“FQ-PCR溶解曲線法”監(jiān)測(cè)麻風(fēng)患者TCR a鏈CDR 3譜系漂移的研究

張力丹 張慶波 楊小靜 韋蓉 陳利遠(yuǎn) 姚新生

“FQ-PCR溶解曲線法”監(jiān)測(cè)麻風(fēng)患者TCR a鏈CDR 3譜系漂移的研究

張力丹1張慶波1楊小靜1韋蓉1陳利遠(yuǎn)1姚新生2

麻風(fēng)病是由麻風(fēng)桿菌引起的一種慢性接觸性傳染病。主要侵犯人體皮膚和神經(jīng)，如果不治療可引起皮膚、神經(jīng)等永久性的損害。當(dāng)下，我國(guó)對(duì)麻風(fēng)病的治療以預(yù)防為主，而對(duì)于那些已經(jīng)患上麻風(fēng)病的患者來說，治療方法還值得更深層次的研究探索。本篇文章的研究方法是通過T細(xì)胞受體a鏈V區(qū)基因各家族CDR 3免疫譜系分析技術(shù)來監(jiān)測(cè)麻風(fēng)患者TCR a鏈CDR 3譜系的漂移情況，進(jìn)而初步分析出TRAV家族的CDR 3 PCR產(chǎn)物定量和克隆增生情況，以此為被麻風(fēng)感染后的患者的T細(xì)胞免疫應(yīng)答變化提供新的研究方向。

CDR 3；FQ-PCR；溶解曲線

T細(xì)胞是麻風(fēng)病發(fā)病的重要參與者，其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在麻風(fēng)的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用[1]。本研究利用FQ-PCR 產(chǎn)物的溶解曲線分析原理，對(duì)“FQ-PCR溶解曲線法”監(jiān)測(cè)麻風(fēng)患者TCR a鏈CDR3譜系漂移進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與試劑

麻風(fēng)患者外周血10份（由遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供），正常健康自愿者外周血4份作為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Yao XS等[2]中提到的參考文獻(xiàn)的合成方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，人體TRAV遺傳基因上面存在32條有印物和1條TRAC下游引物，繼而生成對(duì)照組TRAC上游引物1條，上述所有引物由 Inviogen 上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 總RNA提取和cDNA合成 根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象總體RNA的提取試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，獲得十例麻風(fēng)病患者DNA提取物和四例健康志愿者的外周血RNA后，根據(jù)合成條件，用Oligo dT作為引物擴(kuò)增cDNA。

1.2.3 FQ-PCR擴(kuò)增TRAV家族a鏈CDR3區(qū)段PCR擴(kuò)增 將實(shí)驗(yàn)過程中獲得的每個(gè)樣品都做出36個(gè)PCR的反應(yīng)試管，試管編號(hào)及實(shí)驗(yàn)作用情況如下：第1～34號(hào)試驗(yàn)用試管為實(shí)驗(yàn)樣本試管，第35管為GAPDH對(duì)照管，第36管為無引物對(duì)照管；對(duì)于34個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品用試管中均加入cDNA 1μl，上、下游引物各1μl，與此同時(shí)用熒光定量Mix 10μl，完成熒光劑定量后用純水加入至20μl。FQ-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：一是94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃50 s，45個(gè)循環(huán)；94 ℃ 3 min，一個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán);二是對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品的溶解曲線進(jìn)行分析：從75～95 ℃以0.2 ℃/s讀取一個(gè)熒光值，100 cycles；三是FQ-PCR 產(chǎn)物取8 ul，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，剩余樣本-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 CD3 FQPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

健康志愿者實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明，其外周血標(biāo)本的32個(gè)TRAV家族CDR3譜型FQ-PCR產(chǎn)物在1.5%，而麻風(fēng)病患者的標(biāo)本樣品檢測(cè)結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)位置處只有一條帶。

2.2 TCR a鏈CDR3譜型

4例健康者PBMC的32個(gè)CDR3譜型的FQ-PCR產(chǎn)物均為多峰圖型，無雙峰、偏峰、單峰及無峰家族；麻風(fēng)患者PBMC的32 個(gè)TRAV家族CDR3譜型的FQ-PCR產(chǎn)物各家族相對(duì)定量表達(dá)不一，PBMC的32個(gè)TRAV家族CDR3和對(duì)照溶解曲線譜型顯示，部分TRAV家族表現(xiàn)為雙峰、偏峰、單峰圖，極少數(shù)表達(dá)頻率極低或消失表現(xiàn)為無峰圖。

3 討論

麻風(fēng)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，T細(xì)胞在抵抗麻風(fēng)分枝桿菌的免疫反應(yīng)中作用重要，多項(xiàng)研究證實(shí)T細(xì)胞的數(shù)量及功能決定了細(xì)胞免疫的強(qiáng)弱，其與麻風(fēng)的進(jìn)程密切相關(guān)[3-4]，T細(xì)胞TCR CDR3譜系偏向性與麻風(fēng)的進(jìn)程顯著相關(guān)[5]。T淋巴細(xì)胞獨(dú)特的TCR CDR3分子，形成多樣性的CDR3基因譜型，它在很大程度上決定了人體血液免疫T細(xì)胞的功能特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛲ㄟ^對(duì)T細(xì)胞中特定CDR3序列的測(cè)定，能夠反映出人體免疫T細(xì)胞的增殖情況，進(jìn)而由此增殖狀態(tài)推測(cè)出其功能水平。

孫永蘋等學(xué)者在文獻(xiàn)研究中指出了TCR CDR3譜系漂移分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于感染性疾病、移植、腫瘤和自身免疫病等[6-7]。本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法是利用溶解曲線與FQ-PCR的方法建立了“FQ-PCR溶解曲線法監(jiān)測(cè)健康志愿者和患者之間的TCR a鏈CDR3譜系漂移技術(shù)”， 在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)每個(gè)患者TRAV家族的CDR3 FQ-PCR產(chǎn)物進(jìn)行相對(duì)定量分析，監(jiān)測(cè)麻風(fēng)患者外周血樣本TCR CDR3的譜系漂移[8-10]。

本文研究分析了10例麻風(fēng)患者和4例健康者TRAV各家族的CDR3 譜序，結(jié)果顯示，健康者PBMC的32個(gè)TRAV家族溶解曲線圖為多峰，而對(duì)照組TRAC、GAPDH為單峰，說明CDR3產(chǎn)物存在多樣性，提示FQ-PCR產(chǎn)物的多態(tài)性可用溶解曲線法進(jìn)行分析，進(jìn)而用于研究麻風(fēng)患者TCR CDR3的譜型特征。而10例麻風(fēng)患者PBMC的TRAV家族溶解曲線圖為單峰和多峰圖。本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)和初步數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究麻風(fēng)的應(yīng)答機(jī)制和個(gè)體化的抗麻風(fēng)T 細(xì)胞治療提供了基礎(chǔ)。

[1]S Sadhu，BK Khaitan，B Joshi，et al． Reciprocity betw een Regu latory T Cells and Th17 Cells: Relevance to Polarized Immunity in Leprosy[J]． PLoS Negl Trop Dis，2016，10（1）：e0004338．

[2]X Yao，Y Diao，W Sun，et al． Analysis of the CDR 3 length repertoire and the diversity of TCR alpha chain in human peripheral blood T lymphocytes[J]． Cell Mol Immunol，2007，4（3）：215-220．

[3]Saini C，Ramesh V，Nath I． Increase in TGF-β secreting CD4+ CD25+ FOXP3+ T regulatory cells in anergic lepromatous leprosy patients[J]． PLoS Negl Trop Dis，2014，8（1）：e2639．

[4]Bobosha K，W ilson L，van Meijgaarden KE，et al． T-cell regulation in lepromatous leprosy[J]． PLoS Negl Trop Dis，2014，8 （4）：e2773．

[5]W ang X，Golkar L，Uyemura K，et al． T cells bearing V beta 6 T cell receptors in the cell-mediated immune response to Mycobacterium leprae[J]． Journal of Immunology，1993，151（12）：7105-7116．

[6]孫永蘋，石彬，朱紅倩，等． FQ-PCR溶解曲線技術(shù)分析白血病患者PBMC中T細(xì)胞TCR儀／βCDR 3譜系特征[J]． 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（1）：39-47．

[7]孫永蘋，湯賢英，朱紅倩，等． 一例彌漫性大B淋巴細(xì)胞瘤組織樣本T細(xì)胞TCR α/β CDR3譜序的初步分析[J]． 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35（2）：98-103．

[8]Maeda Y，Tamura T，F(xiàn)ukutomi Y，et al． A lipopeptide Facilitate induction of Mycobacterium leprae killing in host cells[J]． Pios Negl Trop Dis，2011，5（11）：e1401．

[9]楊麗文，李月紅，姚新生． 麻風(fēng)T細(xì)胞應(yīng)答及TCR CDR 3譜序研究進(jìn)展[J]． 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2015，31（6）：347-350．

[10]Kumar S，Naqvi RA，Bhat AA，et al． IL-10 Production from dendritic cells is associated With DC SIGN in humam leprosy[J]．Immunobiology，2013，218（12）：1488-1496．

醫(yī)學(xué)論文中統(tǒng)計(jì)分析方法的選擇

對(duì)于定量資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計(jì)類型、資料所具備的條件和分析目的，選用合適的統(tǒng)計(jì)分析方法，不應(yīng)盲目套用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；對(duì)于定性資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計(jì)類型、定性變量的性質(zhì)和頻數(shù)所具備的條件以及分析目的，選用合適的統(tǒng)計(jì)分析方法，不應(yīng)盲目套用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于回歸分析，應(yīng)結(jié)合專業(yè)知識(shí)和散布圖，選用合適的回歸類型，不應(yīng)盲目套用簡(jiǎn)單直線回歸分析，對(duì)具有重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的回歸分析資料，不應(yīng)簡(jiǎn)單化處理;對(duì)于多因素、多指標(biāo)資料，要在一元分析的基礎(chǔ)上，盡可能運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，以便對(duì)因素之間的交互作用和多指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系作出全面、合理的解釋和評(píng)價(jià)。

Study on the FQ—PCR Dissolution Curve Method for M onitoring a TCR Chain CDR3 in Leprosy Patients

ZHANG Lidan1ZHANG Qingbo1YANG Xiaojing1WEI Rong1CHEN Liyuan1YAO Xinsheng21 Department of Dermatology, The Second People’s Hospital of Guiyang City, Guiyang Guizhou 550001, China, 2 Department of Immunology, School of Basic Medical Sciences of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou 563000, China

Leprosy is a chronic infectious diseasecaused by M ycobacterium leprae. Majorviolations of human skin and nerves, if not treatment can cause permanent damage to the skin, nerves, etc. At present, Chinese treatment of leprosy prevention, and for those patients who have been suffering from leprosy, treatment is also worth studying deeper exploration. The research method of this article is through the T cellreceptor gene drift a chain V region each family CDR3 immune pedigree analysis technique to monitor leprosy patient TCR a chain CDR3 pedigree, and preliminary analysis of CDR3 PCR products and TRAVcloning of quantitative hyperplasia of the family, in order to provide a new research direction for T cell immune response changes after the patients infected with leprosy.

CDR3, FQ-PCR, Dissolution curve

R 440

A

1674-9308（2016）35-0045-02

10．3969/j．issn．1674-9308．2016．35．023

1 貴陽(yáng)市第二人民醫(yī)院皮膚科，貴州 貴陽(yáng) 550001；2 遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563000