: binding to 16S rRNA and modulation of GTPase activity by RNA and carbohydrates[J].Microbiology,2000,146 (5):1071-1083.

[7] Inoue K,Chen J,Tan Q,et al.Era and RbfA have overlapping function in ribosome biogenesis in Escherichia coli[J].J Mol Microbiol Biotechnol,2006,11(1-2):41-52.

[8] Tu C,Zhou X,Tropea JE,et al.Structure of ERA in complex with the 3′ end of 16S rRNA: implications for ribosome biogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(35):14843-14848.

[9] Diaz-Moreno I,Hollingworth D,Frenkiel TA,et al.Phosphorylation-mediated unfolding of a KH domain regulates KSRP localization via 14-3-3 binding[J].Nat Struct Mol Biol,2009,16(3):238-246.

[10]Tripathi BK,Surabhi S,Bhaskar PK,et al.The RNA binding KH domain of Spoonbill depletes pathogenic non-coding spinocerebellar ataxia 8 transcripts and suppresses neurodegeneration in Drosophila[J].Biochim Biophys Acta,2016,1862(9):1732-1741.

[11]Chen T,Cui P,Chen H,et al.A KH-domain RNA-binding protein interacts with FIERY2/CTD phosphatase-like 1 and splicing factors and is important for pre-mRNA splicing in Arabidopsis[J].PLoS Genet,2013,9(10):e1003875.

[12]Lewis HA,Musunuru K,Jensen KB,et al.Sequence-specific RNA binding by a Nova KH domain:implications for paraneoplastic disease and the fragile X syndrome[J].Cell,2000,100(3):323-332.

Expression, Purification and Bioinformatics Analysis of Rv2364c fromMycobacteriumTuberculosisH37Rv

XU Wan-ling, FU Chen-zeng

(Luohe Medical College, Luohe 462000, China)

ObjectiveTo obtain Rv2364c ofMycobacteriumtuberculosisH37Rv expressed in E. coli and predict its bioinformatics characters for the further development of anti-Mycobacterium tuberculosis drugs.MethodsThe target DNA fragment of the Rv2364c gene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a. Then the recombinant vector (pET-28a-Rv2364c) was transformed into E.coliBL21(DE3). The expression of the His-Tag fusion protein was induced with isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG). Finally, we purified the protein through affinity chromatography. We also used bioinformatic methods to analyze and predict this protein.ResultsDouble restriction enzyme analysis and sequencing technique proved that recombinant plasmid was constructed correctly, and the expression of the fusion protein in E.coli BL21(DE3) was detectable by SDS-PAGE. The target protein was gained after purified (purity>90%) using the affinity chromatographic column. Bioinformatics analysis revealed that Rv2364c was a stable and acidic protein;α-helix and random coil were the main components of its secondary structure; The main function domain types were Era domain and KH domain.ConclusionRv2364c had been successfully cloned, expressed and purified, the domain was predicted by bioinformatics method,which would be useful for further research on Rv2364c in the genesis and development of tuberculosis.

mycobacterium tuberculosis H37Rv；Rv2364c；transfection；bioinformatics

1672-688X(2017)01-0022-03

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.007

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基金(2014-S-LMC07)

2016-09-13

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河 462000

徐宛玲(1965—)，女，河南漯河人，教授，主任醫(yī)師，從事臨床教學(xué)科研工作。

Q811.4;R378.91+1

A