3種復(fù)方中藥含藥血清對(duì)NCI—H460細(xì)胞抑制作用的研究

廖遙靈　王柳萍　韋云妮　楊斌

【摘要】 目的：觀察3種復(fù)方中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞的抑制作用。方法：選用健康成熟SD大鼠，將大鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、A復(fù)方組、B復(fù)方組、C復(fù)方組、環(huán)磷酰胺組，給藥后分離血清，56 ℃滅活30 min，用MTT法檢測(cè)含藥血清在24、48 h時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果：24、48 h，三種復(fù)方中藥含藥血清的5%、10%、20%、30%濃度對(duì)NCI-H460細(xì)胞均有不同程度的抑制作用（P<0.01），尤以B復(fù)方組對(duì)NCI-H460細(xì)胞作用明顯，并呈一定的劑量依賴性。結(jié)論：3種復(fù)方中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方中藥； NCI-H460細(xì)胞； 血清藥理學(xué)

隨著環(huán)境污染的增加及人們各種不良的生活習(xí)慣，癌癥的發(fā)病率正在不斷上升[1]。癌癥是一大類惡性腫瘤的統(tǒng)稱，是目前嚴(yán)重危害人類健康的一大頑癥，嚴(yán)重威脅著人類的生活質(zhì)量，被稱為人類健康的第一殺手[2]。肺癌屬于中醫(yī)學(xué)肺積、咳嗽、咯血、胸痛等范疇，一般認(rèn)為肺癌的發(fā)生是由于人體正氣不足，陰陽(yáng)氣血失調(diào)，使臟腑經(jīng)絡(luò)的功能發(fā)生障礙，機(jī)體抗病能力降低，邪氣乘虛而入，滯留于肺，日久形成腫塊而成肺癌[3]。目前，癌癥的預(yù)防和治療方法已經(jīng)有很多，雖然療效顯著，但是毒副作用大的問(wèn)題使很多藥的臨床應(yīng)用受到了限制[4]。中草藥以其毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)在腫瘤治療領(lǐng)域越來(lái)越受重視。中草藥復(fù)方、單味藥提取物或一些單體成分可抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、清除活性氧自由基、提高機(jī)體抗氧化酶活力[5-6]，從而抑制癌癥。近年來(lái)，中草藥在抗癌方面取得了很大的成就，其機(jī)制是非常復(fù)雜的，不能簡(jiǎn)單的用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的某個(gè)觀點(diǎn)來(lái)概括說(shuō)明[7]。中醫(yī)藥對(duì)腫瘤治療的主要理論基礎(chǔ)是扶正、固本、驅(qū)邪，目前的研究主要集中于單味藥的研究，多為體外試驗(yàn)[8]。本研究采用了夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥，共有3個(gè)復(fù)方，各復(fù)方中草藥的配伍組成和含量不同，A復(fù)方由8種中草藥組成，B復(fù)方由其中4種中草藥配伍組成，C復(fù)方由其中2種中草藥配伍組成。夏枯草為唇形科夏枯草屬植物，主要含有三萜及其苷類 苯丙素類、甾醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等[9]，味辛、苦，性寒，有降糖、降壓、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤及活血化瘀等功效[10]。膽南星為制天南星的細(xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)加工而成，或?yàn)樯炷闲羌?xì)粉與牛、羊或豬膽汁經(jīng)發(fā)酵加工而成，在臨床上用于痰熱咳嗽，咳痰黃稠，中風(fēng)痰迷，癲狂驚癇等癥[11]。玄參為玄參科植物玄參的干燥塊根，是常用的傳統(tǒng)中藥；其味甘、苦、咸、性微寒，具涼血滋陰、瀉火解毒的功效[12]，現(xiàn)臨床主要用于熱病煩渴、發(fā)斑、齒齦炎、扁桃體炎、急性淋巴結(jié)炎等[13]。龍血竭又名麒麟竭，為傳統(tǒng)名貴中藥，國(guó)產(chǎn)龍血竭的化學(xué)成分有黃酮、苷類、酚類、糖類等化合物[14]，龍血竭不溶于水，具有抗炎、止痛的作用，能抑制毛細(xì)血管的通透性，減少滲出，明顯抑制腫脹、縮短凝血時(shí)間，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，有效改善機(jī)體的免疫功能[15]。冰糖草為玄參科植物野甘草的全草，是壯族地區(qū)常用的一味壯藥，其味甜，性涼，具有清熱毒、除濕毒、通氣道和水道的功效[16]，主治感冒發(fā)熱，肺熱咳嗽，咽喉腫痛，腸炎，痢疾，腳氣水腫等[17]。我國(guó)現(xiàn)有中藥材資源12 807種，是世界上最大的藥材生產(chǎn)國(guó)。以傳統(tǒng)中草藥的理論和數(shù)千年臨床實(shí)踐為基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)代藥學(xué)理論和技術(shù)，嚴(yán)格進(jìn)行藥學(xué)、藥效學(xué)與臨床研究，抗癌中草藥的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用將有新的更大進(jìn)展[18]。本課題采用血清藥理學(xué)聯(lián)合MTT法，研究3種復(fù)方中藥對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460細(xì)胞的體外抑制作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 健康成年的SD大鼠（200±20）g，SPF級(jí)，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK桂2014-0004。人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 由夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥按不同比例組成，由北海博鏵醫(yī)院提供。注射用環(huán)磷酰胺，0.2 g/mL，百特醫(yī)療用品貿(mào)易有限公司，批號(hào)：5F063A。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀、電子天平、恒溫水浴鍋、高壓滅菌器、-80 ℃低溫冰箱。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清制備實(shí)驗(yàn)

1.4.1.1 3種復(fù)方中藥的制備 稱取夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥按不同比例用純凈水提取，A復(fù)方，由以上8種中草藥組成；B復(fù)方由以上中草藥中的4種組成；C復(fù)方由以上中草藥中的2種組成，濃縮藥液濃度至0.1 g/mL，置冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 注射用環(huán)磷酰胺的制備 環(huán)磷酰胺治療肝癌的成人日用量為4 mg/kg，每日或隔日1次。根據(jù)人和動(dòng)物間每公斤體重折算系數(shù)表，換算出大鼠的劑量為成人用量的6倍左右（即25 mg/kg）。

1.4.1.3 含藥血清的制備 SPF健康成年的SD大鼠15只，隨機(jī)分為5組，即空白組、A復(fù)方組、B復(fù)方組、C復(fù)方組和環(huán)磷酰胺組，每組3只。給藥前禁食不禁水12 h，空白組灌胃等量的生理鹽水，A復(fù)方組、B復(fù)方組和C復(fù)方組分別以2000 mg/kg灌胃，環(huán)磷酰胺組以25 mg/kg腹腔注射。2次/d，

間隔12 h，連續(xù)給藥3 d。末次給藥后1 h腹主動(dòng)脈取血，取血后室溫下靜置4 h，3000 r/min離心

15 min，分離血清，經(jīng)56 ℃水浴滅活30 min后，0.22 ?m微孔濾膜過(guò)濾除菌，混合分裝于2 mL EP管中，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 體外抑瘤實(shí)驗(yàn)（MTT法）

1.4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從-80 ℃低溫冰箱中取出人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞，迅速放于37 ℃水浴鍋中，并來(lái)回晃動(dòng)使其在1 min內(nèi)完全融化。在超凈臺(tái)中取出細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，在1000 r/min離心5 min，棄去上層液體，將人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞置于含有10%胎牛血清及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶瓶底80%～90%，用0.25%胰蛋白酶（1%胰酶∶0.2%EDTA=1∶3）進(jìn)行消化，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.2 MTT法檢測(cè) 用不含血清的培養(yǎng)基將含藥血清稀釋成5%、10%、20%、30%的濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞株NCI-H460細(xì)胞，用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1 mL細(xì)胞懸液，板周邊的孔不加細(xì)胞，留空白調(diào)零，即只加培養(yǎng)液不加細(xì)胞，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。貼壁后吸出原培養(yǎng)液，分別加入空白組、依癌膠囊組和環(huán)磷酰胺組各個(gè)濃度的含藥血清培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 ?L，37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后，吸出原培養(yǎng)液，加入150 μL的二甲基亞砜（DM-SO），振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上于510 nm處測(cè)定每孔的吸光度（OD值），重復(fù)測(cè)3次。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率：抑制率（IR）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在所選的濃度范圍內(nèi)，3種復(fù)方中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞均有明顯的抑制作用，其中B復(fù)方組對(duì)NCI-H460細(xì)胞的抑制效果要較對(duì)A復(fù)方組和C復(fù)方組更顯著。24 h時(shí)，5%、10%、30%濃度的含藥血清對(duì)NCI-H460細(xì)胞抑制率：B復(fù)方組>環(huán)磷酰胺組>A復(fù)方組>C復(fù)方組；20%濃度的含藥血清對(duì)NCI-H460細(xì)胞抑制率：B復(fù)方組>環(huán)磷酰胺組>C復(fù)方組>A復(fù)方組。48 h，5%、10%、20%、30%濃度的含藥血清對(duì)NCI-H460細(xì)胞抑制率：B復(fù)方組>環(huán)磷酰胺組>A復(fù)方組>C復(fù)方組。A復(fù)方組、B復(fù)方組、C復(fù)方組各濃度的含藥血清與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。3種復(fù)方中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞的抑制作用影響，見(jiàn)表1。

3 討論

肺癌是一種比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年來(lái)，世界各國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率均有明顯增高的趨勢(shì)[19]。中草藥治療惡性腫瘤以其毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)廣為大家接受，中藥及其復(fù)方制劑能夠通過(guò)多種不同途徑、多種方法應(yīng)用于抗腫瘤臨床治療中，發(fā)揮獨(dú)特作用，盡可能避免正常細(xì)胞受到損傷，藥物毒副作用很小[20]。隨著中醫(yī)中藥在國(guó)際社會(huì)受重視的程度越來(lái)越高，中藥治療腫瘤將成為癌癥治療的一種重要途徑[21]。夏枯草、膽南星、玄參、龍血竭、冰糖草等8種中草藥均為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，在殺滅腫瘤細(xì)胞和緩解癥狀體征方面有明顯效果。

本課題采用血清藥理學(xué)聯(lián)合MTT法，研究

3種復(fù)方中藥對(duì)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460細(xì)胞的體外抑制作用。結(jié)果顯示，在所選的濃度范圍內(nèi)，3種復(fù)方中藥含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞均有明顯的抑制作用，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中B復(fù)方組對(duì)NCI-H460細(xì)胞的抑制效果要較對(duì)A復(fù)方組和C復(fù)方組更顯著。本課題組通過(guò)對(duì)3種復(fù)方中藥含藥血清的抑癌作用進(jìn)行研究，為該藥進(jìn)行下一步更深層次的優(yōu)選配伍研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-10） （本文編輯：程旭然）