兩性霉素B前體脂質(zhì)體的制備工藝研究

隋 琳，田 野，王永利，王立華，庚麗麗，趙 瑤，王璐璐

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100；2.河北北方學(xué)院理學(xué)院，河北 張家口 075000; 3.河北北方學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，河北 張家口 075000)

兩性霉素B前體脂質(zhì)體的制備工藝研究

隋 琳1,3，田 野2，王永利3，王立華3，庚麗麗3，趙 瑤2，王璐璐2

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué),內(nèi)蒙古 呼和浩特 010100；2.河北北方學(xué)院理學(xué)院，河北 張家口 075000; 3.河北北方學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，河北 張家口 075000)

目的 研究?jī)尚悦顾谺前體脂質(zhì)體制備工藝。方法 采用載體沉積法制備兩性霉素B前體脂質(zhì)體，以包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化處方，并觀察其重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。結(jié)果 兩性霉素B的最優(yōu)處方工藝條件是膜材比為1∶2、載脂比為5∶1、藥脂比1∶8。載體為甘露醇，最優(yōu)處方下平均包封率(63.4±1.5)%。結(jié)論 由最佳處方工藝條件制備的兩性霉素B前體脂質(zhì)體的包封率和穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好。

兩性霉素B；前體脂質(zhì)體；載體沉積法；低速離心法；包封率

兩性霉素B(amphotericin B，AmB)是治療隱球菌性腦膜炎應(yīng)用最多也是最有效的一種藥物，它屬于大環(huán)多烯類抗真菌抗生素，主要作用于細(xì)胞膜的甾醇使菌體溶解破壞[1]。近年來(lái)，隨著腫瘤和需要化療的患者增多、廣譜抗生素和糖皮質(zhì)激素的廣泛使用，以及插管和介入治療患者的增加，深部真菌感染呈明顯增多趨勢(shì)，兩性霉素B迄今仍然是作用最強(qiáng)的抗真菌藥，但該藥在治療劑量下產(chǎn)生的嚴(yán)重的毒副作用限制了在臨床上的使用[2，3]。前體脂質(zhì)體是將藥品吸附于極細(xì)的載體上，通常為具有良好流動(dòng)性的粉末，使用前與水溶合可得脂質(zhì)體混懸液，從而解決普通脂質(zhì)體的聚集、沉降、融合、滲透和高溫滅菌等穩(wěn)定性的問題，降低藥品的毒副作用。藥品制成前體脂質(zhì)體，可適用于靜脈注射和其他的給藥途徑，提高藥品的使用度[4,5]。

本文采用載體沉積法制備前體脂質(zhì)體，是將藥品、膜材和支撐劑用適量溶液溶解后制成類脂質(zhì)溶液后吸附于載體上，形成前體脂質(zhì)體，由于前體脂質(zhì)體沒有形成脂質(zhì)體的完整結(jié)構(gòu)，故不存在聚集、沉降等問題，同時(shí)制備工藝簡(jiǎn)單，增強(qiáng)了應(yīng)用價(jià)值，提高了藥品利用率[6]。

1 儀器與藥品

722N型可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，ZFQ-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(天津市第一玻工廠)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)，TG328A型光學(xué)讀數(shù)分析天平(湘儀天平儀器廠)，CX-250超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備工廠)。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 兩性霉素B前體脂質(zhì)體的制備工藝

稱取處方量的大豆卵磷脂、膽固醇、維生素E和PEG2000,溶于氯仿中，另取處方量?jī)尚悦顾谺溶于適量甲醇溶液中，超聲溶解后，將兩種溶液混勻，預(yù)熱，制備類脂質(zhì)溶液。再取適量過80目篩的載體于茄形瓶中，預(yù)熱后，分次加入類脂質(zhì)溶液，于恒溫水浴上緩慢減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出有機(jī)溶劑，類脂質(zhì)膜材附著于載體粉末上。將制得品置于真空干燥器中干燥過夜，過40目篩，密閉于西林瓶中，冰箱4 ℃保存。使用前，取該前體脂質(zhì)體粉末加入注射水溶合，超聲溶解，即得脂質(zhì)體混懸液[7]。

2.2 包封率的測(cè)定

2.2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別精密量取兩性霉素B、空白脂質(zhì)體10 mg到100 mL容量瓶中，用二甲基亞砜甲醇混合液定容，以混合液做參比，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，膜材、載體、輔料對(duì)兩性霉素B的測(cè)定無(wú)干擾，因此選擇408 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取兩性霉素B精制品10 mg于100 mL容量瓶中，甲醇和二甲亞砜的混合溶液定容，配制得100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取2、4、6、8、10、12、14 mL標(biāo)準(zhǔn)液于100 mL容量瓶中，用甲醇和二甲亞砜的混合溶液稀釋成2、4、6、8、10、12、14 μg·mL-1溶液，以混合溶液做空白對(duì)照，用722S可見分光光度計(jì)在408 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，用濃度(C)對(duì)吸光度(A)作線性回歸，即得線性回歸方程為A=0.1174C-0.0075(R2=0.999 9)，結(jié)果表明，在2～14 μg·m-1范圍內(nèi)溶液吸光度與兩性霉素B溶液濃度線性關(guān)系良好。

2.2.3 測(cè)定包封率的方法

將制得的兩性霉素B前體脂質(zhì)體粉末，加注射用水溶合，超聲波溶解后，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，混合均勻。精密量取2.0 mL溶液置離心管中，在2 000 r·min-1、每次20 s的條件下離心10 min，棄去上層清液。精密移取5.0 mL甲醇和二甲基亞砜混合液溶解沉淀，以混合液做參比測(cè)定吸光度，計(jì)算兩性霉素B的量。采用如下公式，計(jì)算大黃酚前體脂質(zhì)體包封率[8]。

(W總為兩性霉素B的總量；(1-W游離)為離心后上清液中兩性霉素B的量)

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 載脂比對(duì)包封率的影響

固定其他因素，使處方中載體與卵磷脂的比例分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1，制備兩性霉素B前體脂質(zhì)體，測(cè)得包封率(見圖1)。結(jié)果表明，載脂比為5∶1時(shí)，包封率較高。

2.3.2 膽固醇用量對(duì)包封率的影響

固定其他因素，使處方中膽固醇∶卵磷脂的比例分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，制備兩性霉素B前體脂質(zhì)體，測(cè)定包封率(見圖2)。結(jié)果表明，膽固醇卵磷脂比為1∶2時(shí)，包封率較高。

2.3.3 藥脂比對(duì)包封率的影響

固定其他因素，使處方中藥∶卵磷脂的比例分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，制備兩性霉素B前體脂質(zhì)體，測(cè)定包封率(見圖3)。結(jié)果表明，藥脂比為1∶8時(shí)，包封率較高。

圖1 載體與卵磷脂的比的影響 圖2 膽固醇與卵磷脂的比例的影響

圖3 藥物與卵磷脂的比例的影響 圖4 載體種類的影響

2.3.4 不同載體對(duì)包封率的影響

固定處方及工藝中的其他因素，分別選用山梨醇、甘露醇、氯化鈉為載體，制備兩性霉素B前體脂質(zhì)體，測(cè)定包封率(見圖4)。結(jié)果表明，選用甘露醇為載體時(shí)，包封率較高。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素考察試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以包封率為指標(biāo)，對(duì)處方中載脂比(A)、藥脂比(B)、膽固醇卵磷脂比(C)、載體種類(D)4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)選，以期得到穩(wěn)定性好、包封率較高的前體脂質(zhì)體處方。選用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，制備前體脂質(zhì)體，測(cè)定包封率。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。由表1分析可知膽固醇卵磷脂比是影響兩性霉素B前體脂質(zhì)體包封率的第一因素，載體種類次之，載脂比較小，藥脂比最小，且無(wú)顯著差異。最佳處方為A2B2C3D1，即膽固醇卵磷脂比為1∶3，載脂比為4∶1，載體為甘露醇，藥脂比為1∶8。

表2 兩性霉素B前體脂質(zhì)體驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

表3 Zeta電位與體系穩(wěn)定性的關(guān)系

2.5 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按最優(yōu)工藝處方量重復(fù)制備3份兩性霉素B前體脂質(zhì)體，取適量加注射水溶合后，制得3份脂質(zhì)體懸濁液，測(cè)其包封率(見表2)。證明該制備工藝制得的前體脂質(zhì)體包封率較高，重現(xiàn)性良好。

2.6 穩(wěn)定性考察

Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，它的重要意義在于數(shù)值與膠態(tài)分散的穩(wěn)定性相關(guān)，是對(duì)顆粒之間相互排斥或吸引力的強(qiáng)度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta電位(正或負(fù))越高，體系越穩(wěn)定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta電位(正或負(fù))越低，越傾向于凝結(jié)或凝聚，即吸引力超過了排斥力，分散被破壞而發(fā)生凝結(jié)或凝聚[9]。Zeta電位與體系穩(wěn)定性的大致關(guān)系如表3所示。

3 討論與結(jié)論

前體脂質(zhì)體可預(yù)防脂質(zhì)體之間相互聚集，且更適合包封脂溶性藥物[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)其載體山梨醇、甘露醇、氯化鈉進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甘露醇表面結(jié)構(gòu)多孔，比表面積大，對(duì)于兩性霉素B和磷脂的吸附性好，包封效果較好；通過正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝得到最優(yōu)制備條件為膽固醇卵磷脂比為1∶3，載脂比為4∶1，載體為甘露醇，藥脂比為1∶8；由Zeta電位測(cè)量實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)得兩性霉素B脂質(zhì)體混懸液的電位為-45 mV，制得的前體脂質(zhì)體有較好的穩(wěn)定性。

載體沉積法制備的兩性霉素B前體脂質(zhì)體為淡黃色，流動(dòng)性良好的干燥顆粒，包封率(63.4±1.5)%,穩(wěn)定性較好，其制備方法簡(jiǎn)單，易于規(guī)?；a(chǎn)，質(zhì)量可控，并且前體脂質(zhì)體可壓片和制備成膠囊藥劑，便于貯存，具有很好的發(fā)展前景。

[1]陳裕充，溫海.兩性霉素B及其脂質(zhì)體的抗真菌機(jī)制[J].中國(guó)真菌學(xué)雜志,2006,(05):312-314，307.

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[10]郭慧麗，李高梅，興國(guó).兩性霉素B脂質(zhì)體的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2008.

[責(zé)任編輯：毛微曦 英文編輯：劉彥哲]

Preparation Technology of Amphotericin B Proliposomes

SUI Lin1,3,TIAN Ye2,WANG Yong-li3, WANG Li-hua3,GENG Li-li3,ZHAO Yao2,WANG Lu-lu2

(1.Inner Mongolia Medical University,Hohhot,Inner Mongolia 010100,China; 2.School of Sciences,Hebei North Univesity,Zhangjiakou,Hebei 075000,China; 3.Institute of Applied Chemistry,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Objective To study preparation technology of amphotericin B proliposomes.Methods Amphotericin B proliposomes were prepared by carrier aggradation method.A single-factor investigation and orthogonal design were used to select the optimum formulation.And the repeatability and stability were observed.Results The best prescription of chrysophanol proliposomes was as follows:the ratio of cholesterol to phospholipid was 1∶2,the ratio of carrier to phospholipid was 5∶1,and the ratio of drug to phospholipid was 1∶8.The best carrier was mannnitol.The average encapsulation efficiency of the optimal prescription was:(63.4±1.5)%.Conclusion By using the best prescription amphotericin B was highly entrapped into proliposomes with good reproducibility and stability.

amphotericin B;proliposome;carrier aggradation method;low-speed centrifugation;entrapment efficiency

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(12276104D-94)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(QN2015221)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(QN2015148)

隋琳(1993-),女，遼寧本溪人，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)在讀碩士研究生，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。

田野(1976-)，女，內(nèi)蒙赤峰人，副教授，碩士，研究方向：納米材料。

R 943

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.01.007

來(lái)稿日期：2016.11.15