北方四省區(qū)番茄褪綠病毒的分子鑒定

王翠琳, 馮 佳, 孫曉輝, 王少立, 趙 靜, 劉金亮, 竺曉平*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 泰安 271018; 2. 濰坊科技學(xué)院蔬菜研究所,壽光 262700; 3. 吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物科學(xué)學(xué)院, 長春 130062)

北方四省區(qū)番茄褪綠病毒的分子鑒定

王翠琳1, 馮 佳1, 孫曉輝1, 王少立1, 趙 靜2, 劉金亮3, 竺曉平1*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 泰安 271018; 2. 濰坊科技學(xué)院蔬菜研究所,壽光 262700; 3. 吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部植物科學(xué)學(xué)院, 長春 130062)

2015-2016年間,在山西省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧省、吉林省采集到疑似感染番茄褪綠病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)的番茄植株。利用擴(kuò)增ToCV外殼蛋白(coat protein,CP)和類熱激蛋白(heat shock protein 70 homolog,HSP70h)基因片段的兩對(duì)特異性引物,通過RT-PCR對(duì)疑似樣品進(jìn)行分子檢測,得到970 bp和1 864 bp的特異條帶,經(jīng)測序、比對(duì)確定為ToCV。序列分析表明,山西晉中分離物SXJZ (KX853540)的CP核苷酸序列與河南安陽分離物HNAYHX (KP264983)相似性為99.7%,內(nèi)蒙古呼和浩特分離物NMHHHT (KU204709)和遼寧大連分離物L(fēng)NDL (KU204707)的CP核苷酸序列與國內(nèi)已報(bào)道的山東壽光分離物SDSG (KC709510)相似性分別為99.5%和99.7%,吉林長春分離物JLCC (KU306111)的CP核苷酸序列與山東聊城分離物SDLC (KC812622)的相似性為99.8%。而HSP70h核苷酸序列的相似性分析表明,山西晉中分離物SXJZ (KX853539)與日本分離物Tochigi (AB513442)相似性為99.4%,內(nèi)蒙古呼和浩特分離物NMHHHT (KU204710)、遼寧大連分離物L(fēng)NDL (KU204708)和吉林長春分離物JLCC (KX880384)與山東壽光分離物SDSG (KC709510)相似性分別為99.7%、99.8%和99.7%。試驗(yàn)結(jié)果明確了番茄褪綠病毒已蔓延傳播到我國山西、內(nèi)蒙古及東北地區(qū)。

番茄褪綠病毒;CP;HSP70h; RT-PCR

番茄褪綠病毒Tomatochlorosisvirus(ToCV)屬于長線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus,基因組包含兩條正義單鏈RNA。ToCV通過粉虱以半持久方式傳毒,不能通過汁液摩擦傳毒。ToCV能夠侵染的寄主主要為茄科Solanaceae、夾竹桃科Apocynaceae、番杏科Aizoaceae、菊科Asteraceae、藜科Chenopodiaceae、藍(lán)雪科Plumbaginaceae等科的作物和雜草[1],其中,番茄是其最重要的寄主,感染ToCV的番茄植株,葉片表現(xiàn)為脈間褪綠變黃、葉脈深綠,隨后葉片變厚、變脆且易折,嚴(yán)重時(shí)整株死亡。該病毒于1998年在美國的佛羅里達(dá)州首次被報(bào)道[2],隨后在意大利、以色列、法國、墨西哥、古巴、巴西、土耳其、日本及蘇丹等國家相繼被發(fā)現(xiàn)[3-10]。在我國,最早于2004年在臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn),于2013年后在北京、江蘇、山東、河北、天津、河南等地區(qū)陸續(xù)有關(guān)于ToCV的報(bào)道[11-19]。

近年來,由于工廠化種苗調(diào)運(yùn)和交流頻繁,設(shè)施中煙粉虱發(fā)生嚴(yán)重,北京、江蘇、山東、山西、陜西、浙江及內(nèi)蒙古地區(qū)設(shè)施栽培中均檢測到了粉虱攜帶ToCV,且粉虱帶毒率逐年增加[12-13,20],促進(jìn)了ToCV在全國范圍內(nèi)蔓延發(fā)展,局部地區(qū)已經(jīng)暴發(fā)流行,給番茄產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重威脅[14,21-22]。雖然在山西、內(nèi)蒙古等地檢測到粉虱攜帶ToCV,但目前ToCV在山西、內(nèi)蒙古以及東北地區(qū)番茄寄主上的發(fā)生情況尚不明確,因此,本研究針對(duì)山西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林四省、區(qū)番茄種植區(qū)采集到的疑似ToCV癥狀的番茄樣品,進(jìn)行分子檢測和鑒定,并將上述地區(qū)ToCV分離物與國內(nèi)外ToCV分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,分析其親緣關(guān)系,以明確ToCV在上述地區(qū)的發(fā)生情況,為其發(fā)生、危害提供預(yù)警和防治措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

2015年7月在內(nèi)蒙古、遼寧和吉林三省區(qū)番茄種植區(qū)采集到疑似感染ToCV的番茄樣本共79份,其中在內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市采集到1份,遼寧省錦州市、大連市、燈塔市分別采集13、10、14份,吉林省長春市、松原市分別采集28、13份。2016年8月在山西、內(nèi)蒙古地區(qū)番茄種植區(qū)采集到疑似感染ToCV番茄樣本44份,其中在內(nèi)蒙古呼和浩特市采集3份、赤峰市12份,山西省晉中市29份。將采集到的樣品凍于-80℃冰箱中保存,以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.1.2 菌株和載體

Escherichiacoli菌株(DH5α)由本實(shí)驗(yàn)室保存;PMD18-T克隆載體購于寶生物工程(TaKaRa)有限公司。

1.1.3 生化和分子生物學(xué)試劑

RNA提取試劑TransZol、TaqDNA聚合酶、dNTPs、分子量標(biāo)準(zhǔn)Trans2K Plus DNA Marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;凝膠回收試劑盒購于天根生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑RNase M-MLV(RNase H-)、RNase Inhibitor購于寶生物工程(TaKaRa)有限公司,其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國內(nèi)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉片總RNA的提取及病毒基因擴(kuò)增

稱取寄主植物葉片0.1 g,加液氮研磨至粉末,按照TransZol法提取葉片總RNA,用于cDNA的合成。反轉(zhuǎn)錄體系:模板RNA 3.0 μL,下游引物1.0 μL,RNase-free dH2O 2.0 μL,70℃變性10 min,迅速放于冰上2 min,再加入下列試劑:5×M-MLV buffer 2.0 μL,dNTPs mixture (10 mmol/L) 0.5 μL,RTase M-MLV (RNase H-) (200 U/μL) 0.5 μL,RNase inhibitor (40 U/μL) 0.25 μL,RNase free dH2O 0.75 μL,總體積為10 μL。42℃保溫60 min,再70℃保溫15 min。病毒檢測采用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的ToCV特異性引物ToCV-CP-F(5′-CCTCAAAGAGCTAAACTGGAC-3′)/ToCV-CP-R(5′-CACATCACCGGAACCCAAAGTCAC-3′) (擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)RNA2的4 241～5 210 nt,包含了長度為774 bp的ToCV完整CP及其上下游一段序列)和To-HSP-F(5′-GTCGACAATAATTAGCGGTCC-3′)/To-HSP-R(5′-TTATTACTAATGGGCCGGACTC-3′) (擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)RNA2的637～2 500 nt,序列包含了長度為1 665 bp的ToCV完整HSP70h及其上下游一段序列)。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s,退火(ToCV-CP-F/ToCV-CP-R 52℃,ToCV-HSP-F/ToCV-HSP-R 53℃)30 s,延伸72℃(ToCV-CP-F/ToCV-CP-R 1 min,ToCV-HSP-F/ToCV-HSP-R 1 min 40 s),共30個(gè)循環(huán);終延伸72℃ 10 min。

取20 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與2.5 μL 6×Loading buffer混合并于1%的瓊脂糖凝膠上檢測并拍照記錄。參照試劑盒說明回收目的條帶并與pMD18-T過夜連接,轉(zhuǎn)化DH5α,挑取單斑37℃過夜培養(yǎng),陽性克隆經(jīng)檢測后,交由上海鉑尚生物科技有限公司測序。

1.2.2 序列分析

利用NCBI中BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對(duì)所得分離物的擴(kuò)增序列進(jìn)行分析比對(duì),分別選取NCBI上已發(fā)表的ToCV代表性分離物的CP和HSP70h序列,對(duì)所選定的序列利用DNAStar中的MegAlign軟件進(jìn)行同源性比對(duì),利用軟件Mega 5.05 的Clustal W法進(jìn)行多序列比對(duì)分析以及鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,系統(tǒng)進(jìn)化樹中各分支置信度(bootstrap)進(jìn)行1 000次重復(fù)分析。所選用的序列信息見表1。

表1 用于序列比較和進(jìn)化分析的病毒序列信息

Table 1 Sequences information of virus used for sequence

comparison and phylogenetic analysis

登錄號(hào)Accessionnumber分離物名稱Isolate分離地點(diǎn)LocationDQ136146(CP&HSP70h)AT80/99西班牙FJ542305(CP&HSP70h)TiCV-SP5131西班牙JQ952601(CP&HSP70h)ToC-Br2巴西KP137101(CP&HSP70h)JJ韓國KC709510(CP&HSP70h)SDSG中國KJ815045(CP&HSP70h)Nanjing中國AB513443(CP)Tochigi日本AY903448(CP)Florida美國DQ234673(CP)IS以色列EU625350(CP)Fr法國HG380090(CP)To-Il2010希臘KC311375(CP)BJ中國KC812622(CP)SDLC中國KP217199(CP)HBLF中國KP264983(CP)HNAYHX中國KU204707(CP)LNDL中國KU204709(CP)NMHHHT中國KU306111(CP)JLCC中國KP246844(CP)Tianjin中國KR150986(CP)Zhengzhou中國KX853540(CP)SXJZ中國AB513442(HSP70h)Tochigi日本EU284744(HSP70h)Gr-535希臘KC812626(HSP70h)SDLC中國KC887999(HSP70h)ToCV-BJ中國KU204710(HSP70h)NMHHHT中國KU204708(HSP70h)LNDL中國KP217198(HSP70h)HBSJZ中國KP217202(HSP70h)HBLF中國KP264986(HSP70h)HNAYHX中國KP893120(HSP70h)Tianjin中國KX853539(HSP70h)SXJZ中國KX880384(HSP70h)JLCC中國NC_007341(HSP70h)Florida美國

2 結(jié)果與分析

2.1 ToCVCP和HSP70h基因的擴(kuò)增

2.1.1 ToCV分離物CP基因的擴(kuò)增

利用ToCV特異性引物ToCV-CP-F/ToCV-CP-R對(duì)采集的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,僅在山西省晉中市榆次區(qū)烏金山鎮(zhèn)南胡、內(nèi)蒙古呼和浩特市賽罕區(qū)、遼寧省大連市瓦房店元臺(tái)鎮(zhèn)、吉林省長春市蔬菜花卉研究所的4份樣品中擴(kuò)增得到大小約為970 bp的特異性條帶(圖1a),經(jīng)測序比對(duì),4條序列與NCBI上已登錄的ToCV序列相似性均達(dá)99%以上,確定了山西晉中分離物SXJZ (KX853540)、內(nèi)蒙古呼和浩特分離物NMHHHT (KU204709)、遼寧大連分離物L(fēng)NDL (KU204707)、吉林長春分離物JLCC (KU306111)為ToCV。

2.1.2 ToCV分離物HSP70h基因的擴(kuò)增

如上所述,對(duì)采集的山西、內(nèi)蒙古、遼寧和吉林的樣品進(jìn)一步用ToCVHSP70h特異性引物ToCV-HSP-F/ToCV-HSP-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到了大小約為1.8 kb(測序確定為1.864 kb)的特異性條帶(圖1b),經(jīng)測序比對(duì),進(jìn)一步確定了山西晉中分離物SXJZ (KX853539)、內(nèi)蒙古呼和浩特分離物NMHHHT (KU204710)、遼寧大連分離物L(fēng)NDL (KU204708)、吉林長春分離物JLCC (KX880384)為ToCV。

2.2 序列分析

將本試驗(yàn)得到的分離物序列與GenBank中登錄的其他代表地區(qū)性分離物以及同屬于毛形病毒屬的番茄侵染性褪綠病毒Tomatoinfectiouschlorosisvirus(TiCV)的CP和HSP70h核苷酸序列通過DNAStar中的MegAlign軟件進(jìn)行相似性比對(duì)。SXJZ、NMHHHT、LNDL、JLCC分離物的CP核苷酸序列與中國其他地區(qū)分離物、日本分離物Tochigi (AB513443)、美國分離物Florida (AY903448)相似性均在99%以上。SXJZ分離物的CP核苷酸序列與河南安陽分離物HNAYHX (KP264983)相似性最高,為99.7%；NMHHHT、LNDL分離物的CP核苷酸序列與山東壽光分離物SDSG (KC709510)相似性最高,達(dá)99.5%和99.7%；JLCC分離物的CP核苷酸序列與山東聊城分離物SDLC (GKC812622)相似性最高,為99.8%。4個(gè)分離物與同屬的TiCV (FJ542305)CP核苷酸序列相似性均低于50%。HSP70h核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表明,SXJZ分離物與日本分離物Tochigi (AB513442)相似性最高,為99.4%；NMHHHT、LNDL、JLCC分離物HSP70h核苷酸序列與山東壽光分離物SDSG (KC709510)相似性最高,分別為99.7%、99.8%和99.7%,與中國其他地區(qū)分離物相似性均為90%以上,而與TiCV(FJ542305)HSP70h核苷酸序列相似性在65%以下。

圖1 ToCV CP和HSP70h基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results with primers for CP and HSP70h of ToCV

為明確各地區(qū)分離物的進(jìn)化關(guān)系和分類地位,選取NCBI上已登錄的世界各地代表分離物的CP和HSP70h核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2)。由CP和HSP70h的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出SXJZ分離物、NMHHHT分離物、LNDL分離物、JLCC分離物與日本分離物、中國其他地區(qū)分離物同處于一個(gè)大的分支上,與日本及中國其他地區(qū)分離物親緣關(guān)系較近。

圖2 ToCV CP和HSP70h系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic relationships of ToCV CP and HSP70h

3 結(jié)論與討論

番茄是我國最重要的蔬菜之一,也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著種植面積的擴(kuò)大,病害種類也增多,病毒病已成為僅次于真菌病害的第二大病害[23],是影響番茄產(chǎn)量的重要限制因素。番茄褪綠病毒是近幾年發(fā)生的一種新傳入的病毒,該病毒引起的癥狀初期不明顯,難辨認(rèn),隨后出現(xiàn)的癥狀與營養(yǎng)素缺乏、物理損傷或者農(nóng)藥藥害相似[21],在病害調(diào)查中難以通過肉眼觀察判斷,需進(jìn)行更為準(zhǔn)確的分子生物學(xué)檢測、電子顯微鏡觀察或血清學(xué)方法確定其發(fā)生情況,故常延誤其最佳防治時(shí)期,這也一定程度上加重了該病害的發(fā)生、流行。除了侵染番茄,該病毒還能侵染甜椒、馬鈴薯、茄子等蔬菜[24-26]。溫室白粉虱、紋翅粉虱、Q型煙粉虱和B型煙粉虱都可以傳播ToCV。粉虱食性雜,在多種雜草作物上常見[27],在溫室栽培條件下可周年發(fā)生,粉虱一旦攜帶了ToCV,設(shè)施作物更易受到ToCV的侵染,極有可能導(dǎo)致ToCV大面積流行暴發(fā)[24]。在田間ToCV常與另一種由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病毒Tomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV)發(fā)生復(fù)合侵染[28],對(duì)番茄生產(chǎn)造成更嚴(yán)重的損失。

本研究利用ToCV的兩對(duì)特異性引物在山西晉中、內(nèi)蒙古呼和浩特、遼寧大連、吉林長春4個(gè)地區(qū)的番茄樣品上分別檢測出ToCV,通過序列一致性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,從四省、區(qū)獲得的4個(gè)分離物與中國山東、北京等地區(qū)分離物相似性最高,親緣關(guān)系最近,因此推測其傳播來源有關(guān)聯(lián)性,可能是由于地區(qū)間種苗調(diào)運(yùn)導(dǎo)致ToCV傳播。檢測鑒定結(jié)果表明ToCV已蔓延發(fā)展到我國的山西、內(nèi)蒙古及東北地區(qū)。山西省ToCV檢出率為3.45%,遼寧省檢出率為2.70%,吉林省檢出率為2.44%,內(nèi)蒙古地區(qū)兩年的檢出率為6.25%,四省、區(qū)番茄植株上ToCV的檢出率低,表明該病害在北方四省、區(qū)處于病害流行的始發(fā)階段,還未對(duì)番茄生產(chǎn)造成明顯損失,但該病害流行速度快,傳播范圍廣,潛在風(fēng)險(xiǎn)高,應(yīng)引起相關(guān)部門的重視。建議有關(guān)部門加強(qiáng)對(duì)地區(qū)間調(diào)運(yùn)種苗的檢測,積極采取防治措施,同時(shí)相關(guān)科研部門積極尋找抗病品種資源、研究防控措施,以防止該病害在山西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林四省、區(qū)大規(guī)模流行暴發(fā)。

[1] Wintermantel W M, Wisler G C. Vector specificity, host range, and genetic diversity ofTomatochlorosisvirus[J]. Plant Disease, 2006, 90(6): 814-819.

[2] Wisler G C, Li R H, Liu H Y, et al.Tomatochlorosisvirus: a new whitefly-transmitted, phloem-limited, bipartite closterovirus of tomato [J]. Phytopathology, 1998, 88(5): 402-409.

[3] Accotto G P, Vaira A M, Vecchiati M, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin Italy [J]. Plant Disease, 2001, 85(11): 1208.

[4] Segev L, Wintermantel W M, Polston J E, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin Israel [J]. Plant Disease, 2004, 88(10): 1160.

[5] Dalmon A, Bouyer S, Cailly M, et al. First report ofTomatochlorosisvirusandTomatoinfectiouschlorosisvirusin tomato crops in France [J]. Plant Disease, 2005, 89(11): 1243.

[6] Alvarez-Ruiz P, Jimenez C G, Leyva-López N E, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato crops in Sinaloa Mexico [J]. Plant Pathology, 2007, 56(6): 1043.

[7] Martínez-Zubiaur Y, Fiallo-Olivé E, Carrillo-Tripp J, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato in single and mixed infections withTomatoyellowleafcurlvirusin Cuba [J]. Plant Disease, 2008, 92(5): 836.

[8] Barbosa J C, Teixeira A P M, Moreira A G, et al. First report ofTomatochlorosisvirusinfecting tomato crops in Brazil [J]. Plant Disease, 2008, 92(12): 1709.

[9] ?evik B, Erkls G. First report ofTomatochlorosisvirusin Turkey [J]. Plant Pathology, 2008, 57(4): 767.

[10]Hirota T, Natsuaki T, Murai T, et al. Yellowing disease of tomato caused byTomatochlorosisvirusnewly recognized in Japan [J]. Journal of General Plant Pathology, 2010, 76(2): 168-171.

[11]Tsai W S, Shih S L, Green S K, et al. First report of the occurrence ofTomatochlorosisvirusandTomatoinfectiouschlorosisvirusin Taiwan[J]. Plant Disease, 2004, 88(3): 311.

[12]Zhao R, Wang R, Wang N, et al. First report ofTomatochlorosisvirusin China [J]. Plant Disease, 2013, 97(8): 1123.

[13]Karwitha M, Feng Zhike, Yao Min, et al. The complete nucleotide sequence of the RNA 1 of a Chinese isolate ofTomatochlorosisvirus[J]. Journal of Phytopathology, 2013, 162(6): 411-415.

[14]劉永光, 魏家鵬, 喬寧, 等. 番茄褪綠病毒在山東暴發(fā)及其防治措施[J]. 中國蔬菜, 2014(5): 67-69.

[15]Zhao Liming, Li Gang, Gao Ying, et al. Molecular detection and complete genome sequences ofTomatochlorosisvirusisolates from infectious outbreaks in China [J]. Journal of Phytopathology, 2014, 162(10): 627-634.

[16]孫國珍, 高利利, 陸文利, 等. 河北省設(shè)施番茄褪綠病毒分子檢測和鑒定研究[J]. 北方園藝, 2015(9): 95-98.

[17]高利利, 孫國珍, 王勇, 等. 天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測和鑒定[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 30(3): 211-215.

[18]馮佳, 孫曉輝, 高利利, 等. 番茄褪綠病毒RT-PCR檢測技術(shù)的優(yōu)化及河南分離物的分子鑒定[C]∥植物病理學(xué)研究進(jìn)展——中國植物病理學(xué)會(huì)第十二屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文選編. 2015: 111.

[19]胡京昂, 萬秀娟, 李自娟, 等. 河南番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 中國蔬菜, 2015 (12): 25-28.

[20]鄭慧新, 夏吉星, 周小毛, 等. 警惕煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病在我國快速擴(kuò)散[J]. 中國蔬菜, 2016(4): 22-26.

[21]周濤, 楊普云, 趙汝娜, 等. 警惕番茄褪綠病毒在我國的傳播和危害[J]. 植物保護(hù), 2014, 40(5): 196-199.

[22]趙黎明,李剛,劉永杰,等.侵染番茄的番茄褪綠病毒山東泰安分離物的分子鑒定和序列分析[J].植物保護(hù),2014,40(5):34-39.

[23]孫淑娥, 朱春暉, 張德詠. 番茄病毒病為害癥狀及防治方法[J]. 長江蔬菜, 2010(7): 32-34.

[24]趙汝娜, 王蓉, 師迎春, 等. 侵染甜椒的番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 植物保護(hù), 2014, 40(1): 128-130.

[25]Fortes I M, Jesus Navase-Castillo J. Potato, an experimental and natural host of the crinivirusTomatochlorosisvirus[J]. European Journal of Plant Pathology, 2012, 134(1): 81-86.

[26]周瑩, 黃金寶, 喬廣行, 等. 北京地區(qū)茄子感染番茄褪綠病毒的分子鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2016, 43(1): 168-172.

[27]De Barro P J, Liu S S, Boykin LM, et al.Bemisiatabaci: a statement of species status [J]. Annual Review of Entomology, 2011, 56: 1-19.

[28]趙黎明,李剛, 劉永光, 等. 番茄褪綠病毒與番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定[J]. 中國蔬菜, 2014(12): 15-20.

(責(zé)任編輯:楊明麗)

Molecular identification ofTomatochlorosisvirusfrom four provinces or autonomous region in northern China

Wang Cuilin1, Feng Jia1, Sun Xiaohui1, Wang Shaoli1, Zhao Jing2, Liu Jinliang3, Zhu Xiaoping1

(1.CollegeofPlantProtection,ShandongAgricultureUniversity,Tai’an271018,China;2.VegetableResearchInstituteofWeifangUniversityofScienceandTechnology,Shouguang262700,China;3.CollegeofPlantSciences,AgriculturalDivision,JilinUniversity,Changchun130062,China)

During 2015 and 2016, tomato plant samples with symptoms similar toTomatochlorosisvirus(ToCV) infection were collected from field in Shanxi, Liaoning, Jilin provinces and Inner Mongolia Autonomous Region. The specific primers for coat protein gene (CP)and heat shock protein 70 homolog (HSP70h) gene of ToCV were applied to perform RT-PCR detection. Two specific fragments with length of 970 bp and 1 864 bp respectively, were obtained and sequenced. BLAST results confirmed the presence of ToCV in these samples. The similarity analysis showed that the nucleotide sequence ofCPfrom the isolate SXJZ (KX853540) shared 99.7% sequence identity with reported isolate HNAYHX (KP264983, Anyang, Henan); the isolate NMHHHT (KU204709, Hohhot,Inner Mongolia)and LNDL (KU204707, Dalian, Liaoning) shared 99.5% and 99.7% sequence identity with reported isolate SDSG (KC709510, Shouguang, Shandong), respectively. And the nucleotide sequence ofCPof the isolate JLCC (KU306111, Changchun, Jilin) shared 99.8% sequence identity with isolate SDLC (KC812622, Liaocheng, Shandong). As forHSP70h, the nucleotide sequence ofHSP70hfrom the isolate SXJZ (KX853539, Jinzhong, Shanxi) shared 99.4% sequence identity with isolate Tochigi (AB513442, Japan). And the isolate NMHHHT (KU204710), isolate LNDL (KU204708)and isolate JLCC (KX880384) shared 99.7%, 99.8% and 99.7% nucleotide sequence identity with isolate SDSG (KC709510), respectively. These results confirmed that the ToCV has spreaded to the Shanxi, the Inner Mongolia and the northeast of China.

Tomatochlorosisvirus;CP;HSP70h; RT-PCR

2016-03-14

2016-09-29

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GNC111008)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2015CQ022)

S 432.412

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.024

* 通信作者 E-mail: zhuxp@sdau.edu.cn