粉末活性炭聯(lián)合鹽析法純化藻藍(lán)蛋白的研究

盛晶夢, 張發(fā)宇, 袁夢媛, 汪家權(quán)

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

粉末活性炭聯(lián)合鹽析法純化藻藍(lán)蛋白的研究

盛晶夢, 張發(fā)宇, 袁夢媛, 汪家權(quán)

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

文章以巢湖新鮮藍(lán)藻藻泥為處理材料,采取粉末活性炭聯(lián)合鹽析的方法提取純化藻藍(lán)蛋白。綜合考慮粉末活性炭種類、粒徑、添加量、處理時間、pH值及硫酸銨濃度等影響因素,通過一系列單因素試驗研究了不同活性炭處理條件以及兩步鹽析中硫酸銨的濃度對藻藍(lán)蛋白提純的影響,對藻藍(lán)蛋白的提純條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明:在粉末活性炭種類為煤質(zhì),粒徑為400～500目,添加量為100 g/L,靜置時間為10 min,pH值為7.0,兩步鹽析(NH4)2SO4的濃度分別為1 mol/L和2 mol/L時,粉末活性炭聯(lián)合鹽析法提純藻藍(lán)蛋白的效果最好,藻藍(lán)蛋白的純度可達(dá)3.16,回收率為45%。

粉末活性炭;兩步鹽析;提取純化;藻藍(lán)蛋白

我國是世界上多湖泊國家,湖泊富營養(yǎng)化已經(jīng)成為我國最重要的水環(huán)境問題之一。為控制并消除巢湖藍(lán)藻污染,一方面,系統(tǒng)全面的巢湖水華預(yù)警監(jiān)控方案得到長足研究[1];另一方面,在每年的水華藍(lán)藻暴發(fā)季有大量藍(lán)藻被打撈上來。與此同時,打撈上來的藍(lán)藻資源化利用也成為巢湖藍(lán)藻重點研究的課題[2]之一。目前國內(nèi)外有關(guān)水華藍(lán)藻資源化利用的研究主要集中在堆肥處理和藍(lán)藻中有效物質(zhì)提取2個方面。近年來,利用藍(lán)藻生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品藍(lán)蛋白成為研究重點。研究表明,藻藍(lán)蛋白具有抗氧化性[3-4]、抗癌性[5]、免疫熒光性[6-7]等功效。藻藍(lán)蛋白純度的高低決定了其應(yīng)用和價值,純度越高,售價越高,根據(jù)藻藍(lán)蛋白純度的不同可將其分為食品級(純度>0.7)和試劑級(純度>4.0)[8]。因此,從水華藍(lán)藻中提取純化較高純度的藻藍(lán)蛋白,既可實現(xiàn)水華藍(lán)藻的無害化,又可實現(xiàn)其資源化。

有關(guān)提取純化藻藍(lán)蛋白方法的研究有很多[9-12],其中鹽析法作為常見的方法,多被單獨使用[13]或與雙水相[14]、柱層析[15]等方法聯(lián)合使用以純化藻藍(lán)蛋白。現(xiàn)有的藻藍(lán)蛋白提取純化技術(shù)多應(yīng)用于實驗室階段,在推廣到規(guī)?；瘧?yīng)用時常會遇到來自產(chǎn)品純度、得率和成本的挑戰(zhàn)[16]。因此,工藝代替、不同提純方法組合應(yīng)用成為新的熱點,許多新的提純技術(shù)也涌現(xiàn)出來。

活性炭常作為水處理中去除色、嗅、味和有機(jī)物的有效方法之一[17],近些年也有人研究活性炭對藻毒素的去除效果[18]。有關(guān)活性炭及與其他方法聯(lián)合應(yīng)用純化藻藍(lán)蛋白的研究卻很少。文獻(xiàn)[19]向粗提中液加入2%的殼聚糖充分?jǐn)嚢韬箅x心,再向上清液中加入適量活性炭離心取上清,藻藍(lán)蛋白的純度由0.93提升至2.78。本文通過試驗,對粉末活性炭的種類、粒徑、添加量、處理時間及pH值等條件進(jìn)行了研究,確定了粉末活性炭聯(lián)合兩步鹽析法純化藻藍(lán)蛋白的效果,優(yōu)化了處理條件。與傳統(tǒng)多步鹽析法及其聯(lián)合方法相比,本研究方法引入雜質(zhì)少、操作簡單、設(shè)備成本低、材料可回收利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗提液的制備原料采用實驗室冷柜中儲存的巢湖新鮮藍(lán)藻藻泥,取自西湖區(qū)水華表層20 cm水體處,含水量約為96.2%,采集日期為2015年8月4日,室外氣溫為37～38 ℃。

常用試劑:(NH4)2SO4、活性炭、HCl、NaOH、濃度為0.002 5 mol/L的PBS緩沖液、冰醋酸、甲醇、丙烯酰胺、甘油、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸、溴酚藍(lán)。

1.2 分析方法

藻藍(lán)蛋白在620 nm處有特征吸收峰,蛋白在280 nm處有最大吸收峰。將藻藍(lán)蛋白溶液在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光光譜掃描,藻藍(lán)蛋白的純度[20]、質(zhì)量濃度[21]及其回收率計算公式分別為：

其中,A280、A620分別為波長280、620 nm處的吸光度;ρt為樣品溶液中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度;ρ0為粗提液中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度;Vt為樣品溶液的體積;V0為粗提液的體積。

1.3 藻藍(lán)蛋白粗提液的制備

取冷凍保存的巢湖新鮮藍(lán)藻藻泥,反復(fù)凍融3次。將解凍后的藍(lán)藻溶液用4層普通紗布過濾去除藻渣,上清液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min,即可得到藻藍(lán)蛋白粗提液。

1.4 粉末活性炭處理單因素試驗

水中有機(jī)物組分復(fù)雜,以表征單一物質(zhì)的活性炭吸附性能參數(shù)無法很好地反映對水中有機(jī)物的吸附效果,而且現(xiàn)行的商品粉末活性炭常用的吸附性能參數(shù)(碘值、亞甲基蘭值)與有機(jī)物去除量之間沒有顯著相關(guān)性[22]。因此,本試驗以藻藍(lán)蛋白純度和回收率為參考指標(biāo),來選擇適合于藻藍(lán)蛋白粗提液預(yù)處理的粉末活性炭種類與條件。

1.4.1 粉末活性炭種類

室溫下,分別取市售的煤質(zhì)、木質(zhì)、果殼粉末活性炭各1 g于20 mL藻藍(lán)蛋白粗提液中充分?jǐn)嚢? min,抽濾后測定藻藍(lán)蛋白純度,計算回收率,研究粉末活性炭種類對藻藍(lán)蛋白提純的影響。

1.4.2 粉末活性炭粒徑

將市售煤質(zhì)活性炭粉末濕法過篩,用100、200、300、400、500目分子篩過濾后在80 ℃下烘干24 h,獲得不同粒徑煤質(zhì)活性炭粉末。室溫下,在煤質(zhì)粉末活性炭添加量為100 g/L,pH值為6.0的條件下,分別將不同粒徑的煤質(zhì)粉末活性炭與粗提液充分?jǐn)嚢? min,抽濾后測定藻藍(lán)蛋白純度,并計算回收率。

1.4.3 粉末活性炭添加量

室溫下,在pH值為6.0,煤質(zhì)粉末活性炭粒徑為400～500目的條件下,取適量粉末活性炭于粗提液中充分?jǐn)嚢? min,使粗提液中活性炭質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250 g/L,抽濾后測定藻藍(lán)蛋白純度,計算回收率。

1.4.4 處理時間

室溫下,在pH值為6.0,煤質(zhì)粉末活性炭粒徑為400～500目,添加量為100 g/L的條件下,將粉末活性炭與粗提液充分?jǐn)嚢?處理時間分別為0、5、10、15、20 min,然后抽濾,測定藻藍(lán)蛋白純度,計算回收率。

1.4.5 pH值

室溫下,在煤質(zhì)粉末活性炭粒徑為400～500目,添加量為100 g/L,攪拌時間10 min的條件下,分別在pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的條件下處理,抽濾后測定藻藍(lán)蛋白純度,計算回收率。

1.5 鹽析單因素實驗

1.5.1 一步(NH4)2SO4鹽析

將粗提液在粉末活性炭種類為煤質(zhì),粒徑為400～500目,添加量為100 g/L,pH值為7.0,攪拌時間為10 min的條件下純化后,進(jìn)行一步鹽析。向粉末活性炭純化后的藻藍(lán)蛋白溶液中加入適量(NH4)2SO4,將濃度分別調(diào)節(jié)至0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L。充分?jǐn)嚢枞芙夂髮⒋痔嵋河? ℃、8 000 r/min條件下離心20 min,獲取上清液,測定上清液中藻藍(lán)蛋白的純度和回收率。

1.5.2 兩步(NH4)2SO4鹽析

在一步鹽析的基礎(chǔ)上,進(jìn)行兩步鹽析。將粉末活性炭最優(yōu)條件純化過的藻藍(lán)蛋白溶液經(jīng)一次鹽析,硫酸銨濃度為1.0 mol/L,離心取上清液備用。分別向備用液中緩慢加入硫酸銨使其濃度為1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mol/L,待硫酸銨充分溶解后將溶液于4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min,取沉淀,用磷酸緩沖溶液(0.002 5 mol/L)溶解后測定溶液中藻藍(lán)蛋白純度和回收率。

1.6 成品分析

“秦月”由“秦富1號”和“嘎拉”雜交育成。果實呈圓形或長圓錐形，大小均勻，果個與嘎拉接近，果皮鮮紅，果肉黃白，肉質(zhì)細(xì)脆多汁，酸甜適口，較耐貯存。在渭北高原南部地區(qū)8月底成熟，渭北高原中部地區(qū)9月上中旬成熟，剛好趕上中秋節(jié)和國慶節(jié)，是一個優(yōu)良的中熟蘋果新品種。

1.6.1 純化后藻藍(lán)蛋白的光譜特性

經(jīng)粉末活性炭種類為煤質(zhì),粒徑為400～500目,添加量為100 g/L,pH值為7.0,攪拌時間為10 min處理后的藻藍(lán)蛋白溶液和兩步鹽析(兩步鹽析(NH4)2SO4最佳濃度分別為1 mol/L和2 mol/L)后的藻藍(lán)蛋白溶液在200～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見光光譜掃描。

1.6.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)分離膠為15%,濃縮膠為5%。配制適量的電泳緩沖液、0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液、10%甲醇與10%冰醋酸(體積比為1∶1)組成的脫色液。將電極接好,接通電源,對經(jīng)粉末活性炭聯(lián)合兩步鹽析法純化(粉末活性炭種類為煤質(zhì),粒徑為400～500目,添加量為100 g/L,pH值為7.0,攪拌時間為10 min,兩步鹽析(NH4)2SO4最佳濃度分別為1 mol/L和2 mol/L)后的純度為3.16的藻藍(lán)蛋白樣品進(jìn)行PAGE測定,等指示劑遷移至距凝膠下端1 cm處時停止電泳。取出凝膠并浸泡于考馬斯亮藍(lán)染色液中,染色1 h。然后用脫色液脫色,更換幾次脫色液至背景無色。

2 結(jié)果與討論

2.1 粉末活性炭處理單因素試驗結(jié)果

2.1.1 粉末活性炭種類的影響

表1 粉末活性炭種類對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

注:粗提液藻藍(lán)蛋白純度為0.51。

由表1可知,不同種類的活性炭對粗提液均有純化效果,這可能是由于活性炭主要吸附分子量為500～3 000內(nèi)的小分子有機(jī)物[23],如藻毒素、嗅味物質(zhì)、葉綠素、雜蛋白等,從而起到純化藻藍(lán)蛋白的效果。煤質(zhì)粉末活性炭對藻藍(lán)蛋白有顯著的純化效果,粗提液純度由0.51增長至1.63,藻藍(lán)蛋白的回收率達(dá)到60%;而椰殼粉末活性炭對藻藍(lán)蛋白的純化效果最差、回收率較低;木質(zhì)活性炭對藻藍(lán)蛋白的純化效果適中,藻藍(lán)蛋白的回收率最低,只有22%。這可能是由于相對于煤質(zhì)活性炭,木質(zhì)活性炭中孔容積較大,更容易吸附藻藍(lán)蛋白,使得回收率很低;椰殼活性炭的孔隙尺寸與藻藍(lán)蛋白相近,容易發(fā)生阻塞從而阻礙了小分子雜質(zhì)進(jìn)入微孔,藻藍(lán)蛋白的純度和回收率均較低。綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度與回收率,后續(xù)實驗選擇煤質(zhì)粉末狀活性炭。

2.1.2 粉末活性炭粒徑的影響

不同粒徑的煤質(zhì)粉末活性炭對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖1所示。

由圖1可看出,隨著煤質(zhì)粉末活性炭粒徑的減小,活性炭的比表面積增大,中、微孔數(shù)量增多,對小分子有機(jī)物的吸附性增強(qiáng)[24],使得藻藍(lán)蛋白純度增長較快;隨著活性炭粒徑的繼續(xù)減小,活性炭粉末對藻藍(lán)蛋白的吸附性明顯大于對雜質(zhì)的吸附性,藻藍(lán)蛋白純度開始降低。當(dāng)粉末活性炭粒徑范圍為200～300目時,藻藍(lán)蛋白的回收率達(dá)到最大值;之后隨著活性炭粒徑的減小,活性炭微孔更容易暴露在溶液中,對藻藍(lán)蛋白和雜質(zhì)的吸附性大大增強(qiáng),藻藍(lán)蛋白的回收率迅速降低。因此,綜合考慮純度和回收率,煤質(zhì)粉末活性炭的粒徑定為400～500目。

圖1 粉末活性炭粒徑對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

2.1.3 粉末活性炭添加量的影響

不同煤質(zhì)粉末活性炭添加量對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖2所示。

圖2 粉末活性炭添加量對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

由圖2可知,在其他條件不變的情況下,隨著粉末活性炭添加量的增加,藻藍(lán)蛋白純度增長較快;當(dāng)添加量高于150 g/L時,藻藍(lán)蛋白純度緩慢下降。藻藍(lán)蛋白的回收率則隨著粉末活性炭添加量的增加而迅速下降。這可能是由于隨著活性炭添加量的增加,溶液中活性炭的比表面積增大,中孔容積增大,對藻藍(lán)蛋白的吸附性增強(qiáng),導(dǎo)致對藻藍(lán)蛋白的吸附量逐漸大于對雜蛋白的吸附量;同時藻藍(lán)蛋白阻塞了孔隙，阻礙了對小分子雜蛋白的吸附，使得藻藍(lán)蛋白的純度先增后減,在150 g/L時純度最高,為1.81,而回收率則迅速下降。因此,綜合考慮純度和回收率,粉末活性炭的添加量定為100 g/L。

2.1.4 處理時間的影響

不同的煤質(zhì)粉末活性炭處理時間對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖3所示。

圖3 處理時間對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

由圖3可知,在其他條件不變的情況下,隨著煤質(zhì)粉末活性炭處理時間的增加,藻藍(lán)蛋白的純度緩慢增長。而當(dāng)處理時間為0～10 min時,藻藍(lán)蛋白的回收率下降較慢;當(dāng)攪拌時間為10～20 min時,藻藍(lán)蛋白的回收率下降較快。這可能是由于活性炭對小分子有機(jī)物的吸附主要發(fā)生在剛接觸階段,之后隨著接觸時間的增加,活性炭對雜質(zhì)的吸附量增長緩慢,對藻藍(lán)蛋白的不可逆吸附則逐漸增加,使得回收率下降較快。因此,綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度和回收率,處理時間定為10 min。

2.1.5 pH值的影響

pH值對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響如圖4所示。

圖4 pH值對藻藍(lán)蛋白純度和回收率的影響

由圖4可知,在其他條件不變的情況下,隨著pH值的增長,藻藍(lán)蛋白的純度和回收率都呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在pH值為7.0時達(dá)到最大,分別為1.70和50%。這可能是由于藻藍(lán)蛋白溶液的pH值靠近7.0,溶液呈極酸或極堿狀態(tài)時,藻藍(lán)蛋白大部分失活,從而被活性炭較多吸附。因此,綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度和回收率,pH值定為7.0。

2.2 鹽析單因素試驗

2.2.1 一步(NH4)2SO4鹽析

經(jīng)過粉末活性炭處理后,獲得純度為1.70的藻藍(lán)蛋白,采用一步(NH4)2SO4鹽析進(jìn)行試驗,測定溶液中藻藍(lán)蛋白純度和回收率如圖5所示。

圖5 一步鹽析(NH4)2SO4濃度對純度和回收率的影響

由圖5可知,隨著硫酸銨濃度不斷增加,藻藍(lán)蛋白純度先緩慢增加后下降較快,在1 mol/L時達(dá)到最大值，而隨著硫酸銨濃度不斷增加,藻藍(lán)蛋白的回收率緩慢下降。這可能由于隨著硫酸銨濃度的增加,除了雜質(zhì),部分藻藍(lán)蛋白也被沉淀了出來。因此,綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度和回收率,一步鹽析硫酸銨的最佳濃度為1 mol/L。

2.2.2 兩步(NH4)2SO4鹽析

進(jìn)行兩步(NH4)2SO4鹽析試驗,測定溶液中藻藍(lán)蛋白純度和回收率,如圖6所示。

圖6 兩步鹽析(NH4)2SO4濃度對純度和回收率的影響

由圖6可知,當(dāng)硫酸銨濃度為1.4 mol/L時,溶液中的藻藍(lán)蛋白無法沉淀析出。當(dāng)硫酸銨濃度為1.6～2.4 mol/L時,隨著硫酸銨濃度不斷增加,藻藍(lán)蛋白的純度先增加后降低,在1.8 mol/L處達(dá)到最大值3.19,藻藍(lán)蛋白的回收率則先增加后維持不變。這可能是由于硫酸銨濃度過高時,部分藻藍(lán)蛋白失活,且雜質(zhì)也被從溶液中沉淀了下來,使得藻藍(lán)蛋白的純度先增加后不變，而回收率迅速下降。因此綜合考慮藻藍(lán)蛋白的純度和回收率,兩步鹽析硫酸銨的最佳濃度為2 mol/L,此時藻藍(lán)蛋白的純度可達(dá)3.16,回收率為45%。

2.3 成品分析

2.3.1 純化后藻藍(lán)蛋白的光譜特性

將藻藍(lán)蛋白溶液進(jìn)行紫外-可見光光譜掃描,光譜圖如圖7所示。

圖7 純化后藻藍(lán)蛋白紫外-可見吸收光譜圖

由圖7可知,藻藍(lán)蛋白粗提液在620 nm處有特征吸收峰。經(jīng)粉末活性炭預(yù)處理后,藻藍(lán)蛋白溶液在280 nm處吸光度下降幅度最大,約減少了87%;在620 nm處的吸光度減少了約52%,藻藍(lán)蛋白粗提液純度大幅增加,純度為1.70。這從側(cè)面驗證了粉末活性炭對于雜質(zhì)蛋白的優(yōu)先吸附性。經(jīng)過兩步鹽析處理,藍(lán)藻溶液在280 nm處的吸光度繼續(xù)下降,而在620 nm處吸光度幾乎不變,說明兩步鹽析后藻藍(lán)蛋白粗提液中的雜質(zhì)得到了進(jìn)一步去除,而藻藍(lán)蛋白得以大部分保留下來。

2.3.2 PAGE鑒定

藻藍(lán)蛋白的PAGE結(jié)果如圖8所示。

圖8 藻藍(lán)蛋白的PAGE圖

經(jīng)煤質(zhì)粉末活性炭聯(lián)合兩步鹽析提純后的藻藍(lán)蛋白純度達(dá)到3.16,經(jīng)電泳后形成了2條相鄰的平行譜帶,這表明此種藻藍(lán)蛋白是由α、β大小2個亞基組成的,分子量分別為18 kDa和20 kDa,與文獻(xiàn)[25]說明相符。

3 結(jié) 論

文獻(xiàn)[14]用粗提液進(jìn)行四步鹽析(硫酸銨飽和度分別為25%、55%、5%、35%)后藻藍(lán)蛋白純度由0.6升至2.52,回收率為63.5%。本文工藝操作簡單,兩步鹽析階段無需靜置12 h;粗提液純度由0.51上升至3.16,增幅更大;兩步鹽析最佳硫酸銨濃度分別為1 mol/L和2 mol/L,用硫酸銨飽和度表示分別為23%和43%,比文獻(xiàn)[14]粗提液前2步鹽析,所需的硫酸銨分別減少了3%和12%。以上結(jié)果表明粉末活性炭和鹽析的純化效果可疊加,進(jìn)一步去除粗提液中的雜蛋白和小分子物質(zhì),且比單純鹽析方法的純化效果更好、所需試劑量更少。同時,活性炭粉末的重新回收利用也有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 閆杏麗)

Study of extraction and purification of C-phycocyanin from blue algae by combined use of powdered activated carbon treatment and salt precipitation

SHENG Jingmeng, ZHANG Fayu, YUAN Mengyuan, WANG Jiaquan

(School of Resources and Environmental Engineering， Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The extraction and purification of C-phycocyanin from fresh blue algae in Chaohu Lake were performed by the combined use of powdered activated carbon(PAC) treatment and salt precipitation. Considering the PAC variety， particle size， dosage， treatment time， pH value and amount of substance concentration of (NH4)2SO4， the effects of different PAC treatment conditions and amount of substance concentration of (NH4)2SO4in two-step salt precipitation on the extraction and purification of C-phycocyanin were studied by series of single factor experiments，and the extraction and purification conditions were optimized. The results showed that the effect of combined use of PAC and salt precipitation was best when the coal PAC particle size was 400-500 mesh， dosage was 100 g/L， treatment time was 10 min, pH value was 7.0 and the amount of substance concentration of (NH4)2SO4in two-step salt precipitation were 1 mol/L and 2 mol/L， and the purity and recovery rate of C-phycocyanin were 3.16 and 45%.

powdered activated carbon(PAC); two-step salt precipitation; extraction and purification; C-phycocyanin

2015-12-31；

2016-03-17

國家“十二五”科技重大專項資助項目(2012ZX07103-004)

盛晶夢(1991-),女,安徽淮南人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生; 汪家權(quán)(1957-),男,安徽安慶人,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2017.02.020

TQ464.7

A

1003-5060(2017)02-0242-06