骨素對軟骨細(xì)胞及軟骨組織修復(fù)的影響

【摘要】本研究目的是使用細(xì)胞生物學(xué)，組織形態(tài)學(xué)方法和免疫組化染色法確定骨素對軟骨細(xì)胞及動物軟骨損傷修復(fù)治療效果。以人軟骨細(xì)胞C28/12進(jìn)行體外實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)10μg/mL的骨素對細(xì)胞的增殖效果最明顯，達(dá)到112.75%且有顯著性差異（P<0.05）。而100μg/mL的骨素對細(xì)胞分泌的透明質(zhì)酸和“型膠原蛋白最高，分別達(dá)到0.7723±0.011△ng/mL、8.722±0.23△ng/mL（P<0.05）。利用家兔進(jìn)行體內(nèi)試驗，結(jié)果顯示骨素在軟骨損傷修復(fù)上有非常好的效果，且對炎癥因子（IL-1b、TNF-αa）及尿酸的分泌有很好的的抑制效果，同時對生長因子TGF-β分泌有促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】骨素;軟骨細(xì)胞;軟骨組織;炎癥因子;尿酸

[中圖分類號]R91 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）09-0001-02

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是世界范圍內(nèi)最普遍的疾病之一[1]，它是由外部因素（如創(chuàng)傷）或內(nèi)在因素（如各種類型的分子功能障礙）導(dǎo)致的代謝失衡引起的。這種不平衡導(dǎo)致細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而釋放一氧化氮（NO），導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周基質(zhì)（ECM）退化[2]。

軟骨細(xì)胞作為軟骨組織唯一的細(xì)胞類型，表達(dá)和分泌大量軟骨細(xì)胞周基質(zhì)（ECM）維持軟骨正常功能[3]，而軟骨PCM主要是由Ⅱ型膠原和脂多糖PGs（HA、CS）組成。Ⅱ型膠原是骨型成型、軟骨形成、骨骼成長和成熟軟骨維持等所必須的;透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）則是體內(nèi)蛋白多糖合成的重要組成部分，可以通過減少炎癥介質(zhì)的釋放，同時延緩軟骨損傷所導(dǎo)致的生物化學(xué)改變，抑制軟渭基質(zhì)進(jìn)一步退變和降解，所以具有很強(qiáng)的持續(xù)性增強(qiáng)內(nèi)源性軟骨修復(fù)的效應(yīng)。在關(guān)節(jié)炎癥過程中，巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，如白介素IL-1β，IL一6和腫瘤壞死因子TNF-α，以及許多生長因子。這些細(xì)胞因子誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）[4]的表達(dá)，這些細(xì)胞因子可以消化ECM的大分子和不在ECM中的分子，如受體、生長因子、細(xì)胞因子和趨化因子[5]。

本研究的目的是使用細(xì)胞生物學(xué)，組織形態(tài)學(xué)方法和免疫組化染色法確定骨素對軟骨細(xì)胞及動物軟骨損傷修復(fù)治療效果，從而對骨關(guān)節(jié)的保護(hù)起到一定的作用。

1 實(shí)驗儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），組織切片機(jī)（Thermo），組織包埋機(jī)（Thermo），酶標(biāo)儀（Tecan），CCK-8，IL-1β，TNFα，TGF-β，人透明質(zhì)酸（HA），人Ⅱ型膠原蛋白ELISA試劑盒，胎牛血清（Gibco），DMEM，軟骨細(xì)胞C28/12，HE染液，石蠟，動物新西蘭兔，雄性成年，2.5～3.3kg，36只（上海動物實(shí)驗中心），YDJZ.11醫(yī)用電動鋸鉆（上?；鄱鳎@微鏡。

2 實(shí)驗方法

2.1 骨素對軟骨細(xì)胞C28/12增殖影響 將分離得到的軟骨細(xì)胞C28/12，轉(zhuǎn)入T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，待生長至80%左右將軟骨細(xì)胞C28/12離心回收，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)，%孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔接入2.0～4.0×104個細(xì)胞，培養(yǎng)24h。待測樣品配置成相應(yīng)濃度，0.22μm濾膜過濾除菌。（1）實(shí)驗分組，陰性對照：空白（不加骨素）樣品濃度設(shè)置：骨素100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL（2）取樣品目標(biāo)濃度加入軟骨細(xì)胞C28/12中37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24H后加10μl的CCK-8，37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1～4h，檢測OD450值。

2.2 骨素對軟骨細(xì)胞C28/12分泌人透明質(zhì)酸和人Ⅱ型膠原蛋白分泌影響 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品處理和細(xì)胞增殖試驗相同，實(shí)驗分組如下：（1）陰性對照：空白（不加骨素和細(xì)胞）;樣品濃度設(shè)置：骨素1000μg/mL，100μg/mL、10μg/mL、1μg/mL;陽性對照：空白（不加骨素）。（2）取樣品目標(biāo)濃度加入軟骨細(xì)胞C28/12中37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于24H后、取上清，3000轉(zhuǎn)離心20min，收集上清液。（3）按照試劑盒說明書，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，同時按照說明書的步驟進(jìn)行樣品檢測。

2.3 軟骨缺失動物模型處理 軟骨缺失家兔組織模型處理及分組，將家兔隨機(jī)分為5組。對照組（A組）、模型組（B組）、低劑量骨素組（C組）、高劑量骨素組（D組）、硫酸軟骨素（E組）。每組6只。造模后對損傷的關(guān)節(jié)進(jìn)行復(fù)位，同時縫合傷口。對照組澤則不做任何處理。術(shù)后注射80萬單位的青霉素鈉，1次/天，連續(xù)3天，并在第5天強(qiáng)化一次，以防感染。術(shù)后第二天進(jìn)行灌胃，每日一次（給藥量按人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表計算）[6]。（1）對照組，每天灌胃等量蒸餾水，連續(xù)5周。（2）模型組，每天灌胃等量蒸餾水，連續(xù)5周。（3）給藥組針對于實(shí)驗動物組和陽性藥物對照組，每天按劑量灌胃，分別為低劑量骨素按照0.2g/kg，高劑量骨素按照0.4g/kg，連續(xù)5周[7]。

2.4 骨素對軟骨組織切片觀察及炎癥因子分泌影響 灌胃5周后，經(jīng)耳緣靜脈10%水合氯醛（2m1/kg）麻醉，用碘酒、乙醇消毒膝關(guān)節(jié)后，從骸上囊部位注射1mL無菌磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，反復(fù)活動關(guān)節(jié)后，抽取灌洗液[7]，做好標(biāo)記采用ELISA法檢測兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α和TGF-1β的水平;腹主動脈取血，4000r/min離心4min后取血清，采用HPLC法測定血清中尿酸的水平;在無菌條件下切開關(guān)節(jié)腔，取出關(guān)節(jié)并固定于10%甲醛固定液后，常規(guī)脫鈣、沖洗、脫水、包埋和切片，HE染色處理，經(jīng)光鏡對切片進(jìn)行病理組織學(xué)觀察[8]。

3 實(shí)驗結(jié)果

3.1 骨素促進(jìn)軟骨細(xì)胞C28/12增殖 實(shí)驗結(jié)果中，把對照組的增值率設(shè)為100%，當(dāng)骨素濃度為1μg/mL時，軟骨細(xì)胞C28/12增值率為106.82%，而濃度分別為10μg/mL，100μg/mL時，增值率分別達(dá)到112.75%，106.15%且細(xì)胞的增值率有顯著性差異（P<0.05），結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度骨素對軟骨細(xì)胞C28/12增殖的影響

3.2 骨素促進(jìn)軟骨細(xì)胞C28/12分泌人透明質(zhì)酸和人B型膠原蛋白分泌利用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行ELISA試驗并測得標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細(xì)胞液中的人透明質(zhì)酸（HA）含量和人n型膠原蛋白含量。實(shí)驗組和陽性對照有顯著性差異（P<0.05），結(jié)果見表I。

表1 人透明質(zhì)酸HA和人I Ⅰ型膠原蛋白分泌含量的變化（x±s）

3.3 病理組織學(xué)觀察通過HE染色可以發(fā)現(xiàn)，家兔對的損傷部位，修復(fù)處可見明顯的初期反應(yīng)。模型組與骨素組在損傷處與對空白照組相比都有不同程度的修復(fù)，但通過對比觀察可以發(fā)現(xiàn)模型組的修復(fù)相比骨素組要差，缺損處多事纖維組織和肉芽組織，軟骨細(xì)胞較少，且排列較紊亂。給予骨素組后，損傷處被少量死骨，增生的成骨細(xì)胞及纖維組織填充，而且給予骨素后表面有增生的骨膜組織生成，表面軟骨細(xì)胞平行排列，底部可見新生骨小梁。

圖2不同濃度骨素對兔關(guān)節(jié)干預(yù)情況組織切片觀察

3.4 骨素對軟骨組織炎癥因子分泌影響利用ELISA試劑盒對兔關(guān)節(jié)的灌洗液中的炎性因子（IL-Ip、TNF-司的分泌量進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示，模型組的炎癥因子的分泌量較高，而給予骨素干預(yù)情況中，高濃度的骨素組炎癥因子要比低濃度組的低并且兩組都要低于模型組，同時高濃度的骨素組干預(yù)效果接近硫酸軟骨素組;灌洗液中生長因子TGF-p也隨著干預(yù)下有所提高，同時尿酸的含量在下降。 圖3不同濃度骨素對兔關(guān)節(jié)干預(yù)情況下各因子分泌情況

4討論

本研究初步驗證了骨素對軟骨細(xì)胞的增殖有明顯效果，加速骨愈合過程。骨素對軟骨的保護(hù)作用還體現(xiàn)在能夠提高滑膜液產(chǎn)生透明質(zhì)酸的能力，關(guān)節(jié)腔內(nèi)正常透明質(zhì)酸可以降低軟骨面的蛻變，減輕骨性關(guān)節(jié)炎。骨素還可以減低骨關(guān)節(jié)損傷造成的炎癥因子分泌，同時分泌大量TGF-p修復(fù)受損軟骨組織。所以骨素在骨關(guān)節(jié)健康上有非常好的效果，也為骨關(guān)節(jié)疾病提供一個好的方向。

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作者簡介：費(fèi)維成，男，漢族，安徽滁州人，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)碩士，日本廣島大學(xué)藥學(xué)博±在讀。輝文生物研發(fā)中心，安全與功效評價研究員。研究方向：化妝品與食品功效研究、微生物發(fā)酵和功能開發(fā)。