辣椒輕斑駁病毒湖南分離物的全基因序列測定及結(jié)構(gòu)分析

劉湘寧, 戴良英, 李 魏, 董 錚, 唐前君

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙 410128; 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒研究所, 長沙 410128;3. 湖南省植物病蟲害生物學(xué)與防控重點實驗室, 長沙 410128)

辣椒輕斑駁病毒湖南分離物的全基因序列測定及結(jié)構(gòu)分析

劉湘寧1,3, 戴良英1,3, 李 魏1,3, 董 錚1,3, 唐前君1,2,3*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 長沙 410128; 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒研究所, 長沙 410128;3. 湖南省植物病蟲害生物學(xué)與防控重點實驗室, 長沙 410128)

采自湖南地區(qū)的辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)樣品經(jīng)單斑分離后,根據(jù)已經(jīng)報道的PMMoV序列基因保守區(qū)設(shè)計6對簡并引物,采用片段重疊法和RACE方法擴增、克隆獲得一個全長為6 356 bp的湖南分離物(PMMoV-HN1,登錄號:KP345899)全基因組序列,編碼4個蛋白,分別為126 kD蛋白(70～3 423 nt)、183 kD蛋白(70～4 908 nt)、28 kD蛋白(4 909～5 682 nt)和17.5 kD蛋白(5 685～6 158 nt),5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)和3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)分別含有69和198個堿基,其中5′-UTR存在一個序列為m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子結(jié)構(gòu)。一致性分析發(fā)現(xiàn)PMMoV-HN1與PMMoV其他分離物的核酸一致性為94%～99%,編碼的氨基酸一致性為94%～99%。全基因組序列系統(tǒng)進化分析表明PMMoV-HN1分離物與中國首次報道的PMMoV-CN分離物親緣關(guān)系最近。本研究是國內(nèi)報道的第二例PMMoV全基因組序列。

辣椒; 辣椒輕斑駁病毒; 全基因序列; 序列分析

辣椒輕斑駁病毒Peppermildmottlevirus(PMMoV)是煙草花葉病毒屬Tobamovirus成員,屬于正義單鏈RNA病毒,最早發(fā)現(xiàn)于美國,后來在西班牙、德國、澳大利亞、阿根廷、加拿大、英國、巴西等國家和地區(qū)均有相關(guān)報道,曾對英國、美國的辣椒種植造成毀滅性損失[1]。PMMoV主要侵染茄科辣椒屬植物,植株被侵染后表現(xiàn)斑駁或黃綠相間的花葉癥狀,果實被侵染后畸形、斑駁,可能出現(xiàn)凹凸斑點。PMMoV在辣椒上的種傳率高達22%～29%,是溫室和大棚辣椒病毒病害的重要毒源[2]。PMMoV可通過種子與染毒汁液摩擦傳毒,在植物病株殘體上可存活25年左右,昆蟲介體不易傳毒,帶毒種子、感病植株和帶病土壤是重要的侵染來源[3]。國內(nèi)于1994年首次在新疆辣椒上發(fā)現(xiàn)PMMoV[4]后,陜西、山東青島、北京及寧夏等地區(qū)相繼報道了該病毒[5-7]。2006年中國首次分離測定了PMMoV的全基因組序列,命名為PMMoV中國分離物(PMMoV-CN)[8]。2013年,鄭興華等對在貴州各辣椒主產(chǎn)區(qū)采集的200多份辣椒病樣進行血清學(xué)檢測,發(fā)現(xiàn)貴州地區(qū)PMMoV的檢出率僅次于黃瓜花葉病毒Cucumbermosaicvirus(CMV),達到22%～29%[9]。魯宇文等[10]首次在我國辣椒田間病毒病樣中檢測到辣椒斑駁病毒Peppermottlevirus(PepMoV)和PMMoV復(fù)合侵染。

湖南是我國重要的辣椒產(chǎn)地,主要栽培品種有‘興蔬215’、‘興蔬16號’、‘興蔬301’、‘興蔬嫩辣’、‘湘研15號’、‘湘研16號’、‘博辣嬌紅’、‘博辣紅?！?、‘博辣5號’、‘博辣6號’、‘博辣4號’、‘湘辣4號’、‘湘辣7號’等。近年來,辣椒病毒病在辣椒的種植和生產(chǎn)上的危害日益加重,嚴重影響了辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì),PMMoV是造成辣椒經(jīng)濟損失的重要病原之一,但目前有關(guān)PMMoV的研究非常有限,同時PMMoV對湖南辣椒的侵染鮮有報道。本研究在湖南辣椒病樣中檢測到PMMoV,采用片段重疊法和RACE方法對湖南辣椒上PMMoV-HN1分離物的全基因序列進行測定、序列結(jié)構(gòu)和一致性分析,同時發(fā)現(xiàn)PMMoV其他病毒屬病毒存在復(fù)合侵染現(xiàn)象,可為PMMoV的發(fā)生規(guī)律和該分離物后續(xù)的功能研究等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 辣椒樣本采集與保存

2013年6月隨機采取葉片皺縮、畸形、扭曲、斑駁、褪綠,葉片變小、萎蔫,莖稈褪綠,植株矮化等典型病毒病危害癥狀的辣椒樣品196份(具體辣椒品種和采集地點見表1)。經(jīng)RT-PCR檢測后測序確定為PMMoV侵染的辣椒樣品,在莧色藜上3次單斑分離純化,采集莧色藜單斑葉片保存于-80℃。

表1 樣本來源及數(shù)量

Table 1 Sample sources and numbers

品種Variety樣品/份Samplenumber采集地點Collectionsite品種Variety樣品/份Samplenumber采集地點Collectionsite興蔬21543長沙、衡陽博辣6號22長沙、衡陽湘研15號31長沙、衡陽博辣紅牛14株洲湘研16號24長沙興蔬16號10衡陽興蔬30117衡陽博辣5號12長沙興蔬嫩辣12長沙湘辣4號11衡陽

1.1.2 試劑

PMMoV病毒ELISA檢測試劑盒購自美國Agdia公司;植物總RNA提取試劑(easyPure Plant RNA Kit)、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成試劑盒、pEASY-TI Cloning Kit、TaqDNA聚合酶和其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自北京天根(Tiangen)生化科技有限公司;Smarter RACE 5′/3′ Kit Race試劑盒購自寶生物(TaKaRa)大連公司。

1.2 方法

1.2.1 病葉總RNA的提取及cDNA的合成

取樣品0.5 g置于研缽中,加液氮,充分研磨,按照easyPure Plant RNA Kit試劑盒說明書步驟提取植物總RNA,利用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix cDNA合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,-20℃保存。

1.2.2 辣椒樣品PMMoV鑒定

參照黃粵等[6]的方法和特異性檢測引物(CP基因,上游引物:ATTACTACCGCCGATGCTGAG;下游引物:TGGAGGAAAAACACTACGAG)對196份樣品進行RT-PCR檢測,獲得的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司測序,將測序結(jié)果在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行BLAST比對,確定鑒定結(jié)果。

1.2.3 PMMoV全基因的克隆、拼接

參照PMMoV-CN(登錄號:AY859497)基因全序列,使用Premier 6.0設(shè)計出6對引物(表2),引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成。采用片段重疊法克隆PMMoV湖南分離物基因組序列,根據(jù)RACE試劑盒說明書克隆獲得PMMoV的5′端與3′序列。

表2 克隆PMMoV湖南分離物基因組的引物序列

Table 2 Primers for cloning PMMoV isolate Hunan

擴增片段Segment引物名稱Primer引物序列Sequence(5'-3')引物位置Location片段長度/bpExpectedproductlengthP1P1-FCGGCGGTAAATTTTTCACAAT 1～211524P1-RAGCAGCAGTAATCTCATCC1527～1545P2P2-FCGCTTACTTACGCCAATG1310～13281570P2-RTCTGTTGATGTAAGGAGTCTG2878～2898P3P3-FGCGACCAAGGAGAATGTAA2740～2759809P3-RTGGTTACAGCATCATACTCA3549～3568P4P4-FCAGCAGACTCCTTACATCA3341～33601110P4-RCGGTAGCATAGAGGACAG4452～4470P5P5-FAAGGTTAGGCTTAGACGATT4290～43111695P5-RTCTCGGCAGTTGTAGGAT5989～6006P6P6-FGGAGTTCATCGAATCAGT5510～5528809P6-RTTCTATCTACCCGCGGTTC6320～6337

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與T1載體連接,轉(zhuǎn)入Trans1-TI感受態(tài)細胞后于含100 μg/mL氨芐青霉素的平板上培養(yǎng)過夜,菌液PCR篩選含重組質(zhì)粒的陽性克隆,并提取質(zhì)粒DNA送至上海生工生物工程有限公司測序。將測序結(jié)果在http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行BLAST,鑒定測序的結(jié)果。利用DNAstar軟件對上述6對引物擴增所得序列和RACE擴增序列進行拼接。

1.2.4 基因序列分析

采用ORF Finder(open reading frame finder)對所獲得的PMMoV全基因組序列進行基因組結(jié)構(gòu)分析,對PMMoV-HN1的全基因組序列進行BLAST檢索,找到17個PMMoV分離物的全基因序列與7種煙草花葉病毒屬病毒序列,使用DNAMAN 6.0分析25種分離物(含PMMoV-HN1)(表3)的全基因組序列一致性,利用MEGA 5.2 NJ法聚類分析法構(gòu)建25種分離物(含PMMoV-HN1)全基因組序列系統(tǒng)進化樹,使用1 000次重復(fù)的自展檢驗系統(tǒng)評價進化樹拓撲結(jié)構(gòu)的可靠性,其中,序列間進化距離根據(jù)Kimura-2參數(shù)遺傳距離模型計算[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒樣品PMMoV檢測

對湖南10個主栽品種196份樣品進行RT-PCR檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些辣椒主栽品種上PMMoV檢出率為9.1%～29.4%(PMMoV的檢出率見表4),檢測獲得PCR產(chǎn)物(CP基因)經(jīng)測序比對,其相似度為100%。

表3 本研究中涉及的病毒分離物

Table 3 Viral isolates involved in this study

GenBank登錄號GenBankaccessionno.病毒分離物Isolate來源SourceKP345899PMMoV-HN1中國湖南AB000709PMMoV-J日本AB069853PMMoV-C-1421日本M81413PMMoV-S西班牙AB113116PMMoV-Pa18日本AB113117PMMoV-TPO-2-19日本AY859497PMMoV-CN中國北京KR108207PMMoV-LS韓國KR108206PMMoV-RP韓國AB550911PMMoV-BR-DF01巴西KJ631123PMMoV-HP1印度KU311159PMMoV-PMMVOU2加拿大AB254821PMMoV-Iw日本LC082099PMMoV-P2韓國AB126003PMMoV-Kr韓國AB276030PMMoV-L4BV日本AJ308228PMMoV-Ia西班牙LC082100PMMoV-P3韓國D13438ObPV-Ob日本NC_001728ORSV韓國AB089381PaMMV-Japanese日本D38444TMV-Cg日本NC_001556TMGMV美國NC_002692ToMV-Queensland澳大利亞D63809TMV-Rakkyo日本

表4 湖南辣椒PMMoV檢出率

Table 4 PMMoV detection rate in Hunan

品種Variety樣品/份Samplenumber陽性樣品/份Positivenumber檢出率/%Detectionrate品種Variety樣品/份Samplenumber陽性樣品/份Positivenumber檢出率/%Detectionrate興蔬215431227.9博辣6號22313.6湘研15號31722.6博辣紅牛14321.4湘研16號24520.8興蔬16號10220.0興蔬30117529.4博辣5號12216.7興蔬嫩辣12216.7湘辣4號1119.1

2.2 PMMoV-HN1全基因組結(jié)構(gòu)分析

克隆、測序獲得了PMMoV-HN1(登錄號:KP345899)的全基因組序列全長6 356 bp,PMMoV-HN1的全基因組序列包含1 880個堿基A、1 777個堿基T、1 177個堿基C、1 521個堿基G,這4種堿基在PMMoV-HN1的全基因組中所占百分比依次分別為29.6%、28.0%、18.5%和23.9%。5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)和3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)分別含有69和198個堿基,其中5′-UTR存在一個序列為m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子結(jié)構(gòu),二級結(jié)構(gòu)顯示在該端形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖1)。PMMoV-HN1有4個開放閱讀框架,編碼4個蛋白,分別為126 kD蛋白(70～3 423 nt)、183 kD蛋白(70～4 908 nt)、28 kD蛋白(4 909～5 682 nt)和17.5 kD蛋白(5 685～6 158 nt),其中28 kD蛋白與17.5 kD蛋白由亞基因組RNA表達產(chǎn)生,亞基因組RNA無帽子結(jié)構(gòu)。第一個開放閱讀框編碼的蛋白與病毒復(fù)制相關(guān),閱讀框終止于琥珀密碼子UAG,同時第一個開放閱讀框與第二個開放閱讀框共同編碼一個與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白,第三個開放閱讀框編碼的蛋白與病毒移動有關(guān),第四個開放閱讀框編碼的蛋白為病毒衣殼蛋白。

圖1 PMMoV-HN1的二級結(jié)構(gòu)Fig.1 Possible secondary structure of PMMoV-HN1

2.3 不同來源的PMMoV分離物全基因組序列分析

通過DNAMAN 6.0分析18個不同來源的PMMoV分離物及7個煙草花葉病毒屬的病毒分離物的全序列基因組一致性,結(jié)果(表5)表明,PMMov-HN1與同屬異種病毒的一致性僅為46.5%～65.8%,序列差異性明顯;與17種PMMoV病毒分離物的一致性在94.2%～99.7%之間,其中,PMMoV-HN1與日本分離物PMMoV-J的一致性最高(99.7%),與中國分離物PMMoV-CN一致性為99.5%,與韓國分離物PMMoV-P3一致性最低(94.2%)。PMMov-HN1與17種PMMoV分離物的ORF區(qū)域氨基酸序列一致性比較結(jié)果顯示,其ORF1、ORF2的一致性在98.3%～99.9%,其中與PMMoV-J僅一個氨基酸不同;ORF3的一致性在96.9%～99.6%,ORF4病毒衣殼蛋白區(qū)域除了與PMMoV-Ia的一致性為96.8%外,與其他分離物的一致性均高于98%,其中PMMoV-J、PMMoV-C-1421、PMMoV-S、PMMoV-Pa18、PMMoV-TPO-2-19、PMMoV-CN、PMMoV-RP、PMMoV-BR-DF01、PMMoV-HP1、PMMoV-PMMVOU2、PMMoV-Iw、PMMoV-P2、PMMoV-Kr編碼的氨基酸序列相同。

2.4 系統(tǒng)進化樹分析

通過MEGA5.2軟件,采用NJ法構(gòu)建PMMoV進化分析樹顯示,PMMoV分成2個大的支系群體,PMMoV-Ia與PMMoV-P3進化成一個支系,其他PMMoV分離物進化成另外一個支系,在這一支系中PMMoV-HN1(KP345899)與PMMoV-CN(AY859497)親緣關(guān)系最近,在煙草花葉病毒屬成員中,PMMoV與TMV和ToMV親緣關(guān)系最近。

表5 PMMoV-HN1與其他來源的PMMoV分離物及同屬其他病毒的一致性分析1)

Table 5 Identity analysis of PMMoV-HN1 with other PMMoV isolates and tobamovirus isolates

病毒分離物Isolate基因組GenomeNT/%5'-非編碼區(qū)5'-UTRNT/%3'-非編碼區(qū)3'-UTRNT/%開放閱讀框1ORF1NT/%AA/%開放閱讀框2ORF2NT/%AA/%開放閱讀框3ORF3NT/%AA/%開放閱讀框4ORF4NT/%AA/%PMMoV-J99.799.510099.699.999.799.999.499.6100100PMMoV-C-142199.799.510099.699.899.799.899.499.6100100PMMoV-S99.699.510099.699.999.799.899.399.299.8100PMMoV-Pa1899.599.510099.599.699.699.799.499.699.8100PMMoV-TPO-2-1999.599.510099.499.699.599.799.499.699.8100PMMoV-CN99.599.510099.599.799.699.899.299.699.1100PMMoV-LS99.599.510099.499.599.599.599.398.899.599.3PMMoV-RP99.499.410099.399.199.499.399.299.699.5100PMMoV-BR-DF0199.399.510099.299.799.499.898.398.499.8100PMMoV-HP199.099.510098.999.499.199.598.998.498.7100PMMoV-PMMVOU298.397.310098.699.898.399.698.198.498.1100PMMoV-Iw97.397.498.597.299.497.299.397.898.097.6100PMMoV-P297.397.498.597.299.397.199.397.898.497.9100PMMoV-Kr97.397.498.597.199.397.199.297.698.098.1100PMMoV-L4BV97.297.498.597.299.597.299.497.698.497.298.7PMMoV-Ia94.497.498.594.498.494.198.394.796.994.596.8PMMoV-P394.296.910094.198.494.098.394.796.994.198.1ObPV-Ob58.157.373.562.665.164.267.861.359.166.670.0ORSV55.558.164.356.957.057.457.262.965.063.967.3PaMMV-Japanese57.850.568.162.464.760.268.062.663.766.270.7TMV-Cg55.162.967.156.958.558.363.148.959.552.547.1TMGMV61.454.566.661.961.864.265.263.161.065.470.0ToMV-Queensland65.863.466.168.874.470.476.963.761.467.573.9TMV-Rakkyo65.160.983.367.773.369.075.564.061.864.170.7

1) NT 表示核苷酸序列的一致性;AA 表示氨基酸序列的一致性。 NT indicates the identity of the nucleotide sequence; AA indicates the identity of the amino acid sequence.

圖2 不同來源的PMMoV分離物及同屬其他病毒的全基因組序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of whole-genome sequences of PMMoV isolate and other tobamovirus isolates

3 討論

PMMoV在辣椒葉片上呈現(xiàn)輕微的褪綠或者斑駁癥狀,其發(fā)病特征與煙草花葉病毒Tobaccomosaicvirus(TMV)和辣椒脈斑駁病毒Chilliveinalmottlevirus(ChiVMV)相似,但其癥狀嚴重程度隨季節(jié)及環(huán)境因素變化,難以通過癥狀特點對病毒進行鑒定。PMMoV侵染的相關(guān)報道主要集中在華北及華中地區(qū),最近新疆、貴州、東北、浙江等地[9-10,12-14]也相繼檢測出PMMoV,并提出了一些分子檢測方法。然而PMMoV對湖南辣椒的侵染鮮有報道。本研究于2013年從‘興蔬215’,‘興蔬301’,‘湘研15號’,‘湘研16號’,‘博辣5號’,‘博辣6號’等10個湖南主要栽培品種中采集到196份疑似病毒感染的辣椒樣本,進行RT-PCR檢測,并測序確定PMMoV對湖南辣椒的侵染,對RT-PCR檢測中擴增得到的PMMoV CP基因序列比對發(fā)現(xiàn)相似度為100%。隨機選取PMMoV病毒侵染樣本進行單斑分離后,克隆PMMoV湖南分離物基因組全序列,命名為PMMoV-HN1,并進行結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進化分析,結(jié)果表明:PMMoV-HN1與中國報道的PMMoV-CN在親緣關(guān)系上最近,表現(xiàn)出一定的地理相關(guān)性,與PMMoV-CN相比較,PMMoV-HN1全基因組序列的長度與PMMoV-CN序列長度完全相同,編碼126 kD蛋白區(qū)域(70～3 423 nt)、編碼183 kD蛋白區(qū)域(70～4 908 nt)、編碼28 kD蛋白區(qū)域(4 909～5 682 nt)和編碼17.5 kD蛋白區(qū)域(5 685～6 158 nt)亦在同一個位點上,而3′-UTR與PMMoV-CN完全相同[8,15],推測PMMoV-HN1與PMMoV-CN一樣可以克服辣椒的L3抗性基因;同時PMMoV-HN1 CP基因序列與PMMoV-J、PMMoV-C-1421序列完全相同,而編碼的氨基酸與PMMoV-J、PMMoV-C-1421、PMMoV-S、PMMoV-Pa18、PMMoV-TPO-2-19、PMMoV-RP、PMMoV-BR-DF01、PMMoV-HP1、PMMoV-PMMVOU2、PMMoV-Iw、PMMoV-P2、PMMoV-Kr所編碼的氨基酸序列完全相同,進一步說明PMMoV-HN1與PMMoV-CN相同可以突破辣椒的L3抗性基因。同時通過CP基因序列和氨基酸的比對說明PMMoV的CP基因高度保守,可根據(jù)CP基因設(shè)計PMMoV特異性檢測引物。二級結(jié)構(gòu)顯示PMMoV-HN1在5′端有一個明顯的發(fā)夾結(jié)構(gòu),這個結(jié)構(gòu)可能具有終止mRNA轉(zhuǎn)錄及保持ssRNA穩(wěn)定性的作用[16],PMMoV5′-UTR基因的生物學(xué)功能有待進一步研究。檢測發(fā)現(xiàn)侵染湖南辣椒的PMMoV CP基因序列相似度為100%,沒有克隆侵染不同品種或不同地區(qū)的PMMoV的全基因,湖南地區(qū)的PMMoV病毒序列是否存在株系分化、侵染特性是否存在差異,還有待進一步研究。檢測中發(fā)現(xiàn)PMMoV-HN1與ChiVMV和蠶豆萎蔫病毒2號Broadbeanwiltvirus2 (BBWV2)存在復(fù)合侵染現(xiàn)象,復(fù)合侵染的發(fā)生是否影響這些病毒對辣椒的侵染,是否導(dǎo)致病毒的發(fā)生規(guī)律、病毒的變異及分子進化發(fā)生變化,我們將進行進一步探索。

PMMoV影響辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì),嚴重危害辣椒的生產(chǎn)。其可通過種子與染毒汁液摩擦傳毒,在植物病株殘體上可存活25年左右,帶毒種子、感病植株和帶病土壤是重要的侵染源[3]。最近的研究表明,辣椒進行工業(yè)加工后其工業(yè)產(chǎn)品中亦存在PMMoV[17]。同時,污水[18]與飲用水源[19]中亦存在著PMMoV。Colson等[20]從患病的人類糞便中檢測到PMMoV,通過試驗證明免疫反應(yīng)與患者體內(nèi)的PMMoV相關(guān),同時他們將糞便中獲得的PMMoV接種到寄主植物上表現(xiàn)出侵染癥狀,證明人類排泄物中的病毒RNA仍具有侵染活性,推測人類在此病毒的傳播過程中可能也作為傳播媒介。說明該病毒不僅可以通過種子進行傳播,亦可以通過水源或人類的活動作為傳播途徑,從而增大了對PMMoV的監(jiān)控難度。陳青等[21],郭京澤等[22]分別自我國臺灣和韓國的進境辣椒種子中檢測發(fā)現(xiàn)PMMoV。本研究檢測到PMMoV-HN1,但其發(fā)生規(guī)律和傳播途徑還不清楚,我們正在進行相關(guān)研究。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Whole-genome sequence and structural analysis ofPeppermildmottlevirusisolate HN1

Liu Xiangning1,3, Dai Liangying1,3, Li Wei1,3, Dong Zheng1,3, Tang Qianjun1,2,3

(1.CollegeofPlantProtection,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.InstituteofVirology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.HunanProvincialKeyLaboratoryforBiologyandControlofPlantDiseasesandInsectPests,Changsha410128,China)

Pepper samples were collected from Hunan, and identified asPeppermildmottlevirus(PMMoV). According to the previously reported gene conserved regions of PMMoV, six pairs of degenerate primers were designed. The 6 356 bp whole-genome sequence (PMMoV-HN1, accession no. KP345899) was obtained. There were four open reading frames, encoding four proteins, including 126 kD protein (70-3 423 nt), 183 kD protein (70-4 908 nt), 28 kD protein (4 909-5 682 nt) and 17.5 kD protein (5 685-6 158 nt). The 5′-non-coding region (5′-UTR) and the 3′-non-coding region (3′-UTR) contained 69 and 198 nucleotides, respectively, in which 5′-UTR had a sequence of m7G5′pppG methylation in the nucleotide cap structure. Identity analysis found that the nucleotide identity of PMMoV-HN1 and other PMMoV isolates was 94%-99%, and the identity of the encoded amino acids was 94%-99%. Phylogenetic analysis showed the closest phylogenetic relationships between PMMoV-HN1 and PMMoV-CN.

pepper; PMMoV; whole-genome sequence; sequence analysis

2016-04-21

2016-06-02

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303028);國家自然科學(xué)基金(31101413);湖南省煙草公司科技計劃項目(13-14ZDAa04,14-16ZDAa02)

S 432.41

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.014

* 通信作者 E-mail:tangqianjun78@163.com