大氣CO2濃度升高對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米Bt毒素表達(dá)量的影響

劉凱強(qiáng), 解海翠, 張?zhí)鞚? 白樹雄, 王振營(yíng), 何康來*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193; 2. 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院, 秦皇島 066000)

大氣CO2濃度升高對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米Bt毒素表達(dá)量的影響

劉凱強(qiáng)1, 解海翠2, 張?zhí)鞚?, 白樹雄1, 王振營(yíng)1, 何康來1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193; 2. 河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院, 秦皇島 066000)

大氣CO2濃度升高不僅影響植物營(yíng)養(yǎng)化學(xué)成分的變化, 還能夠引起植物次生抗蟲物質(zhì)表達(dá)量的改變, 進(jìn)而影響作物-害蟲的互作關(guān)系。本試驗(yàn)利用開頂式氣室(OTC)和室內(nèi)動(dòng)態(tài)氣室模擬當(dāng)前和未來大氣CO2濃度(約390、550、750 μL/L)環(huán)境, 測(cè)定了不同大氣CO2濃度下普通玉米‘鄭58’和轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分、轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac殺蟲蛋白的含量, 以及取食不同大氣CO2濃度環(huán)境下生長(zhǎng)的‘鄭58’或轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米葉片的亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)初孵幼蟲死亡率。結(jié)果表明, 與對(duì)照相比, 高大氣CO2濃度(750 μL/L)環(huán)境下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因和對(duì)照玉米葉片中淀粉、可溶性糖、非結(jié)構(gòu)性碳(TNC)含量及TNC∶N都明顯增加, 而N含量差異不顯著。對(duì)照玉米葉片的N含量顯著高于轉(zhuǎn)基因玉米, 其他營(yíng)養(yǎng)成分沒有顯著變化。隨著大氣CO2濃度的升高, 轉(zhuǎn)基因玉米的Cry1Ac蛋白表達(dá)量有下降的趨勢(shì), 但各處理間差異不顯著。亞洲玉米螟取食生長(zhǎng)在不同大氣CO2濃度環(huán)境下的‘鄭58’或轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米葉片48 h后,死亡率沒有顯著差異;轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米具有顯著的殺蟲效果。

大氣CO2; 轉(zhuǎn)基因玉米; 亞洲玉米螟; Bt毒素

大氣CO2濃度上升可提高植物的光合能力和生產(chǎn)力, 影響植物組織內(nèi)化學(xué)物質(zhì)累積。一方面, 大氣CO2濃度升高影響植物營(yíng)養(yǎng)化學(xué)物成分的變化,多數(shù)研究報(bào)道認(rèn)為大氣CO2濃度升高使植物組織內(nèi)C/N增加, 即組織內(nèi)碳水化合物含量提高, 含N化合物含量降低[1-5];另一方面, 大氣CO2濃度升高也會(huì)引起植物次生抗蟲物質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化, 如大氣CO2濃度升高會(huì)促進(jìn)針葉林總酚和單萜的積累[6]。紫苜蓿Medicagosativa(L.)組織中皂苷含量隨著大氣CO2濃度升高而顯著提高, 但組織中黃酮類化合物含量變化不大[7]。大氣CO2濃度升高環(huán)境下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因棉花棉鈴內(nèi)Bt蛋白表達(dá)量顯著降低[8]。

玉米是重要的糧食、飼料及工業(yè)原料, 亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)是嚴(yán)重為害玉米的重要害蟲。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的出現(xiàn), 為防治玉米害蟲提供了新的途徑, Bt蛋白作為轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)的最重要的外源性抗蟲物質(zhì), 在大氣CO2濃度升高情況下的表達(dá)量變化是一個(gè)值得研究的問題。目前, 關(guān)于大氣CO2濃度升高下, 轉(zhuǎn)基因玉米Bt蛋白表達(dá)量變化的研究尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)測(cè)定了不同大氣CO2濃度下普通玉米‘鄭58’和轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac殺蟲蛋白表達(dá)量, 并測(cè)定了取食兩種玉米離體組織的亞洲玉米螟初孵幼蟲的死亡率, 為未來氣候變化情境下轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲性的變化趨勢(shì)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同大氣CO2環(huán)境

試驗(yàn)于2015年在15個(gè)正八邊形開頂式氣室(open-top chamber, OTC)內(nèi)進(jìn)行(直徑4.2 m, 高3.8 m), 氣室位于吉林省公主嶺市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所野外科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)大氣CO2濃度處理, 即約390 μL/L(當(dāng)前大氣CO2濃度)、 550 μL/L和750 μL/L(通過預(yù)測(cè)得到的未來大氣CO2濃度)[9-10]。OTC由氣室、控制室及控制系統(tǒng)組成, 具體結(jié)構(gòu)和調(diào)控方式詳見文獻(xiàn)[11]。OTC內(nèi)試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用裂區(qū)設(shè)計(jì), 大氣CO2濃度為主區(qū), 玉米品種為裂區(qū), 即先按照大氣CO2濃度設(shè)置3個(gè)處理的小區(qū)(主處理);然后在主處理的小區(qū)內(nèi)引進(jìn)玉米品種的2個(gè)處理(副處理),共有6個(gè)處理, 重復(fù)5次。

1.2 供試玉米

試驗(yàn)所用玉米品種包括轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米(啟動(dòng)子:花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子CaMV35S,終止子:胭脂堿合成酶基因(nos)終止子), 對(duì)照‘鄭58’(轉(zhuǎn)基因玉米受體), 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米中心提供。于5月10日播種, 行距50 cm, 株距30 cm, 每氣室中間以60目紗網(wǎng)分開, 左右兩側(cè)分別種植30株轉(zhuǎn)基因玉米和對(duì)照玉米。

1.3 供試亞洲玉米螟

亞洲玉米螟O.furnacalis來自吉林省公主嶺市田間自然發(fā)生種群, 在室內(nèi)用人工飼料[12]飼養(yǎng)數(shù)代后備用。

1.4 玉米組織內(nèi)化學(xué)物質(zhì)含量測(cè)定

玉米播種45 d后, 每小區(qū)隨機(jī)取5株玉米, 取其葉片剪碎混勻后測(cè)定碳水化合物和Cry1Ac蛋白等化學(xué)物質(zhì)含量。非結(jié)構(gòu)性碳(淀粉和糖類)采用Tissue和Wright[13]的方法測(cè)定。用凱氏定氮法(Model KDY-9830 凱氏定氮儀,北京)測(cè)定氮含量。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定Cry1Ac蛋白含量, 試劑盒為Agdia公司生產(chǎn)(試劑盒貨號(hào):PSP06200,檢測(cè)靈敏度:0.01 ppb)。

1.5 玉米葉片室內(nèi)生測(cè)

分別采集3個(gè)大氣CO2濃度OTC中的玉米葉片, 放在直徑9 cm的塑料培養(yǎng)皿中(皿蓋上有直徑3.5 cm圓孔, 覆以100目尼龍紗網(wǎng), 保證培養(yǎng)皿內(nèi)的CO2濃度), 接入亞洲玉米螟初孵幼蟲50頭。每處理分兩組, 分別放在CO2濃度與葉片生長(zhǎng)環(huán)境相同的人工氣候箱(CDCC-1型, 寧波賽福PRX-450D-CO2)和當(dāng)前大氣CO2濃度人工氣候箱(CDCC-1型, 寧波賽福PRX-450D)內(nèi)飼養(yǎng)。人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為白天(28±1)℃, 夜間(27±1)℃;相對(duì)濕度75%～85%;光周期L∥D=16 h∥8 h。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)玉米品質(zhì)的影響和對(duì)玉米螟死亡率的影響采用裂區(qū)設(shè)計(jì)的方差分析, 對(duì)Bt毒素表達(dá)量采用單因素方差分析, 平均數(shù)比較采用LSD檢驗(yàn),P<0.05。統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算用SAS軟件實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米葉片化學(xué)成分含量

不同大氣CO2濃度環(huán)境下生長(zhǎng)的玉米, 其葉片的可溶性糖和淀粉含量差異顯著, 而N含量差異不顯著(表1), 因而非結(jié)構(gòu)性碳比氮(TNC∶N)差異顯著。與當(dāng)前大氣CO2濃度相比, 在750 μL/L CO2濃度環(huán)境下生長(zhǎng)的玉米葉片可溶性糖、淀粉、TNC含量和TNC∶N分別增加了15.9%、10.3%、12.0%和17.3%, N含量沒有顯著差異;而在550 μL/L CO2濃度環(huán)境下生長(zhǎng)的玉米葉片除TNC∶N顯著升高了7.0%外, 其余參數(shù)無顯著差異(圖1)。與550 μL/L CO2濃度相比, 750 μL/L CO2濃度下生長(zhǎng)的玉米葉片可溶性糖含量、TNC含量和TNC∶N顯著升高了16.4%、9.0%、9.5%, 淀粉含量沒有顯著差異。

‘鄭58’玉米葉片的N含量極顯著地高于轉(zhuǎn)基因玉米, 對(duì)照玉米和轉(zhuǎn)基因玉米的可溶性糖、淀粉、TNC含量和TNC∶N沒有顯著差異(表1, 圖1)。品種和CO2的交互作用對(duì)玉米葉片的可溶性糖、淀粉、TNC、氮含量、TNC∶N都沒有顯著影響(表1)。

圖1 不同CO2濃度下玉米葉片中幾種化學(xué)物質(zhì)含量及不同玉米品種葉片的氮含量Fig.1 Contents of several compounds in the leaves of maize under different CO2 levels and N content in the leaves of different varieties of maize

化合物Compound二氧化碳CO2品種Variety二氧化碳×品種CO2×Variety可溶性糖SolublesugarF5.254.521.83df2,271,282,24P0.0350.0550.202淀粉StarchF5.660.730.64df2,271,282,24P0.0290.4100.542非結(jié)構(gòu)性碳TNCF8.874.192.32df2,271,282,24P0.0090.0630.141氮NF3.1526.920.86df2,271,282,24P0.098<0.0010.448非結(jié)構(gòu)性碳∶氮TNC∶NF19.350.341.62df2,271,282,24P<0.0010.5730.239

2.2 Cry1Ac蛋白表達(dá)量

由表2可知,隨著大氣CO2濃度的升高,轉(zhuǎn)基因玉米組織中Cry1Ac蛋白表達(dá)量有下降的趨勢(shì), 但不同濃度間沒有顯著差異。

表2 不同CO2濃度下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米葉片的Cry1Ac蛋白表達(dá)量

Table 2 Cry1Ac protein contents in the leaves of GM maize under different CO2levels

CO2濃度/μL·L-1CO2levelCry1Ac蛋白表達(dá)量/mg·g-1QuantityofCry1AcproteinMean±SEFdfP約3901.91±0.090.362,120.70625501.88±0.067501.82±0.08

2.3 不同處理下亞洲玉米螟48 h的死亡率

組織離體生測(cè)結(jié)果顯示, 不同玉米品種的殺蟲效果差異顯著(表3)。與‘鄭58’玉米相比, 轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米有顯著的殺蟲效果, 亞洲玉米螟初孵幼蟲取食48 h后, 死亡率都達(dá)到了95.8%以上, 而取食‘鄭58’玉米的死亡率小于7.4%(表4)。不同大氣CO2濃度處理的亞洲玉米螟幼蟲存活率間差異不顯著, 且大氣CO2濃度與品種間交互作用不顯著(表3)。

表3 不同處理間差異顯著性方差分析統(tǒng)計(jì)參數(shù)

Table 3 Statistic parameters of analysis of variance among the treatments

變異來源Sourceofvariance統(tǒng)計(jì)參數(shù)StatisticparameterdfFP玉米品種Cornvariety982343.16<0.0001大氣CO2濃度AtmosphericCO2971.010.4172玉米品種×大氣CO2濃度Cornvariety×atmosphericCO2950.320.8629

表4 不同處理間亞洲玉米螟48 h的死亡率

Table 4 Mortality ofOstriniafurnacaliswithin 48 h among different treatments

玉米品種Cornvariety生長(zhǎng)環(huán)境大氣CO2濃度/μL·L-1AtmosphericCO2levelofambientenvironment生測(cè)環(huán)境大氣CO2濃度/μL·L-1AtmosphericCO2levelofbioassayenvironment死亡率/%Mortalityrate鄭58 Zheng58約390約3905.4±1.49鄭58 Zheng58550約3907.4±2.11鄭58 Zheng58750約3905.6±2.17鄭58 Zheng585505505.6±1.71鄭58 Zheng587507505.0±2.20轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene約390約39095.8±1.41轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene550約39099.4±0.31轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene750約39097.2±0.80轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene55055097.4±0.67轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene75075096.8±1.04

3 討論

大氣CO2濃度升高,使植物光合作用底物濃度增加,光合作用效率增加,提高植物生產(chǎn)力,相當(dāng)于“施肥效應(yīng)”[14-15],同時(shí)引起植物組織內(nèi)不同化合物成分與含量發(fā)生變化[16-18]。然而,不同作物對(duì)“施肥效應(yīng)”的反應(yīng)水平或效果差異較大。關(guān)于大氣CO2濃度升高對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)成分含量影響的研究很多,但大多數(shù)集中在對(duì)C3植物的研究上,對(duì)C4植物的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)研究顯示,大氣CO2濃度升高,玉米葉片中淀粉和可溶性糖含量、TNC∶N都明顯增加,這與前人的研究結(jié)果相同[5,8,19]。一般來講,大多數(shù)植物(尤其是C3植物)的光合作用速率和生長(zhǎng)會(huì)隨著CO2濃度的升高而提高[20-21],進(jìn)而會(huì)提高葉片對(duì)C/N和水利用效率,葉片N含量降低[22-23]。另一些研究則認(rèn)為,大氣CO2濃度升高對(duì)不同作物的影響不同。如生長(zhǎng)在高CO2濃度環(huán)境下的紅車軸草Trifoliumpratense(L.)和草木樨Melilotusalba(Desr.)(C3植物,豆科)的C、N含量以及C/N沒有差異[24]。即使是同一作物,不同研究者所用品種與栽培方式不同、測(cè)定的組織不同,其結(jié)果也存在差異。如,大氣高CO2濃度環(huán)境下,盆栽的‘Kedan 8’玉米籽粒中蛋白、TNC/蛋白顯著增加,但TNC的含量差異不顯著[25],而在直播的‘XY335’玉米葉和莖中TNC含量比對(duì)照均顯著增加[11]。土壤的施N量也會(huì)影響植物組織的C/N[26-27]。在本試驗(yàn)中,不同大氣CO2環(huán)境下生長(zhǎng)的玉米葉片的N含量差異不顯著。這可能與品種有關(guān),本研究所用玉米品種為自交系‘鄭58’及其轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因品系。但本研究中TNC/N 的結(jié)果與已報(bào)道的玉米相關(guān)研究結(jié)果一致。

與對(duì)照玉米相比,轉(zhuǎn)基因玉米葉片N含量顯著降低,其他營(yíng)養(yǎng)成分差異不顯著,這可能與外源基因的插入有關(guān)。Chen等[8]的研究也發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在CO2濃度為750 μL/L的開頂式氣室環(huán)境中的轉(zhuǎn)基因棉花的N含量顯著低于非轉(zhuǎn)基因棉花。

Bt蛋白屬于轉(zhuǎn)基因玉米植株內(nèi)的氮源抗蟲物質(zhì),轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米葉片中Cry1Ac殺蟲蛋白表達(dá)量沒有隨著大氣CO2濃度的升高而改變,這與本試驗(yàn)中玉米葉片N元素含量沒有顯著變化保持一致。有報(bào)道表明,轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉棉鈴內(nèi)Bt殺蟲蛋白表達(dá)量受大氣CO2濃度升高影響而顯著降低,降低幅度與棉花中N含量有關(guān)[8,25,28],而Coviella等[29]報(bào)道,大氣CO2濃度升高的情況下,改變土壤施N量,葉片的含N量和Bt蛋白的表達(dá)量變化是一致的,即隨著施N量的增加,使得葉片N含量和Bt蛋白表達(dá)量下降的趨勢(shì)變得不顯著。白樹雄[30]研究認(rèn)為外源基因的導(dǎo)入并沒有對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米抗蟲次生物質(zhì)產(chǎn)生影響,這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。外源基因的導(dǎo)入是否會(huì)引起轉(zhuǎn)基因作物體內(nèi)次生代謝物質(zhì)表達(dá)量的變化是有爭(zhēng)議的，如有研究表明轉(zhuǎn)基因棉植株體內(nèi)的單寧酸、棉酚表達(dá)量與對(duì)照親本表達(dá)量不同[31]。因此,轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲作物外源殺蟲Bt蛋白的表達(dá)量是否受大氣CO2濃度升高的影響因作物品種、土壤中氮肥含量、外源基因?qū)敕绞降榷悺?/p>

對(duì)玉米組織的離體生測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)cry1Ac-m基因玉米品種相比‘鄭58’的殺蟲效果顯著,這與試驗(yàn)中大氣CO2濃度升高對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米Bt蛋白表達(dá)量沒有顯著影響一致。本試驗(yàn)只進(jìn)行了離體玉米組織的抗蟲性研究,而在大氣CO2濃度升高情況下,田間不同品種玉米的抗蟲性鑒定需要進(jìn)一步的研究。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

Effects of elevated atmospheric CO2concentration on the expression of Bt toxin in transgenic maize

Liu Kaiqiang1, Xie Haicui2, Zhang Tiantao1, Bai Shuxiong1, Wang Zhenying1, He Kanglai1

(1.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Qinhuangdao066000,China)

Elevated CO2(eCO2) will generally lead to the change of chemical composition of plants. On the other hand,eCO2may also mediate the changes in plant secondary metabolism, which will affect the plant-herbivore interaction. This research simulated the growth and development of the corn line ‘Zheng 58’ and a line expressing Bt Cry1Ac toxin (GM-line),Ostriniafurnacalisand their interactions under ambient environment with twoeCO2(about 390 μL/L, 550 μL/L, 750 μL/L) with open top chambers (OTCs) and closed dynamic chambers (CDC). Corn plant chemistry, especially the C and/or N contents as well as Cry1Ac toxin were assessed. The results showed that the starch and soluble sugar content, TNC and TNC∶N were significantly increased in the plant tissues undereCO2(750 μL/L) OTC, but the N contents in leaves were not significantly different among CO2concentrations. However, the N content in leaves of ‘Zheng 58’ was significantly higher than that in GM-line. Although the amount of Cry1Ac toxin expressed in GM-line leaves declined along with the increase in atmospheric CO2level, there was no significant difference among atmospheric CO2treatments.eCO2did not significantly affect the mortality ofO.furnacalisin 48 h. The survival rate was significantly lower in GM-line.

atmospheric carbon dioxide; transgenic maize;Ostriniafurnacalis; Bt toxin

2016-05-03

2016-07-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201303026)

S 435.132

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.010

* 通信作者 E-mail: klhe@ippcaas.cn