20味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌體外抑菌效果比較

郝景鋒， 李靜姬， 張宇航， 尹柏雙， 付連軍， 黃 巖， 李心慰， 李小兵， 趙晨旭， 劉國(guó)文

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林吉林132101 ； 2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130062)

20味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌體外抑菌效果比較

郝景鋒1， 李靜姬1， 張宇航1， 尹柏雙1， 付連軍1， 黃 巖1， 李心慰2， 李小兵2， 趙晨旭2， 劉國(guó)文2

(1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林吉林132101 ； 2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130062)

為了研究蒲公英、魚腥草等20味中藥對(duì)從隱性乳房炎奶牛乳汁中分離的大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，試驗(yàn)采用打孔法和試管二倍稀釋法進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)以及測(cè)定其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。試驗(yàn)結(jié)果表明，蒲公英、魚腥草、益母草、紅花、金銀花等5味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌的綜合抑制效果較好，達(dá)到了極度敏感或高度敏感，試驗(yàn)表明，蒲公英、魚腥草、益母草、紅花、金銀花在一定程度上可作為治療奶牛隱性乳房炎的首選藥物。

奶牛隱性乳房炎； 中草藥； 體外抑菌

奶牛乳房炎在中獸醫(yī)中被稱為乳癰，是痰、濕、氣、血郁結(jié)不散，在生產(chǎn)中對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，一度成為制約奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的瓶頸，而奶牛隱性乳房炎在我國(guó)發(fā)病率高達(dá)70%以上，抗生素治療奶牛乳房炎在一定程度上取得了較大成功，但其副作用亦十分明顯，對(duì)機(jī)體損傷巨大，嚴(yán)重破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境菌群平衡，在機(jī)體內(nèi)殘留較大而嚴(yán)重破壞乳的質(zhì)量，更嚴(yán)重的是由此而引起的細(xì)菌耐藥性，中藥治療奶牛乳房炎很好地克服以上弊端，我國(guó)中藥資源豐富，中醫(yī)理論博大精深，因此中藥治療奶牛乳房炎勢(shì)在必行[1]。本試驗(yàn)通過對(duì)吉林省某奶牛場(chǎng)隱性乳房炎奶牛中分離、純化并經(jīng)鑒定的致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌進(jìn)行體外抑菌效果研究，旨在了解隱性乳房炎致病菌的耐藥性，篩選出具有抑制引起乳房炎細(xì)菌感染的中藥，為利用中藥科學(xué)防控奶牛乳房炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)中藥：益母草、紅花、金銀花、地丁、肉桂、蒼術(shù)、香附、積實(shí)、黃連、黃芪、黃柏、苦參、穿心蓮、川芍、桃仁、當(dāng)歸、黨參、黃芩、蒲公英、魚腥草共20味中藥，均采購自吉林省吉林市重慶路大藥房；(2)菌株：奶牛隱性乳房炎病原菌大腸桿菌、鏈球菌以及金黃色葡萄球菌來自于吉林省某牛場(chǎng)，由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離、純化并鑒定，4 ℃保存，備用。

試驗(yàn)器材與試劑：常規(guī)培養(yǎng)基：綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養(yǎng)基，購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；疊氮鈉血培養(yǎng)基、甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基，購自江蘇晶美生物科技有限公司；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯按常規(guī)方法配制。

主要儀器：超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-2D)，南京萊步科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)為RE100-Pro)，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為BS-1E)，常州市萬豐儀器制造有限公司生產(chǎn)；SANYO全自動(dòng)滅菌鍋(型號(hào)為MLS-3750)，上海復(fù)昌科技有限公司生產(chǎn)；電子分析天平(型號(hào)為FA1004)，北京京科瑞達(dá)科技有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫水浴鍋(型號(hào)為DC-3020)，寧波市雙嘉儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)菌液的制備 將本試驗(yàn)保存的經(jīng)臨床分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng) 20 h，鏈球菌接種于綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑選典型菌落，分別將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于 5 mL普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，鏈球菌接種于 5 mL(含50 mL/L綿羊鮮血)的營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，用0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷岫缺葷幔竽c桿菌、金黃色葡萄球菌用普通營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋，鏈球菌用含50 mL/L綿羊鮮血的營(yíng)養(yǎng)肉湯中的營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋，均稀釋至 1×105CFU/mL，備用。

1.2.2 試驗(yàn)中藥液制備 以電子分析天平精確稱取蒲公英、魚腥草等20味中藥各30 g，粉碎過75目篩，于300 mL五餾水中侵泡45 min后，加熱至沸騰后改用文火煎煮1h，用8層紗布過濾，濾渣加300 mL五餾水侵泡45 min后，加熱至沸騰后改用文火煎煮1h，棄去濾渣，合并兩次濾液，藥液經(jīng)抽濾后置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，最終制成 1∶1 的流浸膏，1 mL流浸膏相當(dāng)于原藥材 1 g(g/mL)，100 ℃ 煮沸滅菌，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 體外抑菌試驗(yàn) 體外抑菌試驗(yàn)采用打孔法[2]，分別將1∶500稀釋的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌0.10 mL以及1∶50稀釋鏈球菌0.10 mL用涂菌棒將菌液均勻涂抹于培養(yǎng)基表面，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，鏈球菌接種于綿羊血液(50 mL/L綿羊鮮血)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng) 24 h，在涂菌的瓊脂培養(yǎng)基上用直徑6 mm的打孔器均勻打孔,在空中以無菌條件添加制備的各種中藥藥液0.10 mL，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小(mm)，數(shù)據(jù)結(jié)果處理方法采用5次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑在20 mm以上為極度敏感；抑菌圈直徑在10～20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑在6～10 mm為中度敏感；無抑菌圈為耐藥。

1.2.4 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定采用試管二倍稀釋法[3]進(jìn)行操作，取嚴(yán)格消毒的試管12支并編號(hào)，分別加入0.10 mL普通營(yíng)養(yǎng)肉湯(用于培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)和0.10 mL(50 mL/L綿羊鮮血)的營(yíng)養(yǎng)肉湯(用于培養(yǎng)鏈球菌)，在1號(hào)試管加入藥液0.10 mL，混勻，吸取0.10 mL加入2號(hào)試管，依次操作，10號(hào)試管吸取0.10 mL棄去，形成藥物濃度依次為(0.500，0.250，0.125，0.063，0.032，0.016，0.008，0.004，0.002，0.001 mg/mL)，11號(hào)試管不加病原菌作為陰性對(duì)照，12號(hào)試管不加藥液作為陽性對(duì)照，加完藥液后密封，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h測(cè)定數(shù)據(jù)。

1.2.5 最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 分別吸取0.10 mL上述中藥藥液在 MIC 以上還未見細(xì)菌生長(zhǎng)的各孔培養(yǎng)物，移至普通瓊脂培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)或含50 mL/L綿羊鮮血的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(用于培養(yǎng)鏈球菌)上，用無菌接種棒劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)，菌落數(shù)少于5個(gè)為該中藥的MBC值[4]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表1，大腸桿菌對(duì)益母草、紅花、金銀花、蒲公英以及魚腥草極度敏感；對(duì)黃柏、苦參、穿心蓮和黨參高度敏感；對(duì)地丁、肉桂、蒼術(shù)、香附、黃芩、黃連以及黃芪中度敏感；對(duì)枳實(shí)不敏感；金黃色葡萄球菌對(duì)益母草、紅花、金銀花、黃柏、苦參、穿心蓮、蒲公英以及魚腥草極度敏感；對(duì)地丁、黃連和黃柏高度敏感；對(duì)肉桂、香附、枳實(shí)、川芍、桃仁、當(dāng)歸和黨參中度敏感；對(duì)黃芩不敏感；鏈球菌對(duì)益母草、紅花、金銀花、蒲公英和魚腥草極度敏感；對(duì)黃連、穿心蓮和黃芩高度敏感；對(duì)地丁、黃芪、黃柏和苦參中度敏感，對(duì)蒼術(shù)和當(dāng)歸不敏感。

表1 20味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌體外抑菌效果 /mm

2.2 MIC測(cè)定的結(jié)果 MIC測(cè)定的結(jié)果見表2，對(duì)大腸桿菌作用效果最好的是蒲公英、益母草、紅花以及魚腥草，MIC分別為32、63、63 mg/mL以及 63 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌作用效果最好的是金銀花、益母草、紅花、蒲公英和魚腥草，MIC分別為63、63、63、125 mg/mL和125 mg/mL；對(duì)鏈球菌作用效果最好的是益母草、紅花、蒲公英、金銀花和魚腥草，MIC分別為32、32、63、63 mg/mL以及63 mg/mL。

表2 20味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌的最小抑菌濃度 (mg/mL)

2.3 MBC測(cè)定的結(jié)果 MBC測(cè)定的結(jié)果見表3，對(duì)大腸桿菌作用效果最好的是蒲公英、魚腥草、益母草以及紅花，MBC分別為63、63、125 mg/mL以及125 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌作用效果最好的是金銀花、益母草、紅花、蒲公英和魚腥草，MBC均為125 mg/mL；對(duì)鏈球菌作用效果最好的是益母草、蒲公英、金銀花、魚腥草以及紅花，MBC分別為63、63、63、63 mg/mL以及125 mg/mL。

3 討論與分析

3.1 中藥對(duì)奶牛乳房炎分離菌的體外抑制作用 中獸醫(yī)學(xué)認(rèn)為奶牛乳房炎即乳癰，是痰、濕、氣、血郁結(jié)不散，化而為炎。飼養(yǎng)管理不善，久臥濕熱之地，濕熱毒氣上溢，濕邪入侵乳房；胃中熱邪熾盛，肝氣郁滯，氣血紊亂,蘊(yùn)結(jié)乳房,乳絡(luò)阻塞而生癰腫；犢牛吸乳時(shí)咬破乳頭，邪毒入侵引起癰腫；患牛拒絕擠奶，乳汁瘀滯，乳房脹滿等均可導(dǎo)致本病。很多中藥都有抑菌、抗菌作用，有的療效甚至優(yōu)于抗生素[5]。所以，從中藥中尋找治療奶牛乳房炎的抗生素替代物已成為未來發(fā)展的方向，我國(guó)地大物博，中藥資源豐富，而且中藥具備地域性特點(diǎn)，中醫(yī)理論博大精深，對(duì)奶牛乳房炎研究歷史悠久，積累了寶貴的診療經(jīng)驗(yàn)，中藥具有對(duì)機(jī)體損傷小、毒副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性、殘留少、不破壞奶牛產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分等特點(diǎn)，能夠保證動(dòng)物性食品安全，研究表明，中藥含有多種活性物質(zhì)，對(duì)感染的病原菌具有明顯的殺菌域抑菌作用，從而達(dá)到防治該病的目的[6]。蒲公英性味：苦甘，寒，可入肝經(jīng)、胃經(jīng)，具備清熱解毒，利尿散結(jié)之功效；魚腥草味辛，性寒涼，歸肺經(jīng)，能清熱解毒、消腫療瘡、利尿除濕、清熱止痢、健胃消食，用治實(shí)熱、熱毒、濕邪、疾熱等；益母草味辛苦、涼，活血、祛淤、消水，治療胎漏難產(chǎn)、胎衣不下、瘀血腹痛、癰腫瘡瘍等癥；紅花性味：辛、溫，入心、肝經(jīng)，能活血通經(jīng)，散瘀止痛，有助于治瘀滯腹痛、瘡瘍腫痛療效；金銀花性寒，味甘，入肺、心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、抗炎功效，主治脹滿下疾、溫病發(fā)熱，熱毒癰瘍等癥。因此蒲公英、魚腥草、益母草、紅花和金銀花對(duì)奶牛隱性乳房炎主要致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌體外抑菌效果很好，理論上可以作為奶牛乳房炎治療首選中藥。

表3 20味中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎3種病原菌的最小殺菌濃度 (mg/mL)

注：數(shù)據(jù)結(jié)果采用5次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示

3.2 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)

從最小抑菌濃度以及最小殺菌濃度試驗(yàn)結(jié)果來看，大腸桿菌對(duì)益母草、紅花、魚腥草、金銀花以及蒲公英極度敏感，蒲公英、魚腥草、益母草MBC值達(dá)到63 mg/mL，以上幾味中藥均可入肝經(jīng)以及胃經(jīng)，治療癰腫瘡瘍均有較好效果，均有一定驅(qū)濕邪之功效，這與崔一喆[7]報(bào)道的魚腥草、金銀花以及蒲公英對(duì)奶牛乳房炎大腸桿菌抑菌效果良好一致；金黃色葡萄球菌對(duì)金銀花、益母草、紅花、蒲公英和魚腥草極度敏感，MIC達(dá)到125 mg/mL；鏈球菌對(duì)益母草、蒲公英、金銀花、魚腥草極度敏感，MBC值達(dá)到63 mg/mL，對(duì)桃仁、當(dāng)歸、黨參以及黃芩抑菌效果較差，與吳國(guó)娟[8]報(bào)道的結(jié)果不同，可能與本試驗(yàn)的當(dāng)歸、黨參等中藥水提法有關(guān)，可能與當(dāng)歸等中藥的水溶性有一定關(guān)系，有待于進(jìn)一步分析。從試驗(yàn)研究結(jié)果可以認(rèn)為蒲公英、魚腥草、益母草、金銀花以及紅花對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均有較好的抑菌、殺菌作用，奶牛乳房炎治療應(yīng)以清熱解毒、抗菌消炎、通經(jīng)活血、消腫止痛、活絡(luò)通乳為依據(jù)，因此可以考慮復(fù)方中藥治療奶牛乳房炎的可能性。本研究為體外抑菌效果比較，尚不可作為治療奶牛乳房炎的依據(jù)，具體效果應(yīng)以臨床試驗(yàn)效果加以驗(yàn)證，本研究成果可為臨床奶牛隱性乳房炎治療提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

4 小結(jié)

經(jīng)體外抑菌試驗(yàn)、MIC以及MBC值測(cè)定，蒲公英、魚腥草、益母草、紅花和金銀花對(duì)奶牛隱性乳房炎主要致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌顯示出很好的抑菌、殺菌效果，在臨床上以上幾味中藥可以作為治療奶牛隱性乳房炎的優(yōu)選藥物。

[1] 畢海林，唐達(dá)，唐建華.奶牛乳房炎的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012(11)：27-29.

[2] 孟慶娟，馮士彬.中草藥及其復(fù)方提取物對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(41)：257-259.

[3] 張森濤，叢日華，張文龍.中藥對(duì)奶牛隱性乳房炎的防治作用及對(duì)產(chǎn)奶量影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2005，1：10-11.

[4] 付秀花，王恬.中草藥對(duì)奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2002，19(5)：16-19.

[5] 孟慶娟.中藥復(fù)方灌注劑對(duì)奶牛乳房炎的防治效果及作用機(jī)理的研究田[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[6] 關(guān)宇晶，侯振中.奶牛乳房炎防治研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2013(8)：49-51.

[7] 崔一喆，張秀英，王秋菊.中草藥對(duì)奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果[J].中國(guó)獸藥雜志，2006，40(6)：28-30.

[8] 吳國(guó)娟，張中文，李煥榮，等.中草藥對(duì)奶牛乳房炎6種致病菌的抑菌效果觀察[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，18(3)：195-198.

[9] 杜曉杰，蘇戰(zhàn)強(qiáng)，張毅，等.敏感藥物對(duì)10例奶牛乳房炎的治療試驗(yàn)[J].草食家畜，2012(1)：82-83.

2016-03-18

吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20150204024NY)

郝景鋒(1977- )，男，副教授，博士生，從事臨床獸醫(yī)學(xué)教學(xué)及研究，E-mail：jlhjf2012@163.com

劉國(guó)文，E-mail：gwliu@jlu.edu.cn

S853.72

B

0529-6005(2017)02-0055-03