全國首例子宮移植者術后他克莫司濃度和淋巴細胞亞群監(jiān)測及臨床意義

李蕊，楊柳，李金潔，常亮，楊靜，蘇明權，陳必良，馬越云，郝曉柯

(第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院a.全軍臨床醫(yī)學檢驗研究所，b.婦產科，西安 710032)

全國首例子宮移植者術后他克莫司濃度和淋巴細胞亞群監(jiān)測及臨床意義

李蕊a，楊柳a，李金潔a，常亮a，楊靜a，蘇明權a，陳必良b，馬越云a，郝曉柯a

(第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院a.全軍臨床醫(yī)學檢驗研究所，b.婦產科，西安 710032)

目的 探討子宮移植后受者他克莫司血藥濃度及外周血淋巴細胞亞群的變化規(guī)律，為子宮移植后免疫狀態(tài)的監(jiān)測提供依據。方法 采用微粒子酶免疫分析法連續(xù)檢測子宮移植受者術后1年內他克莫司全血藥物濃度的變化情況。全血樣本同時用血液分析儀測定血液常規(guī)指標，流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群。結果 子宮移植受者術后第1個月他克莫司藥物血藥濃度為(13.51±3.92) ng/mL，第2個月為(15.58±1.19) ng/mL。術前淋巴細胞絕對計數處于正常水平；術后5 d外周血CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4/CD8、NK細胞均顯著減少；術后1周后淋巴細胞趨向于正常范圍并維持，CD4+T淋巴細胞恢復正常時間晚于CD8+T淋巴細胞；CD4/CD8在術后10 d內，比值在0.4～0.8之間，10 d后比值上升，基本維持在0.8至1.1之間，始終低于術前水平；NK細胞在術后10 d逐漸上升，但直至術后20 d仍未恢復至術前水平；B淋巴細胞計數和百分比在術后5 d不但沒有下降反而處于增高趨勢，并于術后10 d之后計數和百分比逐漸恢復正常。CD3+T淋巴細胞計數與他克莫司血藥濃度之間并未見明顯相關性。結論 子宮移植患者淋巴細胞亞群和他克莫司藥物濃度呈動態(tài)變化，但還需積累大量臨床數據。

子宮移植；他克莫司；淋巴細胞亞群

同其他器官移植一樣，排異反應和感染是子宮移植的兩大難點。由于子宮與外界相通，感染隨時可能發(fā)生，但感染與排斥反應的治療方案卻完全相悖，因此，及時識別和控制排異反應對提高子宮移植成功率具有極其重要的意義。目前，子宮移植尚無早期監(jiān)測指標。常用的免疫抑制劑他克莫司(Tacrolimus，代號FK506)個體藥物代謝動力學差異大，治療劑量和中毒劑量非常接近，易出現藥物不良反應，因此移植術后需進行藥物濃度監(jiān)測并及時調整藥量，從而達到理想治療濃度窗[1]。目前器官移植術后免疫排斥反應機制已較為明確，主要為T細胞及抗體介導的排斥反應，并以前者為主。監(jiān)測受者的外周血淋巴細胞，能反映其免疫狀態(tài)，故本研究對子宮移植術后送檢樣本測定他克莫司全血谷濃度，同步進行血常規(guī)和外周血淋巴細胞亞群測定，以期為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 對象 國內首例子宮移植受者，女，年齡23歲，先天性子宮缺失，于2015年11月20日在第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院接受子宮移植手術，供者為患者母親，HLA配型結果完全符合。子宮移植術后50 d出院，至今未發(fā)生排異反應，子宮存活良好，未發(fā)生排斥反應。術后采用“三聯(lián)”免疫抑制劑(他克莫司+嗎替麥考酚+甲潑尼龍琥珀酸鈉)抗排斥方案治療。給藥方式：他克莫司、嗎替麥考酚給藥方式為口服，給藥次數均為：每日2次，他克莫司早9：00、晚9：00各一次，嗎替麥考酚早8：30、晚8：30各一次。甲潑尼龍琥珀酸鈉術中及術后前4天為靜脈續(xù)滴，4天后改為空腹口服，每日1次。他克莫司在50天內根據患臨床表現及其他檢驗結果每日劑量為3 mg,上下調整1 mg；嗎替麥考酚每日劑量為1.5 g；甲潑尼龍琥珀酸鈉術中大劑量沖擊，治療后由靜脈續(xù)滴改為口服，4 d后由60 mg開始逐漸遞減。2個月后改維持劑量。

1.2 標本采集 在清晨用藥前處于穩(wěn)定狀態(tài)時抽取乙二胺四乙酸抗凝全血，術后第1至30、35、38、41、44、47、50天以及出院后復查期內共采集標本46份。每份樣本充分混勻后分成3份，分別用于他克莫司血藥濃度、血常規(guī)以及淋巴細胞亞群測定。

1.3 他克莫司血藥濃度測定 用美國Abbott公司IMx自動免疫分析儀及他克莫司檢測試劑盒(微粒子酶免疫分析法)測定他克莫司全血谷濃度。

1.4 紅細胞比容(haematocrit，Hct)測定 用Sysmex五分類自動血液分析儀進行血常規(guī)分析，溶血劑和稀釋劑為該儀器配套試劑，在紅細胞計數測定結果中記錄Hct值。

1.5 淋巴細胞亞群測定 用BD公司FACS CantoII流式細胞儀進行淋巴細胞亞群計數，并使用FACS CantoII臨床軟件對結果進行分析。其中單克隆抗體和溶血素均購自美國BD公司。

1.6 統(tǒng)計學分析 用SPSS 17.0軟件進行。數據以均數±標準差表示，相關性分析用Pearson相關系數檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 子宮移植術后不同時期他克莫司的全血谷濃度 連續(xù)監(jiān)測子宮移植受者術后1年的他克莫司血藥谷濃度，血藥濃度基本維持在10～20 ng/mL，在15 ng/mL上下波動。術后第1個月內血藥濃度為(13.51±3.92) ng/mL，第1～3個月為(13.73±3.58) ng/mL，第4～6個月為(10.64±1.24) ng/mL，第7～12個月為(8.68±0.68) ng/mL。見圖1。

圖1 子宮移植術后他克莫司監(jiān)測濃度

2.2 移植受者術后全血樣本的Hct值 在46份全血測定樣本中，共有11份血樣的Hct值低于25%(參考范圍35%～45%)，主要集中于術后15 d內。

2.3 移植受者術后20 d內TBNK淋巴細胞亞群細胞的變化 CD3+T淋巴細胞計數和百分比在術后5 d均下降，術后10 d后逐漸恢復術前水平。CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞計數和百分比在術后均明顯下降，而后逐漸恢復正常，其中CD4+T淋巴細胞恢復略慢于CD8+T淋巴細胞。NK細胞計數在術后5 d明顯下降，在術后10 d起逐漸上升，但直至術后20 d仍然未恢復至術前水平。同其他兩類淋巴細胞不同，B淋巴細胞計數和百分比在術后5 d不但沒有下降反而處于增高趨勢，在術后10 d計數達術前4倍，10 d之后計數和百分比逐漸恢復正常，見表1。

2.4 移植受者術后1年內外周血T淋巴細胞亞群監(jiān)測結果 術后1周后T淋巴細胞相對計數和絕對計數迅速增高，之后逐漸恢復術前水平并維持，其中CD4+T淋巴細胞與CD3+T淋巴細胞的變化更具有同步性，見圖2和圖3。CD4/CD8在術后10 d內，比值在0.4～0.8之間，圍繞0.6上下波動，10 d后比值上升，術后第1個月為0.87±0.21，第1～3個月為0.89±0.19，第4～6個月為1.02±0.089，第7～12個月為0.76±0.07，但始終低于術前水平，見圖4。

表1 移植術后淋巴細胞亞群TBNK的變化

圖2 T淋巴細胞亞群相對計數的變化

圖3 T淋巴細胞亞群絕對計數的變化

圖4 CD4/CD8比值的變化

2.5 全血谷濃度與CD3+淋巴細胞的相關性分析 Pearson相關性檢驗顯示，他克莫司全血谷濃度與CD3+T淋巴細胞計數間無相關性(P>0.05)。

3 討論

本研究采用目前肝腎移植術后常用的“三聯(lián)”免疫抑制劑，從移植后1年的結果來看，患者情況良好，無排斥反應發(fā)生。2010年中華醫(yī)學會器官移植學分會撰寫的《他克莫司在臨床肝移植中的應用指南》[2]中推薦的他克莫司目標全血濃度值如下：術后1個月內目標全血谷濃度為10～15 ng/mL，第2～3個月為7～11 ng/mL，第4～6個月后為5～8 ng/mL，并維持。中華醫(yī)學會器官移植學分會撰寫的《他克莫司在臨床腎移植中的應用指南》[3]中推薦的他克莫司目標全血濃度值較上述更加詳細：術后1個月內為6～15 ng/mL，第1～3個月8～15 ng/mL，第4～6個月7～12 ng/mL，第7～12個月5～10 ng/mL，1年以后為7～9 ng/mL。但針對于子宮移植尚未有明確的推薦治療濃度。他克莫司的藥物濃度受多種因素的影響，如個體差異、藥物劑量、給藥途徑、疾病狀態(tài)，食物與藥物濃度相互作用等[4-5]。若受者為年輕健康女性，藥物濃度一般高于治療濃度；患者合用的奧美拉唑可以增加他克莫司血藥谷值濃度?；颊咴谛g后11 d，食量明顯增加，他克莫司濃度下降至8.4 ng/mL。所以血藥濃度不能僅僅看數值，還需靠臨床經驗和其他輔助檢查全面分析才能正確理解血藥濃度的臨床意義，從而制定個體化的給藥方案，在免疫治療和免疫排斥之間取得平衡。國外文獻報道，器官移植者全血樣本Hct值小于25%或大于45%時，用微粒子酶免疫法測定的他克莫司血藥濃度會高于實際血藥濃度[6]。通過測定子宮移植受者的全血樣本，絕大部分樣本的Hct值為25%～45%，但其中有11份血樣的Hct值低于25%，并且主要來自于術者術后15 d內的標本，針對這些樣本的血藥濃度是否偏高還需慎重考慮?？傮w來說，術后他克莫司的濃度符合肝腎移植的推薦藥物濃度參考范圍，并且濃度更接近于腎移植的術后推薦藥物濃度。

他克莫司主要抑制T細胞活化核因子(nuclear factor of activated T cell, NF-AT)等轉錄因子的活化而發(fā)揮抑制T淋巴細胞活化和效應的功能。他克莫司不僅抑制CD4+T淋巴細胞活化，也抑制CD8+細胞毒T淋巴細胞的產生[7]。在移植術后早期，淋巴細胞和各亞群細胞數量大大降低，可能與移植時大量失血導致的白細胞丟失和手術過程中大劑量甲潑尼龍的應用抑制體內的儲存池釋放白細胞有關[8]。而CD3+T淋巴細胞和CD8+淋巴細胞數量變化不同步，這可能與他克莫司對細胞毒性T細胞(CD8+CD28+亞型)有免疫抑制效應而表現為 CD8+淋巴細胞數量減少，他克莫司對CD8+CD28-亞型則有免疫調節(jié)作用而表現為CD8+淋巴細胞數量增加[9]有關。但B細胞數量反而增高，可能也是由于甲潑尼龍琥珀酸鈉抑制了體內的TH1類反應，TH2類反應增強[10-12]。術后10 d，患者的各亞群淋巴細胞迅速回升，達到移植前水平。一般情況下，急性排斥在臨床癥狀出現前1～5 d，T淋巴細胞總數和CD4/CD8比值上升，但要全面分析淋巴細胞檢查結果，因為在免疫抑制過度時，CD4+淋巴細胞和CD8+淋巴細胞有可能都減少，這樣CD4/CD8 比值可能反而也會上升。從術后1年的監(jiān)測結果來看，CD4/CD8的值維持在0.8～1.0范圍之內，能夠較好地預防排斥反應以及感染的發(fā)生。

免疫抑制藥物在臨床應用中顯示了良好的效果，但是這些免疫抑制劑均或多或少地損害了T 細胞的功能，易導致感染、惡性腫瘤的發(fā)生。對于CD4/CD8比值與排異反應之間的關系，有學者認為器官移植后CD4/CD8比值低下的患者發(fā)生排異反應反而較多[12]。一般來講，在排斥反應發(fā)生時CD8細胞計數會升高而CD4細胞數量仍然較低。B細胞數目增高，提示機體可能由于移植后抗排異藥物的應用，機體處于TH2極化狀態(tài)，有利于機體建立對移植器官的免疫耐受。NK細胞百分比稍低于術前水平也與免疫抑制劑的使用有關。因此，CD3+、CD4+、CD8+、NK細胞絕對值較低提示移植后患者細胞免疫功能較低，容易發(fā)生感染。研究表明，淋巴細胞計數在1 000 cell/μL以下時易發(fā)生移植后巨細胞病毒(CMV)感染， CD4+淋巴細胞計數在400 cell/μL以下時要警惕機會感染[10]。此時要緊密結合臨床微生物檢測結果，區(qū)分是感染和用藥導致的菌群失調，建議醫(yī)生合理使用抗生素。

綜上所述，鑒于肝腎移植已經積累了豐富的臨床經驗，子宮移植也可在臨床用藥、治療和圍手術期的監(jiān)測等方面有證可循。從初步試驗結果可以看出，通過監(jiān)測個體化的他克莫司血藥濃度、血常規(guī)及外周血T細胞亞群的變化, 可以幫助臨床更合理、更安全地使用免疫抑制劑他克莫司。同時結合受者臨床表現，進行綜合分析，才能更加準確地了解子宮移植受者術后的免疫狀態(tài)。

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(本文編輯：劉群)

Monitoring of blood tacrolimus concentration and lymphocyte subsets in the first uterus transplant recipient in China and its clinical significance

LIRuia,YANGLiua,LIJin-jiea,CHANGLianga,YANGJinga,SUMing-quana,CHENBi-liangb,MAYue-yuna,HAOXiao-kea

(a.InstituteforClinicalLaboratoryMedicineofPLA,b.DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospitalAffilicatedtotheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,Shaanxi,China)

Objective To investigate the changes of peripheral blood tacrolimus concentration and lymphocyte subsets in the uterus transplant recipient, and provide the evidence for monitoring the immune status after uterus transplantation. Methods The peripheral blood tacrolimus concentrations of the uterus transplant recipient during 1 year after transplantation were measured with the microparticle enzyme immunoassay (MEIA). Meanwhile, the whole blood cell counts and lymphocyte subsets were determined by the blood analyzer and flow cytometer, respectively. Results The blood tacrolimus concentrations of the uterus transplant recipient in the first month and second month after transplantation were (13.51±3.92) ng/mL and (15.58±1.19) ng/mL, respectively. The lymphocyte absolute counts were normal before transplantation. At the fifth day after transplantation, the counts of CD3+T lymphocytes, CD4+T lymphocytes, CD8+T lymphocytes and NK cells and the ratio of CD4/CD8 were significantly decreased. One week after transplantation, the counts of CD4+T lymphocytes were recovered to the normal range and maintained, but its recovery was slower than that of CD8+T lymphocytes. The ratio of CD4/CD8 ranged from 0.4 to 0.8 during 10 days after transplantation, and increased and maintained between 0.8 and 1.1 after that. The counts of NK cells increased gradually from the 10th day after transplantation, but still did not recover to the level before transplantation even at the 20th day after transplantation. However, the counts and percentages of B lymphocytes did not decrease but increased at the fifth day after transplantation, and recovered to normal gradually from the 10th day after transplantation. There was no significant correlation between the CD3+T lymphocyte count and blood tacrolimus concentration. Conclusion The dynamic changes of blood lymphocyte subsets and tacrolimus concentration exist in the uterus transplant recipient, which need to be further verified by a large amount of clinical data.

uterus transplantation; tacrolimus; lymphocyte subsets

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.14

李蕊，1988年生，女，碩士，技師，主要研究方向為臨床實驗診斷、前列腺癌發(fā)病研究。

郝曉柯，教授，博士，E-mail：haoxkg@fmmu.edu.cn。

R446.5

A

2016-10-30)