紅松仁清蛋白ACE抑制肽的分離純化與結構鑒定

苗欣宇，王祖浩，王 鵬，方 麗，王 輯，閔偉紅

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

紅松仁清蛋白ACE抑制肽的分離純化與結構鑒定

苗欣宇，王祖浩，王 鵬，方 麗，王 輯，閔偉紅*

（吉林農業(yè)大學食品科學與工程學院，小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林 長春 130118）

為研究酶解紅松仁清蛋白中具有血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性短肽的組分及其序列，采用超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色譜對松仁清蛋白酶解液進行分離純化，對純化后樣品（組分D2）進行質譜結構鑒定。質譜結果進行從頭測序，篩選得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys（YLLK），分子質量為535.34 D。該肽經固相合成純度為99.80%，其半數(shù)抑制濃度測定值為0.282?5?μmol/L。

紅松仁清蛋白；ACE抑制肽；分離純化；氨基酸序列

紅松（Pinus konaiensis Sieb.et Zucc.）的果實稱為紅松仁，有“長壽果”之稱。主要分布于我國的東北長白山和小興安嶺林區(qū)，其中以長白山的產量最為豐富。長白山野生紅松需生長50 a后方開始結籽[1]。因地理位置因素，紅松仁生長周期長達2 a，長時間的生長成熟期使其含有豐富的營養(yǎng)物質，因此極為珍貴[2]。松仁油中包含許多具有生物活性和促進健康的物質[3]，同時松仁蛋白中含有18 種氨基酸[4]，其中8 種必需氨基酸滿足了聯(lián)合國糧農組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）規(guī)定的成人推薦值[5-6]。由此可見，紅松仁可作為促進人體健康和營養(yǎng)需要的較為理想的食物來源，具有很好的開發(fā)應用前景[7]。

2015年，我國高血壓患者超過3億人，長期服用降壓藥物會帶來多種副作用[8]。因此，尋求更為安全有效的降壓藥物具有現(xiàn)實意義。Wu Dan等[9]采用Osborne法對松子蛋白進行分級提取，并探索各組分的理化性質，發(fā)現(xiàn)清蛋白暴露巰基和總巰基含量最高。吳丹等[10]采用堿性蛋白酶對長白山松子分離蛋白進行酶解，通過響應面（Box-Benhnken）組合優(yōu)化試驗，確定血管緊張素轉化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制率最佳的條件。降血壓肽（antihypertension peptide），又稱ACE抑制肽，是由植物蛋白質、小分子肽酶解后釋放的具有抑制ACE活性的多肽物質[11]。從食源蛋白質中得到的降血壓肽既能使動物體血壓適當降低[12-13]，又能保證其安全性，對血壓正常的動物體沒有降壓作用，彌補了常見降壓藥物使血壓過度下降易誘發(fā)心臟病突發(fā)提高死亡率的不足[14]。目前，有關食品蛋白來源的降壓功能性產品的開發(fā)已成為國內外學者研究的熱點[15]。

本研究首先通過酶解紅松仁分離蛋白得到具有降血壓活性的多肽，接著對其進行超濾、Sephadex G-25和Sephadex G-15凝膠層析分離純化各酶解組分，并利用反相高效液相色譜（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）進一步純化。最后采用電噴霧串聯(lián)質譜儀（electrospray tandem mass spectrometer，ESI-MS/MS）對松仁蛋白降血壓肽進行結構分析，得到具有高ACE抑制活性肽的序列，同時按照該序列合成ACE抑制肽并驗證其活性，為長白山紅松資源的深度開發(fā)和綜合利用提供基礎數(shù)據(jù)和科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山紅松仁分離蛋白（蛋白含量91.62%），堿溶酸沉法制備[16]。

馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）、ACE（0.25 U）、Sephadex G-25、Sephadex G-15美國Sigma公司；堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L FG） 丹麥Novozymes公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FD-1B-50型冷凍干燥機 北京博醫(yī)康儀器有限公司；UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；RSA224S型電子天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；ZY-1000切向流超濾系統(tǒng) 上海紫裕生物科技有限公司；Pellicon?2 迷你膜盒 美國Millipore公司；HD-3型紫外檢測器、BSZ-100型自動部份收集、HL-2型恒流泵 上海滬西分析儀器廠；1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)、6520四極桿飛行時間串聯(lián)質譜儀（quadrupole tandem mass spectrometry，Q-TOF） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 紅松仁清蛋白的提取

精確稱取紅松仁分離蛋白100 g，加入1 000 mL蒸餾水，pH 7、室溫條件下用磁力攪拌器攪拌1 h，5 000 r/min室溫條件下離心10 min，取上清液。用HCl調整pH值至4.1，室溫條件下靜置2 h，5 000 r/min離心10 min，棄上清液得到乳白色蛋白質沉淀。用蒸餾水輕輕漂洗蛋白質沉淀3 次后，將pH值調至7.0，冷凍干燥，得到松仁清蛋白[17]。

1.3.2 紅松仁清蛋白的酶解

采用堿性蛋白酶酶解松仁清蛋白，制備具有ACE抑制活性的酶解產物。酶解條件：底物質量濃度2 g/100 mL，酶解時間150 min，酶解溫度55 ℃，酶解pH 9，加酶量10 000 U/g（以底物質量計）。

1.3.3 紅松仁ACE抑制肽的分離純化

1.3.3.1 超濾分離

依次采用截留分子質量為10、3 kD超濾膜盒對酶解液進行分級分離，得到3 個組分分別為：A1（＜3 kD），A2（3～10 kD）和A3（＞10 kD）。對所得組分進行冷凍干燥后測其ACE抑制活性。恒流泵對使用Pellicon膜包的壓力條件：進口壓力1.7 bar，回流壓力0.3 bar[18]。

1.3.3.2 凝膠滲透層析分離純化

將超濾分離后的松仁清蛋白酶解液用Sephadex G-25進行分離，分別收集各峰組分，將其冷凍干燥，測定各組分ACE抑制率。分離條件：洗脫液為蒸餾水，流速為1 mL/min，并用自動分步收集器收集洗脫液（3 mL/管），樣品質量濃度為45 mg/mL，上樣量4 mL，檢測波長280 nm[19]。

將Sephadex G-25分離所得的ACE抑制活性最強的組分，利用Sephadex G-15凝膠色譜柱進一步純化。收集各峰組分，凍干后測其ACE抑制率。分離條件：洗脫液為蒸餾水，流速為1 mL/min，樣品質量濃度為30 mg/mL，上樣體積為3 mL，并用自動分步收集器收集洗脫液（3 mL/管），檢測波長280 nm。

1.3.3.3 RP-HPLC分析

將酶解液經Sephadex G-15分離獲得的活性最強組分利用RP-HPLC分離純化，收集各洗脫峰，經旋轉蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得到各分離組分，測定其A C E抑制活性。色譜條件：色譜柱：C18（150 mm×2.0 mm，3?μm）柱；檢測波長：220 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.5 mL/min，進樣量：10?μL；流動相A：水（含0.1%的三氟乙酸）；B：乙腈（含0.1%的三氟乙酸），C：蒸餾水，D：純乙腈。梯度洗脫條件[20-21]：0～30 min，95% C（線性梯度）；30～50 min，65%～95% C（線性梯度）；50～60 min，65% C（線性梯度）。

1.3.3.4 ESI-MS/MS鑒定

采用電噴霧正離子掃描模式（ESI＋）；質量掃描范圍m/z 100～2 000；干燥氣（N2）流速為9 L/min，干燥器溫度300 ℃，霧化氣壓35 psi，毛細管電壓為3.5 kV，碎裂電壓175 V，錐孔電壓65 V，八極桿射頻電壓250 V，二級質譜碰撞電壓12～15 eV[22]。

1.3.3.5 松仁ACE抑制肽合成

采用Fmoc固相合成法，純度為99.8%，由北京中科亞光生物科技有限公司合成。

1.3.4 ACE抑制活性測定

運用紫外分光光度計測定[23]。ACE抑制活性用抑制率表示，根據(jù)下式計算：

式中：A是添加抑制劑的樣品管的吸光度；B是添加緩沖液的樣品管的吸光度；C是反應前滅酶的樣品管的吸光度。

1.3.5 肽含量的測定

采用福林-酚法測定肽含量[24]。

1.3.6 IC50值的測定

按照Balti法測定半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值[25]。當抑制率為50%時，抑制肽的濃度即為IC50，其數(shù)值由GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 紅松仁ACE抑制肽的超濾分離

圖 1 不同分子質量酶解物的ACE抑制活性Fig. 1 ACE inhibitory activities of the hydrolysates and its fractions of different molecular weights

松仁清蛋白蛋白酶解液經超濾分離得到3個組分（A1：＜3 kD、A2：3～10 kD和A3：＞10 kD），它們的ACE抑制活性如圖1所示。A1組分的ACE抑制率和比活力均高于其他組分，其中，A1組分的ACE抑制率為75.5%，比活力為132.0 %/mg，比活力極顯著高于粗酶解物（P＜0.01），因此，選擇A1組分進行下一步分離純化。

2.2 紅松仁ACE抑制肽的Sephadex G-25分離純化

圖 2 Sephadex G-25分離紅松松仁清蛋白酶解物圖譜Fig. 2 Chromatograms of the albumin hydrolysate separated on Sephadex G-25

經超濾后的組分A1在Sephadex G-25凝膠過濾層析色譜上分離得到3 個峰，分別標記為B1、B2和B3（圖2），其中組分B3峰面積大、分子質量小。將各組分收集并冷凍干燥后，用相同濃質量度溶液測定ACE抑制活性。如圖3所示，B3組分的ACE抑制率極顯著高于其他組分（P＜0.01），ACE抑制率為76.7%，比活力為319.6 %/mg，因此，選擇B3組分進行下一步分離純化。

圖 3 Sephadex G-25分離組分的ACE抑制活性Fig. 3 ACE-inhibitory activity of each fraction separated on Sephadex G-25

2.3 紅松仁ACE抑制肽的Sephadex G-15分離純化

圖 4 Sephadex G-15對組分B3的分離圖譜Fig. 4 Chromatogram of B3 separated on Sephadex G-15

利用Sephadex G-15進一步分離組分B3，得到2 個組分C1和C2（圖4）。由圖5可知，C2的ACE抑制率顯著高于其他組分（P＜0.01），可能是因為C2的分子質量比C1小，因此含有更多的具有抑制活性的肽。經過Sephadex G-15分離純化后，ACE抑制肽的抑制活性得到大幅度提升。組分C2的抑制率達到91.6%，比活力高達352.3 %/mg。因此，選擇組分C2進行下一步純化。

圖 5 Sephadex G-15分離組分活性比較Fig. 5 ACE-inhibitory activity of each fraction separated on Sephadex G-15

2.4 紅松仁ACE抑制肽的RP-HPLC分離

圖 6 組分C2和D2的RP-HPLCFig. 6 Reverse-phase high performance liquid chromatography of fraction C2 and D2

組分C2經RP-HPLC分離后得到的色譜圖如圖6A所示。C2仍非單一組分，重復收集3 個主要組分峰，分別命名為D1、D2和D3，濃縮并冷凍干燥。對峰D2進行RP-HPLC驗證（圖6B），可知D2組分為單一純品。

2.5 紅松仁ACE抑制肽的質譜鑒定和分析

組分D2進行ESI-MS/MS分析。經過一級MS和二級MS（圖7），獲得片段的質荷比（m/z），通過從頭測序（de novo sequence）的方法[26]，對D2進行分析，結果得到一個具有很高ACE抑制活性的多肽，氨基酸序列為Tyr-Leu-Leu-Lys（YLLK），分子質量為535.34 D。

圖 7 YLLK的二級質譜圖Fig. 7 Tandem mass spectrum of YLLK

2.6 紅松仁ACE抑制肽的活性驗證

在得到松仁ACE抑制肽的氨基酸序列后，通過合成得到大量的松仁ACE抑制肽，其純度達到99.80%。YLLK的IC50值測定結果為0.282?5?μmol/L。

3 討論與結論

本研究從長白山紅松仁中得到的ACE抑制肽序列Tyr-Leu-Leu-Lys（YLLK）與以前報道的已知氨基酸序列的活性多肽進行比較分析，可推斷其潛在ACE抑制活性[27]。大多數(shù)鑒定出的多肽序列中均包含了潛在的ACE抑制肽。YLLK含有4 個氨基酸，分子質量為535.34 D，這與目前已報道的ACE抑制肽的分子質量的范圍在300～1 600 D相符，分子質量較大的多肽可能是由于其分子結構決定了它不能和ACE的活性位點有效結合。迄今為止，ACE抑制肽的活性與結構之間的關系尚不明確。不同的ACE抑制肽的結構，如三肽序列的C-末端能與ACE產生強烈的結合[28]；ACE抑制肽支鏈的N-末端可以有效增強對ACE的抑制活性[29]。研究發(fā)現(xiàn)，在具有較強的ACE抑制活性的肽中C-末端氨基酸殘基多為Pro、Tyr、Phe、Leu和Trp，C-末端氨基酸比N-末端氨基酸對ACE抑制活性的影響更大[30]。多肽YLLK的C-末端氨基酸均為Tyr，因此其ACE抑制活性很高，IC50值為0.282?5?μmol/L。本研究可為松仁蛋白的開發(fā)和高附加值利用提供實驗依據(jù)，同時也可為安全有效無副作用降血壓肽的開發(fā)提供研究基礎。

本研究通過酶解松仁清蛋白獲得高ACE抑制率的酶解產物，接著利用超濾系統(tǒng)、Sephadex G-25、Sephadex G-15和RT-HPLC分離純化得到組分D1、D2、D3。組分D2進行結構鑒定，最終鑒定出氨基酸序列為Tyr-Leu-Leu-Lys的ACE抑制肽，分子質量535.34 kD。該肽經固相合成純度為99.80%，IC50值測定結果為0.282?5?μmol/L。本研究可為長白山紅松資源的深度開發(fā)和綜合利用提供基礎數(shù)據(jù)和科學參考。

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Isolation, Purif i cation and Structural Analysis of ACE Inhibitory Peptides Derived from Red Pine (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) Nuts Albumin

MIAO Xinyu, WANG Zuhao, WANG Peng, FANG Li, WANG Ji, MIN Weihong*
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

In this study, the composition and structural characteristics of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from albumin extracted from red pine nuts were evaluated. The hydrolysate of albumin was separated by ultrafiltration, Sephadex G-25, Sephadex G-15 and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RPHPLC).?The?structural?characteristics?of?the?purif i ed?fraction?(D2)?were?identif i ed?by?electrospray?ionization?tandem?mass?spectrometry (ESI-MS/MS), and one ACE inhibitory peptide was obtained with amino acid sequence of Tyr-Leu-Leu-Lys (YLLK) and molecular mass of 535.34 D. According to the amino acid sequence, an ACE inhibitory peptide was synthesized with a purity of 99.8%.?The?half?maximal?inhibitory?concentration?value?of?YLLK?was?0.282?5?μmol/L.

red?pine?nut?albumin;?ACE?inhibitory?peptide;?isolation?and?purif i cation;?amino?acid?sequence

10.7506/spkx1002-6630-201705021

TS255.6

A

1002-6630（2017）05-0129-05

苗欣宇, 王祖浩, 王鵬, 等. 紅松仁清蛋白ACE抑制肽的分離純化與結構鑒定[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 129-133.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705021. http://www.spkx.net.cn

MIAO Xinyu, WANG Zuhao, WANG Peng, et al. Isolation, purif i cation and structural analysis of ace inhibitory peptides derived from red pine (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) nuts albumin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 129-133. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705021. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國家高技術研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102206）

苗欣宇（1991—），女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：miaoxinyu911204@qq.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程、糧油科學與深加工技術。E-mail：minwh2000@162.com