秦麗 竇永起 李敏 王毓國
·論著·
益氣活血中藥黃芪-丹參對(duì)脂多糖致急性肺損傷大鼠防治作用的機(jī)制研究
秦麗 竇永起 李敏 王毓國
目的 觀察益氣活血中藥黃芪-丹參對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)致急性肺損傷(acute lung injury, ALI)大鼠TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的影響。方法 SD雄性大鼠40只,隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組、益氣活血中藥組,各組10只;除正常對(duì)照組氣管內(nèi)滴注生理鹽水,其余各組滴注LPS(5 mg/kg)制備ALI模型;造模前后各3天干預(yù)組予以2 mL相應(yīng)藥物(益氣活血中藥0.59 g/mL或地塞米松5 mg/kg),其余組予以等量的生理鹽水灌胃;于末次灌胃給藥2小時(shí)后處死大鼠,免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肺組織中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR-4)、白介素1受體相關(guān)激酶1(interleukin-1 receptor-associated kinase-1,IRAK-1)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)蛋白表達(dá)的含量,qPCR測定肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA表達(dá)量。結(jié)果 LPS造模組大鼠肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均高于正常對(duì)照組(P<0.01),且模型對(duì)照組高于地塞米松組和中藥組(P<0.01);中藥組TLR-4、IRAK-1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)量與地塞米松組無明顯差異(P>0.05),而NF-κB mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)量高于地塞米松組(P<0.05)。結(jié)論 益氣活血中藥黃芪-丹參對(duì)LPS致ALI大鼠的防治作用可能與其下調(diào)TLR-4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。
益氣活血中藥; 脂多糖; 急性肺損傷; Toll樣受體4; 白介素1受體相關(guān)激酶; 核轉(zhuǎn)錄因子κB
急性肺損傷(acute lung injury, ALI)以肺泡-毛細(xì)血管膜損傷和滲透性增加、中性粒細(xì)胞浸潤、肺組織水腫以及失控的氧化應(yīng)激和炎癥過程為特征[1-3]。急性呼吸窘迫綜合征是ALI的嚴(yán)重階段,臨床表現(xiàn)為急性肺水腫、頑固性低氧血癥和進(jìn)行性呼吸窘迫,為常見的急危重癥[4-5]。Toll樣受體4(Toll-like receptors 4, TLR-4)是一種橫跨膜蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)錄分子,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)進(jìn)入肺內(nèi)激活TLR-4后,募集MyD88(molecule myeloid differentiation primary response gene 88) 蛋白分子,隨之導(dǎo)致白介素1受體相關(guān)激酶 (interleukin-1 receptor-sociated kinase,IRAK-1)活化,最終通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)[6-7]?;罨腘F-κB引發(fā)多種炎癥因子合成并釋放,包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)及白介素6(interleukin-6,IL-6)等,進(jìn)而導(dǎo)致肺組織的彌漫性炎癥損傷[8-9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[10]益氣活血中藥能改善ALI患者肺循環(huán)高凝狀態(tài),降低血液黏度,顯著減輕炎性反應(yīng),對(duì)肺有較好的保護(hù)作用,療效確切;且前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明[11]益氣活血中藥黃芪-丹參能夠減少LPS致ALI大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白濃度及肺組織中炎癥因子的含量,并減輕肺水腫和肺組織的病理損傷,起到防治急性肺損傷的作用?;谖墨I(xiàn)調(diào)研和以上結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究黃芪-丹參防治ALI作用機(jī)制是否通過調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。通過氣管內(nèi)滴注LPS溶液制備大鼠ALI模型,觀察益氣活血中藥黃芪-丹參對(duì)大鼠肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)的影響,探討益氣活血法防治ALI的分子機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用兩月齡健康清潔級(jí)SD雄性大鼠40只,體質(zhì)量為(200±20)g,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SCXK(軍):2012-0004。大鼠在清潔動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn),期間自由攝食、飲水,室溫18~24℃,相對(duì)濕度40%~70%,每天12小時(shí)光照維持,晝夜循環(huán)。
1.2 主要試劑
LPS,Sigma公司,批號(hào)L2880;戊巴比妥鈉,Germany公司,批號(hào)K2208;Rabbit Anti-TLR-4(批號(hào):bs-1021R)、Rabbit Anti-IRAK-1(批號(hào):bs-3194R)、Rabbit Anti-NF-κB/p65(批號(hào):bs-20160R)、免疫組化試劑盒(批號(hào):sp-0023)均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,DAB顯色試劑盒(中杉金橋,ZLI-9017);RNApure超純總RNA提取試劑盒(批號(hào):70621562)、M-MLV Ⅲ First-Strand cDNA Synthesis Kit(批號(hào):656666BB)、Green qPCR Master Mix(批號(hào):706084XX)均購自博邁德生物有限公司。大鼠TLR-4、IRAK-1、NF-κB 及內(nèi)參GAPDH引物由 Primer Express 設(shè)計(jì)合成,序列見表1。
1.3 主要儀器
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE53CS,上海亞榮生化儀器廠);切片機(jī)(萊卡2016, 上海萊卡儀器有限公司); 包埋機(jī)(湖北孝感亞鵬儀器廠);臺(tái)式冷凍離心機(jī)(1-15K,SIGMA);電熱恒溫箱(DHG-9240A,北京陸??萍加邢薰?;OLYMPUS BX60顯微鏡成像系統(tǒng),Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器(SteponeTM 272006169型,美國Applied Biosystem公司)。
表1 引物序列
1.4 藥物及制備
益氣活血中藥由生黃芪和丹參組成,兩者用量比例為2∶1,生藥材由解放軍總醫(yī)院中藥房采購及鑒定,經(jīng)過浸泡、煎煮和過濾后,在恒溫水浴鍋(60℃)中濃縮成含生藥0.59 g/mL的藥液,按大鼠與人體體表面積換算公式計(jì)算[12]。
1.5 動(dòng)物分組及處理方式
SD雄性大鼠40只,隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組、益氣活血中藥組,各組10只。中藥組大鼠在造模前3天每天予以益氣活血中藥2 mL灌胃(1次/天,含生藥量0.59 g/mL),其余組大鼠每天予以同體積的生理鹽水。造模成功后,中藥組每天予以益氣活血中藥2 mL(0.59 g/mL)灌胃,地塞米松組大鼠每天予以2 mL地塞米松(5 mg/kg)溶液灌胃,正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠每天予以生理鹽水2 mL灌胃,1次/天,連續(xù)給藥3天。
1.6 大鼠ALI模型制備
采用LPS暴露式氣管滴注方法制備ALI模型[13]。除正常對(duì)照組外,其余各組均給予氣管內(nèi)滴注LPS(5 mg/kg)溶液。大鼠用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉,固定大鼠仰臥位,無菌操作正中切開頸部組織,使氣管暴露,用1 mL注射器由氣管向肺方向滴注LPS溶液,而后將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)并左右搖晃,使LPS溶液在肺內(nèi)均勻分布,從而建立內(nèi)毒素性急性肺損傷大鼠模型。正常對(duì)照組大鼠按上述方法向氣管滴入同等量的生理鹽水。
1.7 標(biāo)本取材
所有大鼠在造模灌胃后第3天麻醉稱重,腹主動(dòng)脈放血處死后剪開胸部皮膚,暴露胸腔;取大鼠左葉組織裝入凍存管后迅速放入盛有液氮的器皿中,緩沖10分鐘后放入-80℃保存?zhèn)溆?;取大鼠右肺下葉組織,放入裝有4%多聚甲醛溶液的西林瓶中固定48小時(shí)。
1.8 檢測指標(biāo)
1.8.1 大鼠肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)的檢測 按說明書用SABC免疫組織化學(xué)法檢測肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白的表達(dá)。400倍光鏡下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,光亮度設(shè)定一致,用OLYMPUS BX60顯微鏡采集圖像,Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析,測定每個(gè)肺組織的陽性顆粒的積分光密度(IOD),以均值作為該樣本TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量,IOD值越高,說明其蛋白表達(dá)越多。
1.8.2 大鼠肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA表達(dá)量的測定 稱取-80℃凍存的左肺100 mg組織放到均漿器中,加入1 mL裂解液后在冰上充分碾磨,按試劑盒說明書步驟提取總RNA,測定樣品260 nm、280 nm吸光度值(A),A260/A280在1.8~2.0,表明所提取的總RNA可用。取1 μg RNA,加入Oligo(dT)20(0.5 μL-1)1 μL、5×RTMix 5 μL、M-MLⅧ 1 μL組成逆轉(zhuǎn)錄體系,合成cDNA第一鏈。然后使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,Green qPCR Master Mix 25 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、cDNA 2 μL和RNase-Free H2O組成50 μL反應(yīng)體系,每個(gè)樣品平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用Comparative Delta-delta CT法,以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參,對(duì)各樣本TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析,計(jì)算RQ值(2-△△Ct)。
1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
2.1 大鼠肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)
TLR-4蛋白主要分布于肺組織的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中,陽性著色為棕黃色,見圖1。IRAK-1蛋白主要表達(dá)于肺組織的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),陽性著色為棕褐色顆粒,見圖2。NF-κB蛋白主要分布于肺組織的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上,陽性著色為棕黃色顆粒狀,見圖3。與正常對(duì)照組比較,LPS造模各組陽性信號(hào)(棕色或棕褐色)明顯增多,TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)IOD值均升高(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,地塞米松組和中藥組陽性信號(hào)減少,TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)均降低(P<0.01);中藥組NF-κB蛋白表達(dá)IOD值高于地塞米松組(P<0.05),TLR-4、IRAK-1表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。詳見表2。
表2 各組大鼠肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB蛋白表達(dá)(IOD)
注: 與正常對(duì)照組比較,aP<0.01;與模型對(duì)照組比較,bP<0.01;與地塞米松組比較,cP<0.05。
注:A:正常對(duì)照組;B:模型對(duì)照組;C:地塞米松組;D:益氣活血中藥組
注:A:正常對(duì)照組;B:模型對(duì)照組;C:地塞米松組;D:益氣活血中藥組
注:A:正常對(duì)照組;B:模型對(duì)照組;C:地塞米松組;D:益氣活血中藥組
2.2 大鼠肺組織TLR-4、IRAK-1、NF-κB的mRNA表達(dá)量
與正常對(duì)照組比較,LPS造模各組TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.01);與模型對(duì)照組比較,地塞米松組和中藥組TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)均減少(P<0.01);中藥組TLR-4、IRAK-1 mRNA表達(dá)與地塞米松組無明顯差異(P>0.05), 而NF-κB mRNA高于地塞米松組(P<0.05)。見表3。
表3 各組大鼠肺組織中TLR-4 、IRAK-1、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量RQ值
注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.01;與模型對(duì)照組比較,bP<0.01;與地塞米松組比較,cP<0.05。
Toll樣受體家族是高度保守的模式識(shí)別受體之一,被視為先天性免疫與獲得性免疫應(yīng)答的“橋梁”,能夠識(shí)別各種病原相關(guān)分子模式,如TLR-4能夠識(shí)別特異性識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分LPS[14-15]。LPS屬于細(xì)菌內(nèi)毒素的一種,能夠引起肺部的急性炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[16]。氣管內(nèi)滴入LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素型ALI動(dòng)物模型方法已經(jīng)廣泛運(yùn)用于ALI發(fā)病機(jī)理和藥物防治的研究[17]。
許多研究表明ALI的發(fā)生發(fā)展與TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的活化密切相關(guān),藥物干預(yù)下調(diào)此信號(hào)通路能夠起到防治ALI的作用[9,18]。TLR-4是一種跨膜受體蛋白,位于細(xì)胞膜外的結(jié)構(gòu)域能夠識(shí)別各種病原體,位于細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)則參與信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。NF-κB是信號(hào)通路中重要的下游分子,具有強(qiáng)大的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,能夠啟動(dòng)多個(gè)炎癥性基因的表達(dá),導(dǎo)致多種炎癥因子如TNF-α、IL-1、IL-10的合成和釋放,從而導(dǎo)致失控的炎癥反應(yīng)過程[20]。IRAK-1作為信號(hào)通路過程中的重要轉(zhuǎn)接點(diǎn),屬于白介素1受體相關(guān)激酶IRAK家族中的一員,具有激酶活性并可發(fā)生自身磷酸化,導(dǎo)致信號(hào)通路的向下傳遞。
本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞膜受體TLR-4、胞內(nèi)分子IRAK-1及細(xì)胞核受體NF-κB上研究益氣活血中藥對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI大鼠的影響。研究結(jié)果顯示,氣管內(nèi)滴入LPS造模后,肺組織中TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA表達(dá)量均增加,相應(yīng)的蛋白合成亦增多,表明LPS刺激了肺組織TLR-4/NF-κB信號(hào)通路的活化。而在益氣活血中藥組中,TLR-4、IRAK-1、NF-κB mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均下調(diào),說明了前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中益氣活血中藥防治LPS誘導(dǎo)ALI大鼠的分子機(jī)制,黃芪丹參合用可抑制TLR-4/NF-κB信號(hào)通路,從而減少炎癥因子的合成,緩解肺部的炎癥反應(yīng)和病理損傷。但ALI的發(fā)生是有多種機(jī)制參與,中藥的作用也涉及多個(gè)方面,故關(guān)于益氣活血中藥防治ALI的其他作用機(jī)制可進(jìn)一步研究。
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(本文編輯: 禹佳)
Study the mechanism of supplementingqiand activating blood herbs on Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats
QINLi,DOUYongqi,LIMin,etal.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China
Correspondingauthor:LIMin,E-mail:kittenlee1115@126.com
Objective To investigate the effects of supplementingqiand activating blood herbs astragalus membranaceus and salvia miltiorrhiza on TLR-4/NF-kappa B signaling pathway in rats with acute lung injury induced by lipopolysaccharide. Methods Forty healthy male SD rats were randomly divided into normal control group, model control group, dexamethasone group, herb group, ten in each group. ALI models were established by intratracheal instillation of LPS (5 mg/kg),while normal control group was instilled normal saline. 3 days before and after making the model,the drug(0.59 g/mL herbs or dexamethasone for 5 mg/kg)or same amount of normal saline was given in each group by gavage. Rats were sacrificed after 2h of the last administration. Then the protein and mRNA expressions of TLR-4, Interleukin-1 receptor-associated kinase-1 and NF-kappa B were measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction and immunohistochemistry respectively.Results Compared with normal control group, the protein and mRNA expressions of LPS groups was higher (P<0.01); compared with model control group, dexamethasone group and herbs group was decreased(P<0.01); the expression levels of TLR-4, IRAK-1 in herb group were close to dexamethasone group (P>0.05),but the level of NF-κB was higher in herb group (P<0.05) . Conclusion The protective and therapeutic effects of astragalus membranaceus and salvia miltiorrhiza on LPS-induced ALI in rats maybe due to its ability to modulate TLR-4/ NF-κB signaling pathways.
Supplementingqiand activating blood herbs; Lipopolysaccharide; Acute lung injury; TLR-4; IRAK-1; NF-κB
國家自然科學(xué)基金(81303131)
100853 北京,中國人民解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科[秦麗(碩士研究生)、竇永起、李敏、王毓國]
秦麗(1990- ),女,2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向:中西醫(yī)結(jié)合臨床。E-mail:qinlizi301@163.com
李敏(1980- ),博士,主治醫(yī)師。研究方向:中西醫(yī)結(jié)合臨床。E-mail:kittenlee1115@126.com
R285.5
A
10.3969/j.issn.1674-1749.2017.01.001
2016-06-11)