油梨果肉DNA提取方法的比較

葛宇　林興娥　王甲水　臧小平　馬蔚紅

摘 要 為了獲取高質(zhì)量的油梨果肉DNA，以油梨果肉為試材，比較改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法對油梨果肉DNA的提取效果。結(jié)果表明：上述3種方法均可從油梨果肉中提取DNA，但改良SDS法與改良CTAB法所獲得的DNA濃度都在600 μg/mL以上，純度（OD260nm/OD280nm）均在1.8左右，純度高且完整性較好，可用于未來分子標記分析。

關(guān)鍵詞 油梨 ；果肉 ；DNA提取 ；改良SDS法 ；改良CTAB法

中圖分類號 S667.9 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.007

油梨（Persea americana Mill.）為樟科油梨屬植物，又名鱷梨、牛油果，英文名為avocado。油梨起源于中美洲、墨西哥熱帶濕潤地區(qū)及海拔較高的山地森林或熱帶高原，是著名的熱帶、亞熱帶果樹，也是一種木本油料作物[1]。油梨于1918年被引種到中國臺灣省，在海南、廣東、廣西、貴州、云南、臺灣等地均有栽培[2-5]。油梨果實形狀一般為卵圓形、倒卵圓形、圓形及梨形，重量通常為50～2 000 g[6]。油梨果肉是由果皮發(fā)育而成，富含脂肪酸、膳食纖維、蛋白質(zhì)、多酚、黃酮、葉酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分，其中油梨脂肪酸含量根據(jù)品種及種植條件的差異可達到其果實重量的15%～30%[7-8]。但對于DNA提取，多酚、黃酮、脂肪酸等物質(zhì)會使DNA氧化成褐色凝膠狀物或與DNA結(jié)合成黏稠膠狀物，阻礙其作為PCR模板進行分析[9-11]。這就需要對傳統(tǒng)的DNA提取方法加以改進，以提取出高質(zhì)量的DNA。周海蘭等[12]以油梨葉片為試材，對比了傳統(tǒng)CTAB法、改良CTAB法和試劑盒法3種方法的提取效果。結(jié)果顯示，通過改良CTAB法所提取的DNA的濃度和純度要遠高于通過傳統(tǒng)CTAB法所提取的DNA。但周海蘭等[12]僅對傳統(tǒng)的CTAB法進行了改良，而未對另一種廣泛應(yīng)用的SDS法進行改良并分析其效果。此外，油梨果肉中所含有的影響DNA提取的物質(zhì)含量，如脂肪酸、多酚、黃酮等含量，要遠高于油梨葉片[6]。所以提取油梨果肉的難度要遠高于油梨葉片。提取到高質(zhì)量的DNA或RNA是許多分子生物學(xué)實驗（PCR擴增、基因克隆、基因表達等）的初始第一步驟，而油梨作為熱帶水果，果肉是油梨研究的主要部位，對油梨果肉組織進行分子生物學(xué)實驗將有助于深入研究油梨果肉中營養(yǎng)物質(zhì)及活性成分的生成、代謝等[1，13]。前人已經(jīng)發(fā)表了有關(guān)油梨果肉RNA提取的優(yōu)化方案，但對于相對較容易的油梨果肉DNA提取優(yōu)化方案未見相關(guān)報道[13]。本實驗通過比較改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法對油梨果肉DNA的提取效果，以期獲得高效的油梨果肉DNA提取方法，為后續(xù)的分子生物學(xué)實驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用優(yōu)良油梨品系‘RN-5果實樣品于2016年8月在海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹基地采集。每個DNA提取方法重復(fù)3次。

1.2 方法

1.2.1 改良SDS法和改良CTAB法

本實驗采用的改良SDS法和改良CTAB法參照朱威龍等[14]的SDS法和CTAB法，改良之處如下：（1）在樣品研磨步驟中加入0.03 g聚乙烯吡咯烷酮；（2）在SDS提取緩沖液或CTAB提取緩沖液中加入2%（m/V）的聚乙烯吡咯烷酮；（3）在溫水水浴前，加入20 μL β-巰基乙醇，并于SDS提取緩沖液或CTAB提取緩沖液混勻；（4）水浴冷卻后加入的提取液中加入酚，并且酚與氯仿和異戊醇的體積比為25∶24∶1；（5）延長異丙醇沉淀時間到過夜。

1.2.2 試劑盒法

稱取幼嫩葉片0.2 g，加入液氮充分研磨，使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的DNA secure plant Kit（DP320）新型植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進行提取，具體操作見產(chǎn)品說明書。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測

取DNA樣品20 μL，用TE緩沖液稀釋至10倍，用紫外分光光度計測定其OD260nm和OD280nm。DNA濃度=OD260nm×10（稀釋倍數(shù)）×50（μg/mL）；DNA純度=OD260nm/OD280nm。

取DNA樣品10 μL，加入5 μL溴酚藍緩沖液，用5%瓊脂糖凝膠電泳，15 min后拍照，分析DNA的質(zhì)量和完整性。

1.2.4 EST-SSR分子標記驗證提取效果

以3種提取方法所獲得的DNA為模板，采用油梨EST-SSR引物SHRSPa003進行PCR擴增，以檢測3種DNA 提取方法的效果。油梨EST-SSR引物SHRSPa003序列信息來自Borrone等[15]的文獻，油梨EST-SSR引物PCR擴增反應(yīng)體系參照Ge等[16]的方法。擴增反應(yīng)結(jié)束后取10 μL擴增產(chǎn)物進行電泳、染色、拍照分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法所得的DNA濃度和純度

由表1可知，改良SDS法與改良CTAB法提取出的DNA濃度均超過600 μg/mL，濃度較高。2種方法純度也均超過1.8，表明DNA樣品中的蛋白質(zhì)、酚類和脂肪酸去除較為充分，雜質(zhì)較少，其DNA質(zhì)量滿足后續(xù)實驗的要求。試劑盒法提取的DNA濃度僅為其他2種方法的十分之一，DNA純度也較比其他2種方法低近1倍，其DNA質(zhì)量很難滿足后續(xù)實驗的要求。

2.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳

由圖1可知，改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法3種方法均能從油梨果肉中提取出DNA，其大小均在2.0 kb以上。改良SDS法與改良CTAB法提取的DNA量明顯高于試劑盒法，其電泳條帶也明顯比試劑盒法的亮，提取效果的穩(wěn)定性好。但改良SDS法提取DNA的3次重復(fù)所得的效果并不相同，有些DNA條帶較亮，有些較暗，重復(fù)性較比改良CTAB法較差。

2.3 EST-SSR標記PCR擴增驗證

由圖2可知，改良SDS法與改良CTAB法提取的DNA模板均可擴增出比較清晰的EST-SSR標記條帶，且穩(wěn)定性好；試劑盒法提取的DNA未成功擴增出清晰的EST-SSR標記條帶，這可能是含有較多的蛋白質(zhì)、糖、色素等反應(yīng)抑制物所導(dǎo)致的。綜上所述，改良SDS法與改良CTAB法提取的油梨果肉DNA純度高，雜質(zhì)去除充分，可滿足EST-SSR等分子標記分析的需要。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

利用紫外分光光度法測定DNA純度時，如果1.9>OD260nm/OD280nm>1.8時，表明DNA樣品受雜質(zhì)污染少，質(zhì)量高；如果OD260nm/OD280nm>1.9時，表明DNA樣品存在少量RNA；如果OD260nm/OD280nm<1.8時，表明DNA樣品存在蛋白質(zhì)等雜質(zhì)[17]。由于油梨果肉含有大量脂肪酸，利用試劑盒法提取過程中脂肪酸等物質(zhì)很容易形成粘稠的膠狀物質(zhì)，難于溶解堵塞柱子造成所獲得的DNA濃度低，質(zhì)量不高。

與寒溫帶水果相比，熱帶水果葉片、果實等各部位普遍含有更多的多糖、多酚、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，其中果實內(nèi)各種物質(zhì)又比其它部位更多，這些物質(zhì)對DNA的提取影響較大[11，18-19]。前人對熱帶水果DNA的提取，把聚乙烯吡咯烷酮和β-巰基乙醇加入到傳統(tǒng)的SDS法和CTAB法中，大幅提高了DNA的濃度與質(zhì)量，取得了較好的結(jié)果[10-12，20-23]。本實驗中的改良SDS法和改良CTAB法，在前處理期加入了聚乙烯吡咯烷酮，其可有效防止多酚氧化，并可與酚類、單寧酸、脂肪酸等共沉淀用以去除雜質(zhì)。在裂解液中加入了聚乙烯吡咯烷酮和β-巰基乙醇，可進一步抑制多酚氧化，并去除雜質(zhì)。此外，延長異丙醇沉淀時間到過夜。前人研究結(jié)果表明，異丙醇沉淀時間越長，DNA濃度越高[24]。本實驗改良CTAB法與周海蘭等[12]的改良CTAB法略有區(qū)別，本實驗額外增加了2個步驟，即水浴冷卻后加入的提取液中加入了酚和延長異丙醇沉淀時間到過夜。這2個步驟前一個可更有效地抽提DNA，而第2個步驟可提高DNA濃度。雖然油梨果肉的雜質(zhì)或抑制物質(zhì)比葉片多，但本實驗改良CTAB法增加的2個步驟使得提取的DNA純度（1.81）與周海蘭等[12]的通過改良CTAB法提取的DNA純度（1.7～2.0）大致相同。

3.2 結(jié)論

本實驗采取改良SDS法、改良CTAB法和試劑盒法3種DNA提取方案從油梨果實中提取DNA，通過比較DNA的濃度和純度，進一步通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和純度，確定了提取DNA質(zhì)量較高的方法為改良SDS法和改良CTAB法。

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