丁香葉黃酮對(duì)小鼠藥物性肝損傷的保護(hù)作用研究

趙常偉 ， 劉芳萍 ， 左詠梅 ， 馬 欣 ， 常軼聰 ， 李 睿 ， 李敏敏 ，赫景姍 ， 史晨曦 ， 李 植 ， 藺月霞 ， 韓 晴 ， 李繼昌 ， 高 利

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江哈爾濱150001)

丁香葉黃酮對(duì)小鼠藥物性肝損傷的保護(hù)作用研究

趙常偉1， 劉芳萍1， 左詠梅2， 馬 欣1， 常軼聰1， 李 睿1， 李敏敏1，赫景姍1， 史晨曦1， 李 植1， 藺月霞1， 韓 晴1， 李繼昌1， 高 利1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 黑龍江哈爾濱150030 ； 2. 黑龍江省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江哈爾濱150001)

為確定丁香葉黃酮的保肝作用，將小鼠隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模型組、丁香葉黃酮高劑量組(40 mg/kg體重)、中劑量組(35 mg/kg體重)、低劑量組(30 mg/kg體重)，以血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)、肝組織指標(biāo)(MDA、NO、SOD、GSH、GSH-Px)及II相藥物代謝酶GSTA1為檢測(cè)對(duì)象，結(jié)合小鼠肝臟病理變化綜合分析。結(jié)果顯示，丁香葉黃酮高劑量組血清轉(zhuǎn)氨酶和肝組織中MDA、NO均極顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH、GSH-Px均極顯著升高(P<0.01)，GSTA1的含量也極顯著升高(P<0.01)；肝臟組織病理學(xué)顯示脂肪變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；而中、低劑量組的各指標(biāo)和組織學(xué)變化均不如高劑量組明顯。研究表明，丁香葉黃酮以40 mg/kg體重劑量對(duì)小鼠藥物性肝損傷有較好的保護(hù)作用。

丁香葉黃酮 ； 醋氨酚 ； 肝損傷 ； GSTA1 ； 小鼠

丁香葉性寒，味苦，入肝、膽、胃三經(jīng)，有解毒消炎、燥濕、退黃的作用。丁香葉很早在民間就被用作“抗菌消炎、保肝利膽”的良藥[1]。研究表明，丁香葉醇溶液的提取物對(duì)大腸桿菌等引起的腸炎、腹瀉有很好的治療作用，其有效成分為黃酮和有機(jī)酸類(lèi)[2]。在近代醫(yī)學(xué)，提取自不同植物的黃酮類(lèi)成分被廣泛應(yīng)用于各種原因?qū)е碌母螕p傷保護(hù)性研究，但沒(méi)有關(guān)于丁香葉黃酮保肝的研究。對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)又叫醋氨酚，是臨床常用的解熱鎮(zhèn)痛藥，也是臨床重要的非甾體類(lèi)抗炎藥[3]，由APAP誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷是篩選、研究保肝藥物首選的經(jīng)典模型[4]。本研究在課題組前期建立的APAP誘導(dǎo)藥物性肝損傷模型的基礎(chǔ)上，開(kāi)展丁香葉黃酮的保肝作用研究，為丁香葉的深度開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠，體重(20±2g)，雄性，清潔級(jí)，購(gòu)自哈藥集團(tuán)制藥總廠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 丁香葉黃酮的提取 按本課題組前期建立丁香葉黃酮的提取方案：取10 g丁香葉細(xì)粉置于250 mL容量瓶中，加入120 mL無(wú)水乙醇、80 mL水，溫度50 ℃的情況下用超聲波輔助提取30 min后，再回流提取80 min，濾過(guò)后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃旋蒸至適量體積，70 ℃真空干燥測(cè)得其中的丁香葉黃酮1.274 g。按這種方法提取丁香葉黃酮的提取率為12.74%。

1.3 動(dòng)物分組和給藥 將40只小鼠隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組，模型組，丁香高、中、低(40 mg/kg體重、35 mg/kg體重、30 mg/kg體重)劑量組，對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水。第7天末次給藥后禁食12 h，對(duì)對(duì)照組，各組小鼠分別以APAP溶液200 mg/kg灌胃(按0.1 mL/10 g體重)。禁食不禁水12 h后，將小鼠眼球采血分離血清測(cè)定ALT、AST，摘取肝臟，取部分組織制作肝臟病理切片，其余組織用勻漿后測(cè)定MDA、GSH、GSH-Px、NO、SOD以及GSTA1。

1.4 各指標(biāo)的檢測(cè)方法 ALT、AST、MDA、GSH、GSH-Px、NO、SOD均采用南京建成生物研究所試劑盒，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(型號(hào)UV1901PC)測(cè)定。

1.5 GSTA1含量的測(cè)定 GSTA1含量測(cè)定是采用小鼠谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶A1 ELISA試劑盒(美國(guó)Rapidbio公司生產(chǎn))試劑盒，用Bio-Rad iMarkTM型酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定，在450 nm有最大吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白濃度計(jì)算樣品中GSTA1含量。

1.6 肝臟病理組織學(xué)分析 用福爾馬林固定組織標(biāo)本后，經(jīng)過(guò)脫水、透明、包埋處理，將包埋好的組織塊切成5 mm的厚度。按H.E.染色的常規(guī)步驟用蘇木精-伊紅染色，在光鏡下進(jìn)行肝組織的形態(tài)學(xué)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(Dunnett′s法統(tǒng)計(jì)分析)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST活性的變化 小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST活性的變化見(jiàn)表1，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的ALT、AST極明顯增高 (P<0.01)，表明模型復(fù)制成功。與模型組相比，丁香葉黃酮高劑量組的ALT、AST極明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明40 mg/kg體重丁香葉黃酮可以顯著降低APAP肝損傷模型中血清轉(zhuǎn)氨酶的活性。

表1 小鼠血清ALT、AST活性的變化

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01，下表同

2.2 小鼠肝組織指標(biāo)MDA、NO、GSH-Px、SOD、GSH的變化 小鼠肝組織指標(biāo)MDA、NO、GSH-Px、SOD、GSH的變化見(jiàn)表2，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝組織中NO、MDA極顯著增高(P<0.01)，GSH-Px、SOD、GSH極顯著降低(P<0.01)，表明模型復(fù)制成功；與模型組相比，丁香葉黃酮高劑量組的NO、MDA極顯著降低(P<0.01)，GSH-Px、SOD、GSH極顯著升高(P<0.01)。說(shuō)明40 mg/kg體重丁香葉黃酮可以明顯改善APAP所造成的肝組織的損傷。

表2 小鼠肝組織中NO、MDA、GSH-Px、SOD、GSH變化

MDA(nmol/mgprot)NO(nmol/gprot)GSH?Px(U/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH(gGHS/L)對(duì)照組2．72±0．610．84±0．161380．12±94．8787．87±1．4817．24±1．07模型組4．82±0．66??1．31±0．13??557．88±76．32??57．36±1．29??7．92±0．92??丁香葉黃酮高劑量組(40mg/kg體重)3．51±0．78▲▲0．95±0．03▲▲1077．54±99．88▲▲81．05±1．35▲▲16．49±1．30▲▲丁香葉黃酮中劑量組(35mg/kg體重)5．72±0．39▲▲1．11±0．05▲▲545．86±77．6667．44±1．62▲▲15．13±1．10▲▲丁香葉黃酮低劑量組(30mg/kg體重)6．40±0．461．14±0．04▲417．74±94．24▲58．77±1．248．84±0．49

2.3 小鼠肝組織中GSTA1含量的變化 小鼠肝組織中GSTA1含量的變化見(jiàn)封三彩版圖1，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中GSTA1含量極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，丁香葉黃酮高劑量組GSTA1含量極顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明40 mg/kg體重丁香葉黃酮可以明顯增加APAP肝損傷模型中肝組織內(nèi)GSTA1的含量，GSTA1的變化趨勢(shì)與GSH-Px、SOD、GSH相一致。

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)分析 小鼠肝臟病理學(xué)切片如封三彩版圖2所示： APAP模型組(圖b和圖c)脂肪變性，細(xì)胞核裂解、消失，嗜酸性變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；丁香葉黃酮高劑量組(圖d)脂肪變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，說(shuō)明肝組織受到了保護(hù)；中劑量組(圖e)也有一定的保肝作用。

3 討論

研究表明黃酮類(lèi)化合物對(duì)不同類(lèi)型的試驗(yàn)性肝損傷均有不同程度的保護(hù)作用。這種保護(hù)作用與黃酮類(lèi)化合物抗氧化、清除自由基、調(diào)節(jié)免疫等功能等有關(guān)。目前研究肝損傷的常用有血清轉(zhuǎn)氨酶和肝組織指標(biāo)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，II相藥物代謝酶GSTA1可以作為肝損傷模型的早期診斷指標(biāo)[5]，因此，本研究也以GSTA1作為丁香葉黃酮保肝作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。這些指標(biāo)的變化揭示了APAP打破了肝組織內(nèi)氧化和抗氧化的平衡。

ALT/AST是反映肝細(xì)胞變性損傷情況的常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)。本試驗(yàn)中，模型組ALT和AST極顯著升高，且AST/ALT>1，說(shuō)明模型組肝損傷明顯。而丁香葉黃酮高劑量組AST/ALT<1，再次驗(yàn)證了丁香葉黃酮對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。APAP造模對(duì)肝臟的損傷使肝細(xì)胞內(nèi)的線粒體遭到嚴(yán)重破壞，AST從線粒體中釋放，而丁香葉黃酮可以保護(hù)肝細(xì)胞內(nèi)線粒體的損傷[5]。GSH是解除毒素的特效物質(zhì)，它作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可以與自由基、重金屬等結(jié)合，從而把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)排泄出體外；SOD是機(jī)體在正常生理狀況下惟一能夠清除氧自由基的酶，GSH-Px也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)中催化GSH氧化的主要酶之一；NO是機(jī)體中一種極不穩(wěn)定的生物自由基；MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，其變化可以間接反映出由自由基損傷機(jī)體引發(fā)出的脂質(zhì)過(guò)氧化的情況。本試驗(yàn)中，丁香葉黃酮高劑量組的GSH、SOD、GSH-Px、MDA、NO的變化說(shuō)明丁香葉黃酮可以促使肝組織內(nèi)清除脂質(zhì)自由基、維持肝細(xì)胞的正常功能、排除毒素等。GSTA1是Ⅱ相酶GST的一個(gè)亞型，在編碼的二聚體蛋白過(guò)程中，是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，可以催化許多外源性化學(xué)物與GSH結(jié)合，促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)降解清除，達(dá)到保護(hù)肝臟的目的[6]。本試驗(yàn)中，GSTA1含量的變化說(shuō)明模型組肝組織內(nèi)自由基增多、氧化程度明顯，而丁香葉黃酮高劑量組肝組織內(nèi)自由基數(shù)量減少，氧化程度減輕，肝細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷程度降低，肝臟中GSTA1含量的升高對(duì)肝損傷具有保護(hù)意義。

本研究表明，丁香葉黃酮對(duì)APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷有良好的保護(hù)作用。在小鼠急性肝損傷時(shí)，肝臟中的GSTA1含量呈規(guī)律性變化，結(jié)合血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織指標(biāo)及肝組織病理學(xué)變化，確定丁香葉黃酮的保肝劑量為40 mg/kg體重。本研究為保肝藥物的開(kāi)發(fā)及肝損傷機(jī)制的進(jìn)一步探究提供依據(jù)。

[1] 郝婷婷. 治療肝炎新藥-紫丁香葉的研究[D]. 長(zhǎng)春: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[2] 王潔, 王冬梅, 齊富剛,等. 丁香葉提取物對(duì)豬源性大腸桿菌的抑菌作用研究[J]. 飼料工業(yè), 2015，36(14):11-13.

[3] Liu F, Lin Y, Li Z,etal. Glutathione S-transferase A1 (GSTA1) release, an early indicator of acute hepatic injury in mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 71: 225-230.

[4] 劉芳萍, 周瓊, 劉穎姝,等. APAP致小鼠急性藥物性肝損傷模型建立方法的研究[C]// 中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)與飼料毒理學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)暨獸醫(yī)毒理專業(yè)委員會(huì)第4次全國(guó)代表大會(huì)會(huì)議論文集，北京：中國(guó)毒理學(xué)會(huì)，2012.

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Study on protective effects of flavonoids in folium syringaeon drug hepatic injury in mice

ZHAO Chang-wei1, LIU Fang-ping1, ZUO Yong-mei2, MA Xin1, CHANG Yi-cong1, LI Rui1,LI Min-min1,HE Jing-shan1, SHI Chen-xi1, LI Zhi1, LIN Yue-xia1, HAN Qing1, LI Ji-chang1, GAO Li1

(1.College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2.Animal Health Supervision Institute of Heilongjiang Province，Harbin 150001，China)

To determine the protective effect of flavonoids on folium syringae, mice were randomly divided into 5 groups including control, model, folium syringae high, middle and low dose groups. Serum transaminases (ALT, AST), liver index (MDA, NO, SOD, GSH, GSH-Px) and GSTA1 were analyzed as detection indicators, and tissues were also collected for histopathology.The results showed that serum transaminases, MDA and NO were significantly reduced (P<0.01), and SOD, GSH, GSH-Px and GSTAI were significantly increased (P<0.01).In addition hepatic tissue, fat degeneration, necrosis and inflammatory cell infiltration were reduced in high dose group, while all the changes were less in middle and low dose groups.These results suggest that the folium syringae flavonoids has a protective effect on mice from drug hepatic injury at 40 mg/kg dose.

folium syringae flavonoids; hepatic injury; GSTA1; APAP; mice

LIU Fang-ping

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(31472241)；黑龍江省應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(PC13S03)

趙常偉(1989-)，男，碩士生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究，E-mail: 1211164846@qq.com

劉芳萍，E-mail：fangpingliu@126.com

S859.7

A

0529-6005(2017)02-0090-03