一種防止培養(yǎng)基平板被污染和干燥的簡易方法

楊 平, 蒲相君, 時(shí)婷婷, 王忠文, 張君成

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧 530004)

一種防止培養(yǎng)基平板被污染和干燥的簡易方法

楊 平, 蒲相君, 時(shí)婷婷, 王忠文, 張君成*

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 南寧 530004)

在植物病原菌的常規(guī)培養(yǎng)中,經(jīng)常會(huì)遇到雜菌污染和培養(yǎng)基干燥的問題。本文介紹一種簡易而有效的解決方法,其要點(diǎn)是利用密封式普通塑料保鮮盒盛放培養(yǎng)基平板,再轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該方法特別適合需要長期培養(yǎng)的測(cè)試工作。除了平板培養(yǎng)外,該方法還可用于其他形式的培養(yǎng),以防止培養(yǎng)皿內(nèi)試驗(yàn)材料的水分散失和雜菌污染。

病原菌; 培養(yǎng); 污染; 水分散失

在植物病害試驗(yàn)研究和產(chǎn)品研發(fā)工作中,平板培養(yǎng)是一項(xiàng)最基本而常用的方法,其主要程序是,將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制備平板,植入病原菌后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平板培養(yǎng)的工作原理是培養(yǎng)皿蓋罩住皿底后,在培養(yǎng)皿內(nèi)形成一個(gè)無菌小空間,病原菌在此空間內(nèi)生長發(fā)育。當(dāng)前的制造技術(shù)幾乎無法保證皿底與皿蓋之間的蓋合達(dá)到無縫貼合,造成培養(yǎng)皿內(nèi)外容易交換空氣,實(shí)驗(yàn)室的螨蟲也可通暢無阻地進(jìn)入其中。因而,皿內(nèi)小空間的無菌狀態(tài)非常容易受皿外環(huán)境的干擾,而目前國內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)室的場(chǎng)地及裝備環(huán)境基本上屬于開放型,腐生微生物及螨蟲遍布室內(nèi),導(dǎo)致培養(yǎng)平板容易污染。文獻(xiàn)一般未提及該問題,但也有研究報(bào)道特別指出和強(qiáng)調(diào)污染對(duì)平板培養(yǎng)的影響[1]；另一方面,目前實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)箱多屬循環(huán)空氣式培養(yǎng)箱,運(yùn)行過程經(jīng)常需要加熱/制冷,導(dǎo)致箱內(nèi)工作室空氣相對(duì)濕度可低至40%以下,非常干燥,容易造成平板培養(yǎng)基的污染和干燥。降低污染率和延緩培養(yǎng)基失水,提高平板培養(yǎng)的質(zhì)量,是植物病原菌日常培養(yǎng)工作的基本要求。本試驗(yàn)利用保鮮密封盒這一簡易裝置達(dá)到了理想效果。

1 器具與方法

1.1 器具

主要器具為市面上常見的一種簡單的家用塑料保鮮密封盒,保鮮盒由盒主體和盒蓋構(gòu)成,盒主體上有4個(gè)扣突；盒蓋上有4個(gè)相應(yīng)的扣鉤以及卡槽與密封膠(圖1)。

1.2 操作方法

按常規(guī)的無菌操作方式,在超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成平板,并在平板上植入待培養(yǎng)的病原菌。

正置使用保鮮盒方法:將保鮮盒與潔凈的普通塑料袋置入超凈工作臺(tái)。在無菌條件下將已接菌的培養(yǎng)基平板先裝入塑料袋內(nèi),再放入保鮮盒,蓋上盒蓋,并將盒蓋的扣鉤緊扣于盒主體的扣突上(圖2)。

倒置使用保鮮盒方法:將保鮮盒放入超凈工作臺(tái),打開盒蓋并倒置于工作臺(tái)面上(蓋的內(nèi)面朝上),將已接菌的培養(yǎng)基平板放于盒蓋上,用保鮮盒主體罩住培養(yǎng)皿,并將盒主體的開口邊緣卡入盒蓋的卡槽內(nèi),將盒蓋的扣鉤壓扣于盒主體的扣突(圖3)。

將裝有培養(yǎng)基平板的保鮮盒從超凈工作臺(tái)轉(zhuǎn)到常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱,在需要的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

圖1 塑料保鮮盒的構(gòu)成與外觀Fig.1 Structure and appearance of plastic storage box

圖2 保鮮盒正置使用示意圖Fig.2 Diagram for using storage box in normal manner

2 應(yīng)用實(shí)例與結(jié)果

2.1 在螨蟲污染的培養(yǎng)箱中應(yīng)用

以空白PSA培養(yǎng)基平板作材料,按保鮮盒倒置使用方法將12皿分3個(gè)盒裝,4皿/盒。以常規(guī)紗布捆包式和膜封口式的培養(yǎng)方法作對(duì)照。紗布捆包法用一層普通紗布捆包培養(yǎng)平板4皿/包,共3包；膜封口法是將Parafilm(Pechiney plastic packaging)封口膜剪成條片,取條片將12皿培養(yǎng)平板逐個(gè)封口,然后4皿放成一疊,分3疊置于淺盤上。全部處理均在超凈工作臺(tái)上完成,并全轉(zhuǎn)到同一個(gè)因長期培養(yǎng)作業(yè)而存在螨蟲污染的培養(yǎng)箱(珠江牌LRH-150-HS培養(yǎng)箱),置于同一架層上,在溫度28℃并加濕條件下培養(yǎng)。

圖3 保鮮盒倒置使用示意圖Fig.3 Diagram for using storage box in inverted manner

培養(yǎng)結(jié)果顯示,紗布捆包法培養(yǎng)3 d后,12皿培養(yǎng)平板全被雜菌污染,并且留下明顯的螨蟲走動(dòng)軌跡(圖4a)。封口膜處理培養(yǎng)3 d后只有1皿被雜菌污染,6 d后突增到10皿污染,并同樣有明顯的螨蟲走動(dòng)軌跡(圖4c),仔細(xì)觀察發(fā)現(xiàn),封口膜有些地方出現(xiàn)了裂縫(圖4d)。而保鮮盒裝法培養(yǎng)9 d后(圖4b)僅有2皿污染(表1),且僅有個(gè)別雜菌小菌落,沒有明顯的螨蟲走動(dòng)軌跡。很明顯,保鮮盒裝載式的培養(yǎng)方法預(yù)防螨蟲為害污染的效果理想。

圖4 空白培養(yǎng)基平板以不同方法培養(yǎng)的結(jié)果Fig.4 Culture result on empty medium plate by different methods

培養(yǎng)時(shí)間/dCulturetime12皿平板的污染數(shù)量/皿No.ofdishwithcontaminationin12plates保鮮盒裝法Storagebox封口膜法Parafilm紗布捆包法Cheesecloth30112601012921112

2.2 不同方法培養(yǎng)稻曲病菌

在PSA平板上植入稻曲病菌后,采用保鮮盒正置使用方法處理12皿；用紗布捆包法處理12皿,一起轉(zhuǎn)到正?？諝庋h(huán)式培養(yǎng)箱(珠江牌LRH-250-G培養(yǎng)箱)內(nèi)同一架層上,在溫度為28℃及不加濕的條件下培養(yǎng)。

紗布捆包法培養(yǎng)5 d后觀察到雜菌污染和培養(yǎng)基細(xì)小干裂現(xiàn)象,10 d后出現(xiàn)較大的干裂裂縫(圖5a～b),15 d后大部分平板被污染并干裂。而保鮮盒裝法培養(yǎng)的,僅在15 d后出現(xiàn)1皿被污染(表2),且全部12皿平板沒有干裂的跡象。表明保鮮盒裝法培養(yǎng),能大幅降低污染率和防止培養(yǎng)基干燥。

圖5 培養(yǎng)稻曲病菌10 d后的菌落與平板Fig.5 Colony of Ustilaginoidea virens growing for 10 days and medium plate

培養(yǎng)時(shí)間/dCulturetime保鮮盒裝法培養(yǎng)12皿 12dishesgrownbystoragebox污染皿數(shù)/皿No.ofdishwithcontamination干裂皿數(shù)/皿No.ofdishwithcracking紗布捆包法培養(yǎng)12皿 12dishesgrownbycheesecloth污染皿數(shù)/皿No.ofdishwithcontamination干裂皿數(shù)/皿No.ofdishwithcracking5003410007915101012

2.3 長期培養(yǎng)稻曲病菌的效果

將稻曲病菌移入PSA平板,用保鮮盒正置使用方法,在循環(huán)空氣式培養(yǎng)箱(珠江牌LRH-250-G培養(yǎng)箱)連續(xù)培養(yǎng)90 d,12個(gè)重復(fù)。結(jié)果,除3皿出現(xiàn)污染外,其余完好,而且所有培養(yǎng)基平板仍表現(xiàn)厚實(shí)充潤,觀察不到干燥跡象(圖6)

3 討論

盡管平板培養(yǎng)的污染和培養(yǎng)基易干燥問題一直存在,但還未見有較好的應(yīng)對(duì)方法,目前主要的解決方法是利用Parafilm封口膜或其他膠膜將培養(yǎng)皿封口[2-5],該方法能有效地降低污染率并減少培養(yǎng)基水分散失。不過,目前實(shí)驗(yàn)室通常使用的Parafilm封口膜是長片成卷的膜產(chǎn)品,使用時(shí),需要先裁剪成適合粘貼的條片狀,然后取該條片狀的封口膜在培養(yǎng)皿的開口周緣表面逐個(gè)拉伸粘貼,操作相當(dāng)繁瑣,在培養(yǎng)量較大時(shí),封口程序工作效率低,實(shí)踐操作非常不便；而且,在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間后,封口膜容易出現(xiàn)開裂現(xiàn)象(圖4 d),而封口膜一旦開裂,其防蟲、防污染、防失水效能隨即下降,這是本文試驗(yàn)2.1使用封口膜封口而仍然出現(xiàn)污染率高的原因(表1)；雖然增加貼膜層數(shù)能減少開裂的可能,但也增加了工作的繁瑣性。

利用普通塑料保鮮盒裝載培養(yǎng)平板的方法雖然很簡單,但預(yù)防螨蟲干擾和雜菌污染,以及防止培養(yǎng)基干燥方面卻非常有效。其原因是保鮮盒蓋的卡槽上配備一圈密封膠(圖1),該密封膠使得盒蓋與盒主體扣緊后,盒內(nèi)外達(dá)到密不透氣的技術(shù)狀態(tài)。這種保鮮盒雖然已在國內(nèi)日常家庭生活中普遍使用,但其優(yōu)越的密封性一直沒有引起實(shí)驗(yàn)室的注意,也未見報(bào)道被實(shí)驗(yàn)室所利用。市面上的保鮮盒各式各樣,并非所有式樣的保鮮盒均具備可靠的密封性能,一個(gè)簡單的檢驗(yàn)方法是將保鮮盒進(jìn)行裝水檢漏,密封性能好的能滴水不漏。

圖6 保鮮盒法培養(yǎng)90 d后的稻曲病菌菌落與培養(yǎng)平板Fig.6 Colony of Ustilaginoidea virens growing for 90 daysand medium plate by using method of storage box

在超凈工作臺(tái)上開合保鮮盒,能使得盒內(nèi)空氣接近無菌狀態(tài),轉(zhuǎn)到培養(yǎng)箱后,盡管培養(yǎng)箱工作室內(nèi)空氣流動(dòng)屬于常態(tài),但保鮮盒內(nèi)的空氣卻相對(duì)靜止,密封膠也阻止盒內(nèi)外空氣的交換,從而保證盒內(nèi)培養(yǎng)平板處于一個(gè)相對(duì)潔凈并濕度恒定的局部小空間環(huán)境,直至培養(yǎng)作業(yè)結(jié)束,因而保鮮盒具有預(yù)防污染和水分散失的理想功效。

正置使用保鮮盒,從較狹窄的盒主體中放入/取出培養(yǎng)皿頗有難度,因而先將培養(yǎng)皿放入干凈的普通塑料袋內(nèi),然后拎著塑料袋, 再放入或取出就很方便(圖2),這里增加的塑料袋,還具有緩沖培養(yǎng)皿在保鮮盒內(nèi)松動(dòng)滑移的好處；所用塑料袋以新購的為宜、一次性使用。在倒置使用保鮮盒的情況下,盒主體以倒置的形式與盒蓋扣合,無需借助塑料袋,就能方便地取放培養(yǎng)皿。保鮮盒可反復(fù)使用,必要時(shí)可用清水沖洗晾干后備用,但不宜高溫滅菌,因高溫后密封膠容易喪失密封性能。

經(jīng)作者反復(fù)測(cè)試,結(jié)果均表明采用保鮮盒裝載法培養(yǎng)稻曲病菌,對(duì)稻曲病菌的生長發(fā)育并沒有不良的影響。不過,考慮到該方法利用的是保鮮盒的密封性；對(duì)通透性敏感的病原菌可能不適用該方法進(jìn)行日常培養(yǎng)；因此,實(shí)際使用時(shí),應(yīng)先行測(cè)試明確適用與否。

在植物病理學(xué)研究中,經(jīng)常需要進(jìn)行較長時(shí)間的培養(yǎng),如有關(guān)報(bào)道在分析溫度對(duì)蘋果炭疽葉枯病菌Glomerellacingulata子囊殼形成的影響測(cè)試中,觀察培養(yǎng)了29 d[6]；一些生長緩慢的病原真菌,如稻曲病菌Ustilaginoideavirens[7]、蘋果褐斑病菌Marssoninacoronaria[1]、花生褐斑病菌Cercosporaarachidicola[8]等,要獲得較大的菌落,往往也需要長時(shí)間的培養(yǎng),其中的雜菌污染和培養(yǎng)基失水問題非常突出,用保鮮盒裝載培養(yǎng)的方法對(duì)解決此問題特別有效,本文的試驗(yàn)2.3是個(gè)佐證。需要指出,培養(yǎng)中途的觀察,最好將裝載材料的保鮮盒轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái),并在工作狀態(tài)下打開保鮮盒取出材料觀察。

研究者在利用培養(yǎng)皿開展其他與植物病害有關(guān)的試驗(yàn),如線蟲的生物防治測(cè)試[9]、蘋果腐爛病菌Valsaceratosperma侵染性測(cè)試[10]、芹菜軟腐病Pectobacteriumcarotovorumsubsp．odoriferum的離體葉接種測(cè)試[11]、草坪禾草幣斑病菌Sclerotiniahomoeocarpa的離體葉接種測(cè)試[12]等時(shí)都強(qiáng)調(diào)使用Parafilm封口膜將培養(yǎng)皿封口,以預(yù)防污染和水分散失,這些有關(guān)試驗(yàn)值得試用本文報(bào)道的方法,尤其是在培養(yǎng)皿內(nèi)盛裝的是液體材料[9],或者是已經(jīng)接種病菌的寄主離體器官材料[12],需要保持培養(yǎng)皿平置狀態(tài),此時(shí)用Parafilm封口膜封口需要非常小心細(xì)致的操作,應(yīng)用本方法或許更為便捷,不過實(shí)際應(yīng)用時(shí)最好也先行測(cè)試本方法的適用性。

本文報(bào)道的方法除了能解決污染和失水問題外,所用的保鮮盒實(shí)際上屬于穩(wěn)固的裝載器具,明顯有利于材料的移動(dòng)操作,如將培養(yǎng)皿從工作臺(tái)轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱,或從培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移到結(jié)果檢測(cè)平臺(tái)等；也便于培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱中整齊多層疊放,充分利用培養(yǎng)箱內(nèi)作業(yè)空間。

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(責(zé)任編輯:楊明麗)

A simplified method to prevent contamination and drying of the medium plate

Yang Ping, Pu Xiangjun, Shi Tingting, Wang Zhongwen, Zhang Juncheng

(CollegeofAgriculture,GuangxiUniversity,Nanning530004,China)

Contamination of undesired microbe and drying of medium were often encountered in routine culture of plant pathogen. A simplified and effective method was introduced to resolve the problem. The main point of the method was that the medium plate was placed in a sealed common plastic storage box, and was then cultured in an incubator. The method is suitable especially for the culture operation which will take a long time. Apart from the plate culture, the method might also be used for culture in other forms to prevent moisture loss and contamination.

pathogen; culture; contamination; drying

2016-04-20

2016-05-29

廣西自然科學(xué)基金(2011GXNSFA018068);教育發(fā)展資金(創(chuàng)優(yōu))區(qū)雙創(chuàng)教育示范專業(yè)-植物保護(hù)(T3310098003)

Q 939.95

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.021

* 通信作者 E-mail: jczhang@gxu.edu.cn