Tip30基因過表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及分子機(jī)制

程智勇 楊雁鴻 楊麗莉 李高巖 門曉彥

Tip30基因過表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及分子機(jī)制

程智勇1楊雁鴻2楊麗莉3李高巖1門曉彥4★

目的探討Tip30基因過表達(dá)對(duì)人胃癌AGS細(xì)胞增殖、凋亡的影響及相關(guān)分子機(jī)制。方法人胃癌AGS細(xì)胞中Tip30基因過表達(dá)采用腺病毒轉(zhuǎn)染法，使用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting驗(yàn)證Tip30過表達(dá)的效果，分別采用MTT法、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖、遷移情況，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡，Western blotting分析p53、Bax、Bcl?2蛋白表達(dá)。結(jié)果過表達(dá)組AGS細(xì)胞Tip30基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，Tip30過表達(dá)后，細(xì)胞增殖、體外遷移能力均顯著減弱（P＜0.05）；Tip30過表達(dá)后AGS細(xì)胞凋亡率相比對(duì)照組顯著增大，Tip30過表達(dá)促進(jìn)AGS細(xì)胞凋亡與上調(diào)p53、Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl?2蛋白表達(dá)水平相關(guān)。結(jié)論Tip30基因過表達(dá)可抑制人胃癌AGS細(xì)胞增殖活性、體外遷移能力，且促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。

人胃癌細(xì)胞；Tip30基因；細(xì)胞增殖；凋亡；遷移

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人胃癌細(xì)胞株AGS購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，real?time PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；新生胎牛血清、RPMI?1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；MTT、DMSO、EDTA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Tip30基因過表達(dá)腺病毒購(gòu)自漢恒生物科技（上海）公司；鼠抗人Tip30抗體為美國(guó)Imgenex公司；p53、Bax、Bcl?2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；PBS溶液、胰蛋白酶、細(xì)胞裂解液、青霉素、鏈霉素購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)公司；GAPDH抗體、羊抗鼠或羊抗兔二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)公司；Annexin V?FITC、碘化丙啶（PI）購(gòu)自美國(guó)BD公司；引物合成委托Invitrogen公司。流式細(xì)胞儀（BD，US），熒光顯微鏡（Olympus，日本），凝膠成像分析系統(tǒng)、Real?time PCR檢測(cè)儀（Bio?Rad，US），酶標(biāo)儀（Bio?Tek，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

AGS細(xì)胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清的RP?MI?1640培養(yǎng)基，在37℃、20%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%左右時(shí)，用胰蛋白酶消化后傳代，分成3～4個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)轉(zhuǎn)染及分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

過表達(dá)組為轉(zhuǎn)染Tip30過表達(dá)腺病毒的AGS細(xì)胞，對(duì)照組為AGS細(xì)胞，不做其它處理。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胃癌AGS細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前12 h種植6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到40%左右時(shí)，更換不含胎牛血清的RPMI?1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)3 h，之后按照感染復(fù)數(shù)MOI等于100的濃度添加Tip30過表達(dá)腺病毒，轉(zhuǎn)染時(shí)長(zhǎng)為4 h，轉(zhuǎn)染完成后更換含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)所需的時(shí)長(zhǎng)。

1.4 Real?time PCR檢測(cè)mRNA水平

2.2.1 患者感染和微生物學(xué)檢查情況 在136例用藥患者中，12例肺部感染，3例高熱，2例真菌感染，2例腹腔感染，6例皮膚真菌感染，5例足趾真菌感染，5例灰指甲。103例送微生物學(xué)檢查，送檢率為 75.74%，其中 35 例（1，3）-β-葡聚糖實(shí)驗(yàn)（G 實(shí)驗(yàn)）陽(yáng)性，1例可疑陽(yáng)性；7例白色念珠菌陽(yáng)性，1例光滑念珠菌陽(yáng)性，3例真菌陽(yáng)性 （無具體菌屬），56例G試驗(yàn)陰性、作預(yù)防感染用藥。

Tip30過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染后48 h收集兩組細(xì)胞，每孔添加適量Trizol和氯仿，移液器吹打裂解細(xì)胞，提取總RNA，去基因組后檢測(cè)RNA純度，純度合格且無蛋白質(zhì)污染，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。據(jù)Tip30基因片段設(shè)計(jì)引物，上游引物為5′?GTCTTTATTTT?GGGCGCCAG?3′，下游引物為5′?CCCAGC TTTCCCTCTGGTGG?3′。內(nèi)參β?actin上游引物為5′?GCCTCCGGCAGGACCACCGG?3′，下游引物為5′?CGGTGAGATCGCGGCCCGCC?3′。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書具體步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行定量分析，以每個(gè)樣本中的β?actin作為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性30 s，目的基因Tip30 60℃退火30 s，內(nèi)參β?actin 55℃退火30 s，72℃延伸1 min，總共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖濃度為1.5%的凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中使用紫外燈觀察DNA條帶，拍照并保存。每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算分析使用2?△△Ct方法。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖使用96孔板，分別在過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束后每孔添加20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用移液器移棄MTT，加DMSO后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在490 nm處的吸光度值（OD490nm），未接種細(xì)胞的孔加入RPMI?1640培養(yǎng)基作為調(diào)零孔。細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率等于每組細(xì)胞各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光值與第12 h吸光值的比值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h收集包括上清及貼壁的全部細(xì)胞，PBS懸浮漂洗2次，每個(gè)樣品加入5 μL Annexin V?FITC按照試劑盒說明書操作進(jìn)行染色，避光反應(yīng)0.5 h，加入10 μL PI后1 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.7 Western blotting分析蛋白表達(dá)

Tip30基因過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染后48 h收集每組AGS細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液裂解完全，收集上清，測(cè)定樣品蛋白濃度，加上樣緩沖液后高溫變性，樣品行SDS?PAGE電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后孵育一抗，4℃搖床孵育過夜，其中Tip30、Bax、Bcl?2抗體稀釋比例為1∶1 000，GAPDH稀釋比例為1∶2 000，一抗孵育完成后進(jìn)行二抗常溫孵育2 h，二抗稀釋比例為1∶4 000；二抗孵育完成后暗房顯影、定影，膠片掃描后蛋白條帶用Image J軟件進(jìn)行灰度檢測(cè)與半定量分析。

1.8 劃痕試驗(yàn)考察癌細(xì)胞遷移能力

人胃癌細(xì)胞AGS過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染后12 h，移棄RPMI?1640培養(yǎng)基，用無菌移液器槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)6孔板底部劃出1條痕跡，用PBS清洗2次，去除漂浮細(xì)胞后添加含10%血清的RPMI?1640培養(yǎng)基，在CO2細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下計(jì)數(shù)同一視野中裂痕上的細(xì)胞個(gè)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)3次，求平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 Tip30過表達(dá)效果

與對(duì)照組比較，過表達(dá)組AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，Tip30 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）（圖1），過表達(dá)組Tip30蛋白表達(dá)也相應(yīng)明顯增多，見圖2。

2.2 Tip30基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組比較，過表達(dá)組AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染60 h、72 h后，細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P＜0.05），其它時(shí)間點(diǎn)兩組間細(xì)胞數(shù)量比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 RT?PCR分析AGS細(xì)胞中Tip30 mRNA的表達(dá)水平Figure 1 The analysis of Tip30 mRNA expression level in AGS cells by RT?PCR

圖2 Western blotting檢測(cè)AGS細(xì)胞中Tip30蛋白表達(dá)Figure 2 The protein expression level of Tip30 in AGS cells was examined by western blotting

2.3 Tip30基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞AGS凋亡的作用及相關(guān)分子機(jī)制

過表達(dá)組AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞凋亡率為（14.28±3.16）%，明顯大于對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（2.04±0.37）%，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。

Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，過表達(dá)組AGS細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞凋亡分子p53、Bax蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），抗凋亡分子Bcl?2蛋白表達(dá)水平則明顯下降（P＜0.05），見圖5。

圖3 Tip30過表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Figure 3 The influence of Tip30 overexpression on cell growth of AGS

圖4 Tip30基因過表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞凋亡率的影響Figure 4 The effects of Tip30 gene overexpression on cell apoptosis rate in gastric cancer AGS cells

2.4 Tip30基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞AGS遷移性能的影響

過表達(dá)組在24 h裂痕上遷移的細(xì)胞數(shù)目為（91±13）個(gè)，對(duì)照組遷移的細(xì)胞數(shù)目為（178±29）個(gè)，兩組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明過表達(dá)組細(xì)胞遷移能力弱于對(duì)照組。

3 討論

腫瘤抑制基因Tip30與多種腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移具有一定的關(guān)系，如肝癌、食管鱗狀上皮癌、肺癌及喉鱗狀細(xì)胞癌瘤等［2?3，7］。Tip30在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)缺失率為49.1%，正常組織中的缺失率為0%［4］。血清Tip30水平可作為卵巢癌、膽囊癌預(yù)后和診斷的分子標(biāo)記［8?9］。Tip30低水平表達(dá)與胰腺癌患者不良預(yù)后關(guān)系密切［5］。Tip30基因缺失可通過激活胞質(zhì)和胞核內(nèi)EGFR信號(hào)通路促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)肺腺癌的生長(zhǎng)［10］。此外，Tip30還與化療藥物敏感性增強(qiáng)有關(guān)［11］，如二甲雙胍通過上調(diào)肝癌細(xì)胞Tip30基因表達(dá)抑制索拉非尼的促肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用［12］。

本研究結(jié)果顯示，人胃癌細(xì)胞AGS中Tip30基因過表達(dá)可顯著抑制細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)染后60 h細(xì)胞數(shù)目明顯減少，Tip30基因過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，還使體外遷移的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力。多項(xiàng)研究報(bào)道Tip30基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等關(guān)系密切。Tip30基因過表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和體外侵襲能力［13］。microRNA?10b通過抑制非小細(xì)胞肺癌和胰腺癌細(xì)胞Tip30基因表達(dá)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性能［14?15］。TGF?β1可通過沉默食管癌細(xì)胞Tip30基因表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［16］。過表達(dá)Tip30基因的HepG2肝癌細(xì)胞明顯降低了基質(zhì)金屬蛋白酶?2/ 9mRNA表達(dá)和蛋白的翻譯，肝癌細(xì)胞的增殖、錨定非依賴性生長(zhǎng)及肝癌細(xì)胞遷移能力均明顯受到抑制［17］。抑制胰腺癌細(xì)胞系Capan?2細(xì)胞內(nèi)源性Tip30表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖克隆形成和成瘤能力，使另一胰腺癌細(xì)胞系PANC?1細(xì)胞中Tip30過表達(dá)，則抑制腫瘤細(xì)胞增殖克隆形成和成瘤能力［4］。上述結(jié)果為本研究結(jié)論提供一定支持。

Tip30基因表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、延遲腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展及抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力［18］。研究表明，Tip30可通過誘導(dǎo)抑癌基因p53、促凋亡因子Bax表達(dá)，抑制Bcl?x1表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡［19］。若Tip30發(fā)生基因缺失或突變，將下調(diào)p53基因的表達(dá)，抑癌效應(yīng)減弱，腫瘤細(xì)胞增殖活性相應(yīng)增強(qiáng)，生長(zhǎng)速度加快［18］。本研究結(jié)果表明，Tip30過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡，與上調(diào)p53、Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl?2蛋白表達(dá)相關(guān)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。腺病毒載體表達(dá)Tip30基因可通過p53基因依賴性或非依賴性途徑抑制胃癌細(xì)胞株和骨肉瘤細(xì)胞株的增殖生長(zhǎng)，是一種潛在的腫瘤生物治療手段［20］。綜上所述，人胃癌細(xì)胞AGS中Tip30基因過表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性及體外遷移能力，并促進(jìn)凋亡，作用機(jī)制與上調(diào)p53基因表達(dá)有關(guān)。

圖5 Tip30基因過表達(dá)對(duì)胃癌AGS細(xì)胞中相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的作用Figure 5 The effects of Tip30 gene overexpression on relevant apoptotic protein expression levels in gastric cancer AGS cells

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The effect and molecular mechanism of Tip30 gene overexpression on cell growth in human gastric cancer cells

CHENG Zhiyong1,YANG Yanhong2,YANG Lili3,LI Gaoyan1,MEN Xiaoyan4★
(1.The first department of general surgery,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China, 066000;2.The second department of tumor,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China, 066000;3.Information section,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China,066000; 4.The endocrinology department,Haigang hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Qinhuangdao,Hebei, China 066000)

ObjectiveTo investigate the effect and underlying molecular mechanism of Tip30 gene overexpression on cell proliferation and apoptosis in human gastric cancer AGS cells.MethodsAdenovirus transfection was used to overexpress the Tip30 gene in human gastric cancer AGS cells.Tip30 overexpression was verified by real?time PCR and western blot.Cell proliferation was analyzed with the MTT method,a wound scratch assay was used to monitor cell migration activity,and the cell apoptosis rate was detected with flow cytometry.The expression level of p53,Bax and Bcl?2 was detected with western blot.ResultsThe mRNA and protein levels of Tip30 in human gastric cancer AGS cells were significantly higher in the overexpression group compared with the control group(P＜0.05).The proliferation and migratory ability of AGS cells in vitro were decreased when Tip30 was overexpressed(P＜0.05).The cell apoptosis rate was significantly increased in Tip30 overexpressing cells,and a corresponding up?regulation of p53 and Bax anddown?regulation of Bcl?2 was also observed.ConclusionOverexpression of Tip30 in human gastric cancer AGS cells inhibits both cell proliferation and migration in vitro,and enhances the AGS cell apoptosis.

Human gastric cancer;Tip30 gene;Cell proliferation;Apoptosis;Migration

秦皇島市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2012023A130)

1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院普外一科，河北，秦皇島066000 2.河北省秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤二科，河北，秦皇島066000 3.河北省秦皇島市第一醫(yī)院信息科，河北，秦皇島066000 4.秦皇島市海港醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北，秦皇島066000

★通訊作者：門曉彥，E?mail:mfcx55@163.com