基于高通量測(cè)序技術(shù)的堆肥對(duì)蘭州百合根際微生物多樣性的影響

郝海婷，王若愚，趙 霞，王 筠，郭志鴻，張玉寶，謝忠奎

(1.中國(guó)科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 生態(tài)與農(nóng)業(yè)研究室(皋蘭生態(tài)與農(nóng)業(yè)綜合研究站)，蘭州 730000；2.甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.中國(guó)科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 沙漠與沙漠化研究室，蘭州 730000)

基于高通量測(cè)序技術(shù)的堆肥對(duì)蘭州百合根際微生物多樣性的影響

郝海婷1,2,3，王若愚1,2,3，趙 霞1,2,3，王 筠3,4，郭志鴻1,2,3，張玉寶1,2,3，謝忠奎1,2,3

(1.中國(guó)科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 生態(tài)與農(nóng)業(yè)研究室(皋蘭生態(tài)與農(nóng)業(yè)綜合研究站)，蘭州 730000；2.甘肅省寒區(qū)旱區(qū)逆境生理與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4.中國(guó)科學(xué)院 寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所 沙漠與沙漠化研究室，蘭州 730000)

以蘭州百合為試材，基于llumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，探討施用堆肥與化肥對(duì)蘭州百合鱗莖鮮質(zhì)量及根際土壤細(xì)菌和真菌微生物群落的影響。結(jié)果表明，有機(jī)堆肥對(duì)增加百合鱗莖鮮質(zhì)量作用顯著，相比化肥增產(chǎn)76.6%。物種注釋結(jié)果顯示，細(xì)菌的門、綱、目、科、屬的數(shù)量在施用堆肥的土壤中都大于施用化肥的土壤，而經(jīng)施用化肥處理的土壤中的真菌各個(gè)分類水平的數(shù)量大于施用有機(jī)肥的。從豐富度指數(shù)(Chao1)和多樣性指數(shù)(Shannon)分析，細(xì)菌群落整體變化小于真菌群落的變化。施用有機(jī)肥或化肥的樣品，一些細(xì)菌屬的相對(duì)豐度變化不明顯，這些細(xì)菌屬包含的大多數(shù)菌是有益菌。此外，在有機(jī)堆肥組的樣品中出現(xiàn)一些有益特有菌屬，例如野野村菌屬(Nonomuraea)，而化肥組的樣品中發(fā)現(xiàn)致病特有菌屬(Aquicella)。在真菌屬中，鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)和支頂孢屬(Acremonium)的豐度在有機(jī)肥處理下顯著降低，這些屬分布有很多潛在或機(jī)會(huì)致病真菌，這在一定程度上說(shuō)明施用有機(jī)肥能有效改善百合根際土壤微生物群落。

蘭州百合；有機(jī)堆肥；根際微生物；llumina MiSeq測(cè)序

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的組分[1]，是土壤生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)的動(dòng)力，在維持系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可持續(xù)性中占主導(dǎo)地位[2]。現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，土壤耕作方式、施肥和農(nóng)藥是影響大田土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成和多樣性的三大主要因素。尤其是化肥的施用直接影響土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而引起土壤微生物活性和群落多樣性的改變。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施入氮肥明顯降低土壤微生物的活性[3]， 而向土壤中添加糞肥、植物殘?bào)w等有機(jī)肥可有效維持土壤肥力和微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定[4]。因此，不同的施肥處理對(duì)土壤微生物量、微生物活性、群落功能的影響也不相同。

蘭州百合是中國(guó)百合中的上品，具有很高的食用、藥用、保健和觀賞價(jià)值。然而，蘭州百合是多年生鱗莖草本植物，通常在籽球栽植后2～3 a才能生長(zhǎng)成為成熟的商品球莖，生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中往往需要大量營(yíng)養(yǎng)供給。當(dāng)前蘭州百合種植中，普遍以施用化肥為主，有時(shí)少量施用農(nóng)家肥?；实倪B續(xù)施用常常導(dǎo)致土質(zhì)變差、營(yíng)養(yǎng)元素失衡、土壤微生物多樣性降低，從而病原微生物大量滋生，土傳病害加重，因而易產(chǎn)生連作障礙，嚴(yán)重影響百合的生長(zhǎng)發(fā)育、品質(zhì)和產(chǎn)量[5]。

近年來(lái)，蘭州百合消費(fèi)市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向已開始從追求高產(chǎn)轉(zhuǎn)變到保證產(chǎn)品品質(zhì)下的穩(wěn)定生產(chǎn)。由于有機(jī)種植的蘭州百合鱗莖個(gè)頭碩大、肉質(zhì)甜美，具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和市場(chǎng)歡迎度，部分生產(chǎn)者已開始投入資金增大農(nóng)家肥用量，并通過(guò)綜合管理控制化肥及農(nóng)藥的使用。當(dāng)前有機(jī)肥的主要來(lái)源有2種：①畜禽糞便。由于存在腐熟周期長(zhǎng)、制作成本高、勞動(dòng)力投入較多等限制因素，將畜糞、秸稈等物質(zhì)經(jīng)過(guò)徹底的高溫有氧發(fā)酵，完全無(wú)害化處理措施以后施用的并不多。這類有機(jī)肥未經(jīng)徹底腐熟，容易造成燒苗，并且在施用過(guò)程中難以殺滅雜草種子和病蟲害、寄生蟲的蟲卵，最終容易導(dǎo)致土壤中蟲害的發(fā)生，或商品種球遭到蟲卵污染。 ②商品有機(jī)肥。生產(chǎn)企業(yè)利用畜禽糞便、秸稈等，通過(guò)一定工藝制成有機(jī)肥顆粒，但商品有機(jī)肥由于生產(chǎn)成本的問(wèn)題，依舊存在未完全腐熟的問(wèn)題，依然在施用中不能發(fā)揮最大作用。目前，在日本、美國(guó)、埃及等有機(jī)種植產(chǎn)業(yè)中大規(guī)模采用機(jī)械化的完全腐熟的堆肥，并取得良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)生態(tài)效益[6-9]。

傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法有微生物平板培養(yǎng)法、DNA指紋圖譜技術(shù)、Biolog鑒定系統(tǒng)法、生物標(biāo)記法等[10-11]，但這些方法往往低估土壤微生物的群落組成，更無(wú)法詳細(xì)描述土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成方面的信息及不同群體之間的生理差異。隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)也隨之誕生。不同于傳統(tǒng)的測(cè)序方法，高通量測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于不但極大地降低基因測(cè)序成本，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的土壤微生物基因的直接測(cè)序[12]，而且提高測(cè)序通量，極大地豐富試驗(yàn)研究的信息量，使土壤微生物研究更為深入。

因此，本研究采用完全腐熟有氧發(fā)酵的方法制備堆肥施用于蘭州百合，以普通化肥作為對(duì)照組，采用高通量測(cè)序方法分析農(nóng)田土壤微生物多樣性在施肥前后的變化，以及百合產(chǎn)量等，闡明完全腐熟發(fā)酵堆肥施用后的農(nóng)田土壤微生態(tài)特征，從而為建立大規(guī)模百合有機(jī)堆肥完全腐熟發(fā)酵體系進(jìn)行條件摸索和數(shù)據(jù)積累。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點(diǎn)位于寧夏回族自治區(qū)銀川市平吉堡中國(guó)科學(xué)院西北農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中心試驗(yàn)田。該地區(qū)屬大陸性季風(fēng)氣候，日照充足，干旱少雨，年均氣溫9.1 ℃，年降水量203 mm。土質(zhì)多為灌淤土，熟化土層深厚，土質(zhì)條件好，灌排通暢。

1.2 材料與取樣方法

百合品種采用甘肅地方食用品種‘蘭州百合’。百合苗齡1 a左右，行距20 cm，株距15 cm。試驗(yàn)區(qū)面積0.133 hm2。

為促進(jìn)堆肥完全腐熟，堆肥試驗(yàn)中添加商品EM菌粉以增加發(fā)酵活力(廣州微元生物科技有限公司)。

供試堆肥材料：有機(jī)肥原料因地制宜，選用當(dāng)?shù)氐碾u糞和玉米秸稈。

堆肥：首先，將粉碎成約1 cm左右小段的玉米秸稈鋪20 cm厚，上面鋪1層雞糞(約5 cm)，雞糞上面撒1層EM菌粉，在適當(dāng)?shù)臑⑺?。玉米秸稈和雞糞的質(zhì)量比是2∶1。玉米秸稈加雞糞加EM菌一共重復(fù)疊加14層，高度約2.3 m。在堆制過(guò)程中，堆心溫度在剛開始的30 ℃左右開始升溫，10多天后，平均達(dá)到45 ℃左右，進(jìn)行第1次翻料；且溫度持續(xù)增漲，溫度最高達(dá)到67 ℃。期間每10 d左右陸續(xù)進(jìn)行3～4次翻料后堆體溫度不再上升，逐漸冷卻至30 ℃以下，視為完全腐熟。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程持續(xù)2個(gè)月左右至完全腐熟，發(fā)酵結(jié)束。

田間設(shè)計(jì)：設(shè)化肥(lilyW)和EM菌發(fā)酵有機(jī)肥(lilyY)2個(gè)處理?；?lilyW)作為對(duì)照，主要包括氮肥和磷肥(美國(guó)產(chǎn)磷酸氫二銨)。在1 a生百合苗的2塊試驗(yàn)地中分別施用化肥和有機(jī)肥，其他農(nóng)田管理措施相同。堆肥 2 000 kg/667m2，化肥為磷酸氫二銨20 kg/667m2。2014年3月下旬作為基肥施用。

采樣：分別在化肥和有機(jī)肥處理的百合試驗(yàn)田，隨機(jī)選取3個(gè)百合根際土樣。迅速將土樣保存于帶有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，凍存于-20 ℃冰箱保存，備用。另外，在對(duì)化肥和有機(jī)肥處理的百合根際土壤進(jìn)行采樣時(shí)，將對(duì)應(yīng)的百合種球也一并取回，稱鮮質(zhì)量。

1.3 土壤微生物 DNA的提取

土壤總DNA的提?。和寥揽侱NA的提取采用美國(guó)OMEGA公司生產(chǎn)的E.Z.N.A.Rhizosphere soil DNA Kit試劑盒。將提取的土壤總DNA電泳和NanoDrop 2000TM分光光度計(jì)(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)檢測(cè)合格后，取自同一肥料處理的3個(gè)根際土壤樣品DNA等量混合作為1個(gè)測(cè)序樣本。將混合好的化肥處理的根際土樣(lilyW)和有機(jī)肥處理的土樣(lilyY)，再次進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，密封，然后用冰袋寄送到北京諾禾致源生物信息科技有限公司(www.novogene.com)進(jìn)行測(cè)序。

1.4 試驗(yàn)上機(jī)流程

整個(gè)上機(jī)流程包括PCR的擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣、純化，文庫(kù)的構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序流程由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供。高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費(fèi)用低的特點(diǎn)，已成為研究微生物群落多樣性的首選之策[13-14]。因此，在本試驗(yàn)中，基于Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序(Paired-End)的方法對(duì)16S rDNA高變區(qū)V3～V5區(qū)和ITS1區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

為了研究樣品的物種組成多樣性信息，用 Uparse 軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)[15]對(duì)所有樣品的全部 Effective Tags 序列聚類，默認(rèn)提供以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs( Operational Taxonomic Units )結(jié)果。

同一OTUs中的序列被視為是來(lái)源于某1個(gè)相同分類單元的序列，作為1個(gè)假定的分類單元。Uparse 構(gòu)建 OTUs 時(shí)會(huì)選取代表性序列(依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列)，將這些代表性序列集合用RDP Classifier(Version 2.2，http:// sourceforge.net/ projects/ rdp-classifier/)[16]與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)(http:// greengenes.lbl.gov/ cgi-bin/ nph-index.cgi)[17]進(jìn)行物種注釋分析。根據(jù)物種注釋，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在各分類水平(Kingdom,Phylum,Class,Order,Family,Genus,Species)上的數(shù)目。根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取在門(Phylum)分類水平上最大相對(duì)豐度排名前10的門，生成的物種相對(duì)豐度分布柱。

對(duì)不同樣品在不同一致性(Identity)閾值水平(默認(rèn)提供97%的閾值)下的Alpha Diversity 分析的指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。其中，97%水平下聚類成為1個(gè)OTU的序列被認(rèn)為可能是源自于同1個(gè)種的(Species Boundary)的序列。主要考察2個(gè)指標(biāo)：Species Richness Estimators和Community Diversity Indices。Species Richness Estimators 是用來(lái)估計(jì)群落樣品中包含的物種總數(shù)，Chao1 指數(shù)[18]是廣泛使用的指數(shù)之一。Community Diversity Indices 是包含樣品中的物種組成的豐富度(Richness)和均勻度(Evenness)2個(gè)因素的評(píng)估指標(biāo)，廣泛采用的計(jì)算參考是 Shannon指數(shù)(Shannon’s diversity index)。此外，稀釋曲線(Rarefaction Curve)，是從樣品中隨機(jī)抽取一定測(cè)序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)它們所代表物種數(shù)目(即OTUs數(shù)目)，以數(shù)據(jù)量與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線。

本研究其他的數(shù)據(jù)分析與圖形制作采用Origin 8和SPSS 16軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同肥料處理對(duì)百合種球鮮質(zhì)量的影響

將分別施用有機(jī)肥和化肥1 a的百合種球稱取鮮質(zhì)量。由圖1 可看出，EM菌發(fā)酵有機(jī)肥對(duì)增加百合鱗莖鮮質(zhì)量作用顯著，相比化肥可增產(chǎn)76.6%。

圖中不同字母表示在P≤0.05水平上的差異顯著性 Different letters represent significant difference at the 0.05 level

2.2 不同肥料處理對(duì)百合根際土壤細(xì)菌和真菌組成及豐度的影響

從圖2-A、2-B稀釋曲線可以看出,隨著測(cè)序數(shù)據(jù)的增加，細(xì)菌和真菌稀釋曲線均基本趨于平緩，說(shuō)明取樣基本合理。

Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)代表了微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。由表1可以看出，百合根際土壤 Chao1指數(shù)和Shannon 指數(shù)的變化幅度真菌更為顯著，表明肥料對(duì)根際土壤真菌群落豐富度和多樣性的影響大于細(xì)菌的。其中，百合細(xì)菌和真菌Chao1指數(shù)都是lilyW大于lilyY，這說(shuō)明施用化肥的土壤(lilyW)中物種豐富度大于施用有機(jī)肥的(lilyY)。Shannon指數(shù)顯示細(xì)菌的lilyY指數(shù)大于lilyW的指數(shù)，而真菌的lilyW的指數(shù)大于lilyY的指數(shù)，這說(shuō)明施用有機(jī)肥(lilyY)使土壤中的細(xì)菌群落多樣性升高，真菌多樣性降低。

2.3 不同肥料處理對(duì)百合根際土壤細(xì)菌類群的影響

對(duì)測(cè)序得到的OTU結(jié)果進(jìn)行分析可知(圖3)，lilyY和lilyW 2個(gè)樣品中檢測(cè)到細(xì)菌門數(shù)分別為15、14，細(xì)菌綱數(shù)分別為57、54，細(xì)菌數(shù)目分別為99、98，細(xì)菌科數(shù)分別為155、152，細(xì)菌屬數(shù)分別為175、167。在門、綱、目、科、屬水平均表現(xiàn)為施用有機(jī)肥處理(lilyY)大于施用化肥處理(lilyW)。

由圖4-A可以看出，在2個(gè)百合土壤處理中變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)所占比例較高，平均都大于10%。此外，綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、疣微菌門(Verrucomicrobia)在2個(gè)處理中平均所占比例大于1%。其中，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)在不同肥料處理中豐度變化差異較大，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在施用有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥處理下所占比例分別為10.6%和14.0%；而擬桿菌門(Bacteroidetes)在施用有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥所占比例分別為7.9%和3.9%。

對(duì)2個(gè)處理中含量最高的變形菌門(Proteobacteria)進(jìn)行綱水平分析，其中α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)在2個(gè)處理中含量最高，變化較小，平均占10.45%。δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)在2個(gè)處理中變化較大，其中，在有機(jī)肥中只占3.9%，而在化肥占5.3%。

圖2 相似度為0.97條件下各土壤細(xì)菌(A)和真菌(B)的稀釋曲線Fig.2 Rare faction curves of bacteria(A) and fungus(B) in each rhizosphere soil sample at cutoff level of 3%

表1 不同肥料處理百合根際土壤細(xì)菌、真菌群落多樣性指數(shù)Table 1 Bacteria and fungus diversity index in rhizosphere soil of lily in fertilizer and compost

對(duì)比施用有機(jī)肥和化肥的根際土壤細(xì)菌組成可發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥和化肥處理過(guò)的樣品中各含有一些特有屬(表2)，其中，施用有機(jī)肥的土壤(lilyY)中出現(xiàn)的特有屬有12個(gè)，包括鹽細(xì)菌屬(Salinibacterium)、野野村菌屬(Nonomuraea)、副球菌屬(Paracoccus)、紅長(zhǎng)命菌屬(Rubrivivax)、索氏菌屬(Thauera)、異常球菌屬(Deinococcus)、海居菌屬(Phycicoccus)、Salinimicrobium、Wautersiella、Faecalibacterium、Akkermansia和Luteolibacter； 施用化肥的土壤(lilyW)中特有屬只有4個(gè)，包括蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)，無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)，德沃斯氏菌屬(Devosia)和Aquicella。

不同肥料的處理還會(huì)使一些細(xì)菌屬的豐度發(fā)生不同變化(圖5-A)，其中，施用有機(jī)肥的樣品(lilyY)中有8個(gè)屬的豐度出現(xiàn)上調(diào)，包括不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、溶桿菌屬(Lysobacter)、浮霉?fàn)罹鷮?Planctomyces)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、芽孢八疊球菌屬(Sporosarcina)、固氮弓菌屬(Azoarcus)、熱單胞菌屬(Thermomonas)和Pontibacter；而施用化肥的樣品(lilyW)中有5個(gè)屬出現(xiàn)豐度上調(diào)，包括出芽菌屬(Gemmata)，小梨形菌屬(Pirellula)、Kaistobacter、Steroidobacter和Candidatussolibacter。此外，從表3可知，不同肥料處理對(duì)硝化螺菌屬(Nitrospira)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、Niastella、鏈霉菌屬(Streptomyces)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等10個(gè)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度沒(méi)有影響。

2.4 不同肥料對(duì)百合根際土壤真菌類群的影響

對(duì)于真菌分類(圖3)，lilyY和lilyW 2個(gè)樣品中檢測(cè)到真菌門數(shù)均為4；真菌綱數(shù)分別為7、10；真菌目數(shù)分別為12、20；真菌科數(shù)分別為15、28；真菌屬數(shù)分別為23、37。在門、綱、目、科、屬水平均表現(xiàn)出施化肥的樣品(lilyW)大于施有機(jī)肥樣品(lilyY)。

其中，在門水平如圖4-B所示，子囊菌門(Ascomycota)所占比例最大，lilyY占32.1%，而lilyW達(dá)到80.7%，此外所占比例較多的是不能鑒定的真菌(Unidentified)，lilyY和lilyW分別占67.0%和15.0%。

對(duì)比施用有機(jī)肥和化肥的根際土壤真菌組成可發(fā)現(xiàn)，有機(jī)肥和化肥處理過(guò)的樣品中各含有一些特有屬(表4)，其中，施用化肥的土壤中特有屬有16個(gè)，包括平臍蠕孢屬(Bipolaris)、光黑殼屬(Preussia)、外瓶霉屬(Exophiala)、曲霉屬(Aspergillus)、翹孢霉屬(Emericella)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、Tetracladium、Leuconeurospora、地絲霉屬(Geomyces)、念珠菌屬(Candida)、Clonostachys、 翅孢殼屬(Emericellopsis)、Wardomyces、絲蓋傘屬(Inocybe)、紅菇屬(Russula)和Geminibasidium；施用有機(jī)肥的特有屬只有2個(gè)，包括鬼傘屬(Coprinellus)和黑團(tuán)孢屬(Periconia)。

圖3 不同肥料處理根際土壤細(xì)菌、真菌在各分類水平上的數(shù)量Fig.3 The number of each taxonomic levels for rhizosphere soil of fertilizer and compost

相對(duì)豐度算法：A/B×0.01,A代表在這個(gè)樣本中某個(gè)屬的克隆序列，B代表在這個(gè)樣本中所有屬的克隆序列 The clone abundance was calculated as: A/B×0.01,where A is the number of related clones detected in the genera for the library and B is the total number of all genera in the same library

不同肥料的施用還會(huì)使一些真菌屬的豐度發(fā)生不同變化(圖5-B)，其中，施用化肥的樣品(lilyW)中有15個(gè)屬出現(xiàn)豐度上調(diào)，包括鐮刀菌屬(Fusarium)、赤霉菌屬(Gibberella)、輪枝孢屬(Verticillium)、青霉菌屬(Penicillium)、油瓶霉屬(Lecythophora)、支頂孢屬(Acremonium)、漆斑菌屬(Myrothecium)、葡萄穗霉屬(Stachybotrys)、毛殼菌屬(Chaetomium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、短梗蠕孢屬(Trichocladium)、柄孢殼菌屬(Podospora)、被孢霉屬(Mortierella)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)和Plectosphaerella；而施用有機(jī)肥的樣品(lilyY)中有2個(gè)屬的豐度出現(xiàn)上調(diào)，包括Lectera和鏈格孢屬(Alternaria)。

表2 不同肥料處理百合根際土壤細(xì)菌差異屬比較Table 2 Comparison on bacterial genera of the lily rhizosphere soil under the treatment of fertilizer and compost,respectively

注：Y表示該屬在此根際中存在；N表示該屬在此根際中不存在。表4同。Note:Y represent presence of the genus in the rhizosphere soil; N represent absence of the genus in the rhizosphere soil.The same as table 4.

表3 不同肥料處理百合根際土壤細(xì)菌豐度不變的屬Table 3 No change of bacteria relative abundance at genera level under fertilizer and compost treatments,respectively

注：各菌屬功能的描述參照汪其同等[19]的研究成果。

Note:The function description of each genus were reported by WANG Qitongetal[19],2015.

表4 不同肥料處理百合根際土壤真菌差異屬比較Table 4 Comparison of fungus genera in the lily rhizosphere soil under the treatment of fertilizer and compost treatments,respectively

相對(duì)豐度算法同圖4 The relative abundance was calculated as Fig.4

3 討 論

3.1 不同肥料處理對(duì)蘭州百合產(chǎn)量的影響

眾多研究表明，增施有機(jī)肥可以促進(jìn)作物生長(zhǎng)，改善品質(zhì)，提高產(chǎn)量。EM菌是由功能各異的80余種微生物組成的一種活菌制劑。在堆肥發(fā)酵過(guò)程中加入EM菌劑，有利于微生物的迅速繁殖及糞便和秸稈的快速分解，抑制或殺死病菌、蟲卵等有害生物，并且有利于釋放出氮磷鉀和微量元素等有效養(yǎng)分。然而，EM有機(jī)菌肥在蘭州百合種植上鮮有使用。為驗(yàn)證EM有機(jī)菌肥和常規(guī)化肥2種肥料對(duì)蘭州百合產(chǎn)量的影響，測(cè)定蘭州百合鱗莖的鮮質(zhì)量，結(jié)果表明施用有機(jī)肥對(duì)蘭州百合增產(chǎn)顯著。這與之前在黃瓜[20]、番茄[21]等作物的堆肥試驗(yàn)結(jié)果相似。

土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)中起著極重要的作用[22]。同時(shí)，土壤微生物是土壤質(zhì)量變化的敏感指標(biāo)，能夠迅速對(duì)周圍環(huán)境的變化做出反應(yīng)[23]。因此，不同施肥處理對(duì)微生物影響效果不同。本研究有機(jī)肥的施用提高土壤細(xì)菌的多樣性，降低土壤真菌的多樣性和豐度，尤其是降低致病真菌的多樣性和豐度，這與以前的研究結(jié)果相同[24-26]。不僅如此，研究還發(fā)現(xiàn)土壤中大多數(shù)微生物的數(shù)量與土壤養(yǎng)分、作物產(chǎn)量呈正相關(guān)[27]。因此，合理施用有機(jī)肥有利于維持土壤有益微生物的多樣性及活性，進(jìn)而影響土壤肥力、植物的營(yíng)養(yǎng)吸收和產(chǎn)量。

3.2 施用有機(jī)肥對(duì)蘭州百合根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物群落受很多因素影響。土壤類型、植物類型和田間管理都是影響土壤微生物群落的主要因子[28-30]。為減少其他因素的干擾，在本試驗(yàn)中，除了施用肥料不同外，其他條件(如田間管理、土壤類型、植物種類)控制都一樣。本研究發(fā)現(xiàn)施用EM發(fā)酵有機(jī)肥和化肥對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不同，這與之前的研究結(jié)果相同[31-32]。筆者發(fā)現(xiàn)在施用有機(jī)肥的土壤中芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對(duì)豐度有所降低。有研究報(bào)道芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相比濕潤(rùn)土壤環(huán)境更適合在干燥土壤環(huán)境中生存[33]。這在一定程度上說(shuō)明施用有機(jī)肥可以提高百合根際土壤的保水能力。相反，擬桿菌門(Bacteroidetes)在有機(jī)肥中的豐度顯著上升。Fierer等[34]和Goldfarb等[35]研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(Bacteroidetes)是富營(yíng)養(yǎng)性土壤細(xì)菌。經(jīng)有機(jī)肥處理的蘭州百合根際土壤中的擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度明顯上升，表明經(jīng)有機(jī)肥處理的土壤中可利用的物質(zhì)增多。不僅在門水平，還發(fā)現(xiàn)屬水平施用有機(jī)肥相對(duì)豐度上調(diào)幅度高于施用化肥的，這表明有機(jī)肥對(duì)土壤細(xì)菌有積極的作用。

研究發(fā)現(xiàn)EM有機(jī)菌肥對(duì)蘭州百合土壤細(xì)菌的選擇是有一定范圍的。如硝化螺菌屬(Nitrospira)、短根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、芽孢桿菌(Bacillus)、紅游動(dòng)菌屬(Rhodoplanes)、Niastella、鏈霉菌屬(Streptomyces)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、苯基桿菌屬(Phenylobacterium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)等一些在土壤中有一定生態(tài)功能的菌群相對(duì)豐度并沒(méi)有因施用不同肥料而發(fā)生變化。雖然這些屬的豐度值沒(méi)有進(jìn)一步的驗(yàn)證，但是這些結(jié)果與Piromyou等[36]的研究結(jié)果一致。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)有機(jī)肥處理的蘭州百合根際特有細(xì)菌多為有益菌，如野野村氏菌屬(Nonomuraea)有積極的生態(tài)功能(抗菌)[37-38]。而化肥處理的根際特有細(xì)菌屬如Aquicella是包含了已報(bào)道的致病菌。這表明有機(jī)肥增加有益細(xì)菌的多樣性，也印證EM菌有機(jī)肥一定程度上能夠改善土壤的理化性質(zhì)，調(diào)節(jié)土壤微生物種群。

3.3 施用有機(jī)肥對(duì)百合根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

相對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，施用有機(jī)肥和化肥對(duì)根際真菌群落的影響不同。各個(gè)分類水平(如門、綱、目、科、屬等)上的數(shù)量在施用化肥的樣本中都高于施用有機(jī)肥的樣本。在門水平，除了不能鑒定到具體的門水平以外，所有能鑒定到門水平的相對(duì)豐度施用有機(jī)肥處理(lilyY)低于施用化肥處理(lilyW)。例如，子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度，lilyY只占32.1%，而lilyW占80.7%，施用化肥的土壤子囊菌門(Ascomycota)的豐度是施用有機(jī)肥的2倍多。說(shuō)明施用有機(jī)肥顯著影響土壤的真菌群落。

鐮刀菌屬(Fusarium)是引起植物根腐的主要病原菌。而假單胞菌屬(Pseudomonas)是主要的根際細(xì)菌，有潛在控制植物病原菌的能力[39-40]，尤其對(duì)鐮刀菌屬有一定的拮抗能力[41-43]。本研究發(fā)現(xiàn)，在施用2種肥料的土壤中并沒(méi)有檢測(cè)到假單胞菌屬的存在，但是在施用有機(jī)肥的土壤中鐮刀菌屬的豐度卻顯著降低。這就說(shuō)明有機(jī)肥不是簡(jiǎn)單的增加拮抗菌的豐度去抑制病原菌這種一對(duì)一的常規(guī)模式，可能存在更復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制。

另外，施用有機(jī)肥的土壤中鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉菌屬(Penicillium)和支頂孢屬(Acremonium)等真菌屬的豐度小于施用化肥的。這與之前的研究結(jié)果相同，有機(jī)肥能夠使土壤中真菌數(shù)量減少[44]。據(jù)報(bào)道[39，45-49]這些屬包含的菌株多數(shù)為致病菌，這從另一方面說(shuō)明施用有機(jī)肥對(duì)百合的生長(zhǎng)是有利的。

致謝:感謝張寶貴博士對(duì)本研究的幫助。

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(責(zé)任編輯：潘學(xué)燕 Responsible editor:PAN Xueyan)

Effect of Compost on Rhizosphere Microbial Community of Lanzhou-lily Based on High Throughput Sequencing

HAO Haiting1,2,3,WANG Ruoyu1,2,3,ZHAO Xia1,2,3,WANG Yun3,4,GUO Zhihong1,2,3,ZHANG Yubao1,2,3and XIE Zhongkui1,2,3

(1.Gaolan Station of Agricultural and Ecological Experiment,Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China；2.Key Laboratory of Stress Physiology and Ecology in Cold and Arid Regions of Gansu Province,Lanzhou 730000,China；3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China；4.Key Laboratory of Desert and Desertification,Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

In this study,we investigated the rhizosphere bacteria and fungi community which fertilized by compost and chemical fertilizer respectively by the llumina Miseq platform.The result showed that compared with chemical fertilizer,the fresh production of bulbs in the first year of planting increased 76.6% when compost was used.The species annotation of the high throughput sequencing experiment showed that the diversity of bacteria on each taxonomic level in rhizosphere soil with compost was all larger than that with chemical fertilizer.However,the number at each taxonomic level of fungi with compost was less than that with chemical fertilizer.The indices of Chao1 and Shannon showed that the change of bacteria community was less than the change of fungi community.The relative abundance of some bacterial genus had no change between rhizosphere soil with compost or chemical fertilizer and most of them belong to the beneficial group.Besides,we found that some beneficial bacteria,such asNonomuraea,were present only in compost-used rhizosphere soil,but some pathogenic bacteria appeared only in the inorganic-fertilized soil,such asAquicella.The abundance of fungi genus likeFusarium,Aspergillus,PenicilliumandAcremoniumdecreased in rhizosphere soil used compost,most of which were potential pathogenic or opportunistic fungi.In conclusion,the results showed that compost could effectively affect the diversity and distribution of microorganism community in lily rhizosphere.

Lanzhou-lily；Organic compost；Rhizosphere microorganisms；llumina MiSeq sequencing

HAO Haiting,female,doctoral student.Research area:molecular microbiology.E-mail: m18919046163@163.com

WANG Ruoyu,male,Ph.D,research fellow.Research area:molecular ecology.E-mail: wangruoyu@lzb.ac.cn

日期：2017-03-03

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170303.0833.052.html

2016-04-01

2016-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31370447)；中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”項(xiàng)目(27Y127L41002)。

郝海婷，女，博士研究生，研究方向?yàn)榉肿游⑸铩?E-mail:m18919046163@163.com

王若愚，男，博士，研究員，研究方向?yàn)榉肿由鷳B(tài) 。E-mail: wangruoyu@lzb.ac.cn

S-3

A

1004-1389(2017)03-0437-11

Received 2016-04-01 Returned 2016-05-15

Foundation item The National Natural Science Foundation of China(No.31370447); the Chinese Academy of Sciences under the “One Hundred Talents” Program(No.27Y127L41002).