崗梅枝枯病病原鑒定

何凌冰，吳惠萍，游春平，陳炳旭，韓正洲，徐 冰，蘭金旭，邢建永

（1.深圳國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，廣東 深圳 518000；

2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225；

3. 廣東省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，廣東 廣州 510640；

4. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518000）

崗梅枝枯病病原鑒定

何凌冰1，吳惠萍2，游春平2，陳炳旭3，韓正洲4，徐 冰4，蘭金旭4，邢建永4

（1.深圳國家高技術(shù)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新中心，廣東 深圳 518000；

2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225；

3. 廣東省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，廣東 廣州 510640；

4. 華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳 518000）

崗梅是一種具有重要藥用價(jià)值的植物，在我國主要分布于廣西、廣東、福建、江西、湖南和臺(tái)灣等地。崗梅枝枯病是崗梅生產(chǎn)上的重要病害。根據(jù)Koch’s法則，對崗梅枝枯病病原分離物進(jìn)行致病性測定，并利用真菌通用引物ITS1和ITS4對該病原菌的rDNA間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)（ITS）進(jìn)行擴(kuò)增和序列分析，結(jié)果顯示，在GenBank上，與該病菌ITS序列相似度在99%以上的均是葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。因此，初步將崗梅枝枯病病原鑒定為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。

崗梅枝枯?。恢虏⌒詼y定；病原鑒定；間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)

崗梅（Ilex asprella），別名星樹、土甘草、天星木、百解茶，屬于雙子葉植物綱無患子目冬青科冬青屬的梅葉冬青［1］。主要分布于廣東、廣西、海南、江西、湖南、福建、浙江、安徽、湖北、江蘇、臺(tái)灣等地。崗梅在臨床應(yīng)用非常廣泛，是華南地區(qū)較常用的一種中藥材，具有清熱解毒、生津、利咽和散瘀止痛之功效，通常應(yīng)用于感冒發(fā)熱、扁桃體炎、氣管炎、咽喉炎和腸炎等［2］；其葉片對心絞痛、冠心病等有一定療效［3］。由于崗梅獨(dú)特的藥用價(jià)值，其需求量也越來越大。隨著崗梅大面積栽培與發(fā)展，一些病蟲害也相繼發(fā)生，其中崗梅枝（莖）枯病尤其嚴(yán)重，發(fā)病率為5%～30%，為害重的整株枯死率可達(dá)10%，嚴(yán)重影響崗梅的生產(chǎn)發(fā)展。目前關(guān)于崗梅枝枯病病原的報(bào)道，袁勤峰等［4］認(rèn)為是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides complex），但是否還有其他病原菌并不清楚。為此，我們對崗梅枝枯病的病原進(jìn)行鑒定，研究結(jié)果對病害防治具有重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物崗梅（Ilex asprella）苗，株高約40 cm，由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司提供。

罹病崗梅采自梅州市平遠(yuǎn)縣。

培養(yǎng)基PDA配方參照《植病研究法》［5］。

1.2 崗梅枝枯病病原菌的分離、純化和致病性測定

測定方法參照方中達(dá)《植病研究法》并作適當(dāng)修改，病原菌純化采用單菌絲片段分離法。分離物的接種方法：將分離和純化的菌絲塊（1 cm×1 cm）接種（針刺法）于無病健康且長勢相近的6株崗梅幼苗莖部，用濕潤的棉花覆蓋固定好，接種無菌PDA培養(yǎng)基（1 cm×1 cm）作為對照，保濕培養(yǎng)5～10 d后，觀察分離物的致病情況。

對接種發(fā)病的崗梅病組織進(jìn)行病原菌分離純化，比較該分離物與原接種物的形態(tài)和分子特征，最后將該分離物再次進(jìn)行致病性測定。

1.3 真菌DNA提取

利用SDS方法［6］提取病原真菌總基因組DNA，其方法如下：（1）用滅菌的藥匙收集菌絲到研缽中，加入DNA提取液開始研磨，研磨至無成型菌絲（研磨時(shí)間不可超過30 min），然后用移液槍分裝于2 mL離心管中。（2）放入離心機(jī)進(jìn)行離心（4℃，8 000 r/min）10 min，取出后重復(fù)1次。（3）把全部上層清液置于新的離心管中，加入0.5 mL異丙醇，上下震蕩搖勻，放入離心機(jī)進(jìn)行離心（4 ℃，12 000 r/min）10 min。（4）棄去上層清液，加入75 %酒精500 μL洗2 次。（5）棄去上層清液，靜置風(fēng)干，加入30 μL ddH2O溶解DNA，在室溫靜置1 h后輕輕搖動(dòng)加入氯仿混勻后離心（12 000 r/min）1 min。（6）取上層清液于新的離心管中，加入清液1/10 倍體積的醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，在-20℃放置20～30 min，然后離心（12 000 r/min）10 min。（7）加入50 μL 75%乙醇洗1～2次，風(fēng)干，然后加入50 μL ddH2O，用于溶解DNA。（8）采用瓊脂凝膠電泳檢測DNA提取物。

1.4 病原菌的分子（ITS）鑒定

采用真菌通用引物［7］（I T S 1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 /ITS4：5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）對崗梅莖部真菌的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：上游引物（5 μmol/L）1 μL、下游引物（5 μmol/L）1 μL、Mix 12.5 μL、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存。

最后將PCR擴(kuò)增片段送往北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank（Http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）上進(jìn)行BLAST同源性對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 崗梅枝枯病的癥狀特點(diǎn)

從發(fā)病植株可見，崗梅莖部發(fā)病時(shí)枝條首先產(chǎn)生較小的褐色病斑，褐色病斑逐漸變成深褐色并有增大趨勢，進(jìn)而枝條上的葉片凋落，枝條干枯，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致整株枯死（圖1，彩插一）。

2.2 崗梅枝枯病分離物的致病性測定

將從崗梅莖部患病組織分離的真菌菌株進(jìn)行致病性測定，結(jié)果顯示，4個(gè)分離物當(dāng)中，只有分離物二（圖2，彩插一）在接種后14 d引起崗梅枝條出現(xiàn)深褐色病變（圖3，彩插一），分離物一、三、四沒有引起病害。從接種后崗梅發(fā)病枝條病健交界處的組織上再次分離純化病原真菌，此菌的菌落形態(tài)和分子特征（ITS）與原分離物二的結(jié)果一致（圖2、圖4）。

圖4 利用真菌通用引物ITS擴(kuò)增的病原菌ITS片段

2.3 病原菌的分子（ITS）鑒定

利用真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3'）對病原真菌的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段大小約為600 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖5）。將擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，與崗梅枝枯病病原菌的ITS序列相似度在99 %以上的菌株（表1）均為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea Ces.& DeNot.）。

圖5 崗梅患病部位病原菌DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果

表1 病原菌ITS堿基序列在GenBank中的相似比較結(jié)果

3 結(jié)論與討論

目前關(guān)于真核微生物的鑒定，通常利用其高度保守區(qū)rDNA間隔轉(zhuǎn)錄區(qū)間（ITS）特征進(jìn)行鑒定。ITS之所以成為系統(tǒng)與進(jìn)化研究中的重要分子標(biāo)記，主要是因?yàn)椋海?）作為18S～28S rDNA的一個(gè)組成部分，ITS 區(qū)在核基因中是高度重復(fù)的，而且通過不等交換或基因交換，這些重復(fù)單位間已發(fā)生了位點(diǎn)內(nèi)或位點(diǎn)間的同步進(jìn)化，即不同ITS拷貝間的序列趨于相近或完全一致，這就為對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序奠定了理論基礎(chǔ)；（2）ITS區(qū)序列短，且ITS1、ITS2分別位于18S～5.8S、5.8S～28S rDNA之間，而18S、5.8S和28S rDNA的序列又非常保守，這就可以與它們序列互補(bǔ)的通用引物對ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。目前研究中所用的引物即是White等［8］設(shè)計(jì)并通用于真核生物。利用通用引物對ITS區(qū)段進(jìn)行PCR序列分析早已用于Verticillium dahliae和V. albo-atrum［9］、

Leptosphaeria maculans［10］和Fusarium sp.［11］的分類鑒定之中。本研究利用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增rDNA-ITS序列，通過比對，初步認(rèn)為引起崗梅枝枯病的病原是葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea Ces. & DeNot.），這與袁勤峰等［4］報(bào)道的崗梅枝枯病病原（是膠孢炭疽菌復(fù)合種

Colletorichum gloeosprioides complex）不同，其原因可能是樣本采集的地點(diǎn)和時(shí)間不同，也可能是引起崗梅枝枯病的病原存在多個(gè)種類，其原因有待進(jìn)一步深入研究。

［1］ 江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典（上冊）［M］. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986：1122.

［2］ 吳喜英，王明軍，許為民. 復(fù)方崗梅合劑的臨床療效觀察「J］. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（7）：1735.

［3］ 廣東省食品藥品監(jiān)督管理局. 廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第一冊）［M］. 廣州：廣東科技出版社，2004：111-113.

［4］ 袁勤峰，鄭露，劉浩，等. 廣東崗梅枝枯病病原鑒定及生物學(xué)特性研究//中國植物病理學(xué)會(huì)2015年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集［C］. 2015.

［5］ 方中達(dá). 植病研究方法［M］. 第3版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

［6］ Lee S B，Taylor J W. Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores. In PCR protocols guide to methods and applications［J］. California：Academic Press，1990，7：282-287.

［7］ 周曉云，游春平. 紅掌根腐病病原菌鑒定及其PCR檢測方法［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（5）989-996.

［8］ White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics，in Book：PCR -Protocols and Applications［J］. New Yorks：Academic Press，1990，38：315-322.

［9］ Nazar R N，Hu X，Schmidt J，et al. Potential use of PCR-amplified ribosomal intergenic sequences the detection and differentiation of Verticillium wilt pathogens［J］. Physio. Mol. Plant pathol，1991，39：1-11.

［10］ Xue B，Goodwin P H，Annis SL. Pathotype identification of Leptosphaeria maculans with PCR and oligonucleitide primers from ribosomal internal transcribed spacer sequences［J］. Physio. Mol. Plant pathol，1992，41：179-188.

［11］ Schilling A G. Polymerase chain reaction-based assays for species-specific detection of Fusarium culmorum，F(xiàn). graminearum，and F. avenaceum［J］. Phytopathology，1996，86：515-522.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Identification of the pathogen causing branch blight of Ilex Asprella

HE Ling-bing1，WU Hui-ping2，YOU Chun-ping2，CHEN Bing-xu3，HAN Zheng-zhou4，XU Bing4，LAN Jin-Xu4，XING Jian-yong4
（1. State High-tech Industrial Innovation Center in Shenzhen，Shenzhen 518000，China；
2. College of Agriculture，Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225，China；
3. Institute of Plant Protection，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；
4. Sanjiu Medical and Pharmaceutical Co. Ltd，Shenzhen 518000，China）

Branch blight was a very important disease in Ilex asprella，occurring mainly in Pingyuan，Maoming of Guangdong province in recent years. Isolation and pathogenicity test of the pathogen of branch blight of I. asprella were carried out based on Koch’s postulation. For a molecular identification，18S-28S rDNA internal transcribed spacer（ITS）region was amplified from the pathogen with primers ITS1 and ITS4，obtaining a PCR product of 600 bp. A BLAST search in GenBank revealed the highest similarity（99%-100%）to the sequences of Botryosphaeria dothidea strains. Therefore，the pathogen causing branch blight of I. asprella was preliminarily identified as Botryosphaeria dothidea.

branch blight of Ilex asprella；pathogenicity test；pathogen identification；ITS

S435.67

A

1004-874X（2017）01-0111-04

2016-09-18

工業(yè)和信息化部中藥材生產(chǎn)建設(shè)項(xiàng)目（［2014］737 號(hào)）

何凌冰（1966-），男，碩士，執(zhí)業(yè)藥師，E-mail: chengjn@stu.scau.edu.cn

游春平（1962-），男，博士，教授，E-mail：chunpingyou@sina.com

何凌冰，吳惠萍，游春平，等. 崗梅枝枯病病原鑒定［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（1）：111-114.