草甘膦作用機制和抗性研究進展

陳世國, 強 勝, 毛嬋娟

(南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 南京 210095)

專論與綜述

草甘膦作用機制和抗性研究進展

陳世國*, 強 勝, 毛嬋娟

(南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院, 南京 210095)

草甘膦是迄今為止最為重要、應用最廣泛和最優(yōu)秀的除草劑之一。然而,由于抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的廣泛商業(yè)化導致草甘膦使用量迅速增長,雜草抗藥性發(fā)生,這不僅對草甘膦的藥效發(fā)揮和未來可持續(xù)應用造成了嚴重影響,而且對現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全構(gòu)成了威脅。本文通過對草甘膦的作用機理、草甘膦抗性雜草發(fā)展現(xiàn)狀和抗性機制進行系統(tǒng)的總結(jié)和分析,以期為我國草甘膦的抗性研究和科學使用提供參考。

除草劑; 草甘膦; 作用機制; 抗性

自從1946年開始使用2,4-D,化學除草劑已走過60多年的歷程,為全球糧食生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化做出了巨大貢獻[1]。其中草甘膦(N-(膦羧基甲基)甘氨酸)是迄今為止最為重要、應用最為廣泛和最優(yōu)秀的除草劑[2]。自1974年美國孟山都公司開發(fā)草甘膦以來,由于其具有廣譜、低毒、安全、無土壤殘留的特點,迅速占據(jù)了世界除草劑的主導地位。尤其是1996年后,隨著抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物(如大豆、玉米和油菜)的問世和大面積推廣應用,草甘膦的使用更是出現(xiàn)了迅猛增長[3]。目前,已成為全球銷售量最大和增長最快的農(nóng)藥品種[4]。

1 草甘膦的作用機制

草甘膦是唯一一個以植物葉綠體中5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolypyruvylshikimate-3-phosphate synthase, EPSPS, EC 2.5.1.19)為靶標的除草劑[2]。EPSPS廣泛存在于植物和一些真菌及細菌體內(nèi),是莽草酸代謝途徑的第6個酶。莽草酸途徑在植物的生長點最為活躍,對植物極其重要,它貢獻了植物體干重生物量的35%以上[5]。在莽草酸途徑中,EPSPS負責催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和磷酸莽草酸(S3P)生成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)。這個步驟是植物細胞合成芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸),并最終合成激素和許多次生代謝物如類黃酮、木質(zhì)素、泛醌、維生素K、植物保衛(wèi)素和其他酚類化合物的關(guān)鍵(圖1)。草甘膦的作用機理是以競爭PEP和非競爭S3P的方式同植物體內(nèi)EPSPS進行綁定,形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的EPSPS-S3P-草甘膦復合物。從而引起EPSPS活性的喪失,大量碳源流向S3P,進而造成莽草酸在組織中快速積累。另一方面,蛋白質(zhì)生物合成所必需的芳香族氨基酸的合成則嚴重受阻。最終導致植物生長受到抑制[6]。

圖1 莽草酸途徑和草甘膦作用位點Fig.1 The shikimate pathway and the action site of glyphosate

然而,草甘膦是如何通過抑制莽草酸途徑殺死植物的至今仍不十分清楚。許多研究認為蛋白質(zhì)合成所需芳香族氨基酸的缺乏是草甘膦作用的最初影響,這符合草甘膦作用緩慢的特點。同時,大量碳源流向莽草酸途徑必然導致其他基本代謝所需碳源的匱乏,引起植物體內(nèi)代謝的紊亂。大量證據(jù)已經(jīng)表明草甘膦對其他許多生理生化過程都有明顯的影響,例如降低光合作用效率、導致葉綠素降解、抑制葉綠素和胡蘿卜素合成、減少光合作用和光呼吸蛋白豐富度、抑制鐵還原酶(ferric reductase)活性、抑制生長素傳導和增加生長素氧化等[7-9]。有研究顯示草甘膦處理甜菜BetavulgarisL.葉片后,葉片中1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)含量急劇下降、氣孔導度迅速減小、碳同化完全停止、光合作用效率顯著降低,但是對蔗糖的合成和轉(zhuǎn)運沒有影響[10-11]。Olesen等也發(fā)現(xiàn)在噴灑草甘膦1 d后,大麥Hordeumvulgare葉片的CO2同化完全停止了[12]。來自非草甘膦抗性玉米的結(jié)果表明,隨著草甘膦使用濃度的增加,葉綠素含量、株高和干生物量逐漸降低[13]。草甘膦能夠和一些金屬離子(如Mg2+)發(fā)生螯合,引起一些酶結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,可能是葉綠素合成受阻的重要原因[4]。而Zobiole等發(fā)現(xiàn),草甘膦抑制轉(zhuǎn)基因大豆(抗草甘膦)光合作用并導致生物量和谷物產(chǎn)量減少的原因在于它顯著降低了大豆的葉面積及根莖對營養(yǎng)的吸收和積累[14]。此外,草甘膦也被證明能夠抑制核酸的生物合成[15]。正是由于這樣的作用特點使草甘膦成為研究植物學的優(yōu)秀工具之一。

2 草甘膦抗性雜草的現(xiàn)狀

草甘膦能夠抑制幾乎所有高等植物的EPSPS活性,這種非選擇性特點使它在很長一段時間內(nèi)不能夠直接在作物田中使用。隨著抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的發(fā)展,使得草甘膦既能殺死所有雜草又不傷害作物的目標得以實現(xiàn)[2]。草甘膦的大量使用減少了其他除草劑的用量,降低了生產(chǎn)投入和管理成本,同時也減少了對水體和土壤的污染。然而,過度依賴和長期大量使用單一除草劑,導致了雜草抗藥性的產(chǎn)生和發(fā)展,直接威脅到除草劑的繼續(xù)使用和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全[16]。據(jù)最新統(tǒng)計,全世界已有249種(144 種雙子葉,105 種單子葉)雜草的467個生物型對22類作用位點的160種化學除草劑產(chǎn)生了抗藥性[17]。對于草甘膦而言,由于在投入市場的最初20年間一直沒有發(fā)現(xiàn)抗性植物的存在,加上科學家對植物代謝草甘膦分子機制認識的缺乏,以及草甘膦抗性作物必須轉(zhuǎn)入外源細菌基因才能獲得的事實,人們曾一度認為在田間不可能出現(xiàn)抗草甘膦植物[18]。這個神話在1996年被徹底打破,Pratley等首次報道在澳大利亞發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的硬直黑麥草Loliumrigidum[19-20]。1999年,Tran等發(fā)現(xiàn),在馬來西亞連續(xù)10年使用草甘膦后,牛筋草Eleusineindica對草甘膦的抗性提高了8～12倍[21]。同年末,在連續(xù)使用草甘膦8～10年的智利果園發(fā)現(xiàn)其對多花黑麥草Loliummultiflorum的防治效果很差[22]。2000年,在美國東部特拉華州連續(xù)3年種植抗草甘膦大豆的農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)小飛蓬Conyzacanadensis對草甘膦的抗性提高了8～13倍[23]。2001年,在南非及美國的加州也發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的硬直黑麥草生物型[24-25]。2003年,在南非發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的長葉車前Plantagolanceolata和香絲草Conyzabonariensis[26]。2004年,在美國發(fā)現(xiàn)豚草Ambrosiaartemisiifolia對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性[17]。2005年,Culpepper等對美國佐治亞州傳統(tǒng)棉花、花生和大豆田懷疑具有草甘膦抗性的長芒莧Amaranthuspalmeri進行了抗性鑒定,結(jié)果顯示其抗性生物型半致死濃度是敏感生物型的12倍,在大田有效防除抗性長芒莧的用藥量也是推薦劑量的12倍,證明長芒莧已經(jīng)對草甘膦產(chǎn)生了抗性[27]。此后,在美國還發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的具瘤莧Amaranthusrudis和三裂葉豚草Ambrosiatrifida、在巴西和阿根廷分別發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的猩猩草Euphorbiaheterophylla和假高粱Sorghumhalepense、在中國發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的野芥菜和小飛蓬C.canadensis以及田旋花Convolvulusarvensis、在澳大利亞發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的光頭稗Echinochloacolonum、在巴西和巴拉圭發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的馬唐屬雜草SourgrassDigitariainsularis[28-34]。迄今為止,在全球不同國家和地區(qū)不同栽培方式下共發(fā)現(xiàn)了34種抗草甘膦雜草[17]。草甘膦抗性植物的出現(xiàn),將草甘膦這個百年一遇的優(yōu)秀除草劑置于危險的境地,更是給全球作物和糧食生產(chǎn)安全帶來了巨大威脅[35]。

3 植物對草甘膦的抗性機制

植物對除草劑的抗性至少有三類不同機制:作用靶點抗性、非靶點抗性和代謝解毒。前2種機制在草甘膦抗性植物中已得到廣泛確認[18,36-37]。

3.1 靶點抗性機制

草甘膦的靶點抗性包括2種類型:靶點EPSPS基因突變和靶點EPSPS基因擴增。根據(jù)對草甘膦敏感性的不同,來自生物體的EPSPS可以被分成兩類:Ⅰ型和Ⅱ型。幾乎所有植物和許多革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌Escherichiacoli和沙門氏菌Salmonellatyphimurium)的EPSPS對草甘膦非常敏感,屬于I型。從天然草甘膦抗性微生物(如農(nóng)桿菌Agrobacteriumsp. CP4、無色桿菌Achromobactersp. LBAA、假單胞菌Pseudomonassp. PG2982)和一些革蘭氏陽性細菌(如金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus)中分離的EPSPS則屬于Ⅱ型,對草甘膦的抗性非常強。根據(jù)最新的EPSPS三維晶體結(jié)構(gòu)解析草甘膦與Ⅰ型EPSPS(PDB:1g6s)和Ⅱ型(PDB:2gga)EPSPS相互作用的分子模型發(fā)現(xiàn),EPSPS的活性位點高度保守,2種EPSPS僅有幾個氨基酸位點存在差異[38-39]。Ⅰ型EPSPS多肽序列的96、97、101和106位氨基酸的突變會對草甘膦產(chǎn)生較高抗性,受單核編碼基因控制[18]。Stalker等發(fā)現(xiàn)草甘膦抗性沙門氏菌的EPSPS發(fā)生了點突變,101位脯氨酸被絲氨酸取代(Pro101Ser)。而大腸桿菌EPSPS的97位甘氨酸被丙氨酸取代(Gly97Ala)可對草甘膦產(chǎn)生500倍抗性[18]。抗草甘膦的硬直黑麥草不同種群的EPSPS的106位脯氨酸有2種不同突變,被蘇氨酸或丙氨酸取代(Pro106Thr/Ala)[41-42]。牛筋草E.indica之所以對草甘膦的抗性提高了8～12倍,在于其EPSPS的編碼基因發(fā)生了變化,使第106位脯氨酸變成了絲氨酸或蘇氨酸(Pro106Ser/Thr)[43-44]。來自智利果園的多花黑麥草L.multiflorum由于EPSPS的106位脯氨酸被絲氨酸取代(Pro106Ser),對草甘膦敏感性變差[45]。研究發(fā)現(xiàn),與脯氨酸不同的是,絲氨酸、蘇氨酸含有極性基團-羥基,具有親水性。隨著氨基酸種類的改變,EPSPS的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化,從而使其與底物的親和力增加,導致草甘膦無法再占據(jù)PEP結(jié)合位點,植物因此形成對草甘膦的抗性[37,46]。Kaundun等指出,除了Pro106Ser/Thr/Ala/Leu突變外,EPSPS的106位脯氨酸的其他突變也會產(chǎn)生草甘膦抗性[47]。最近,Mao等發(fā)現(xiàn)3種百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus、山麥冬Liriopespicata和闊葉山麥冬L.platyphylla對草甘膦有較強的抗性,它們的EPSPS基因和氨基酸序列同已知Ⅰ型EPSPS存在明顯差異,而且其突變位點不在已有專利的保護范圍里,屬新型抗性基因[48]。

基于靶點抗性的第二種機制是EPSPS基因的擴增。早期,當科學家們企圖利用組織培養(yǎng)方法篩選抗草甘膦植物時發(fā)現(xiàn),矮牽牛、煙草、胡蘿卜、大豆和紫花苜?？剐约毎档腅PSPS基因拷貝數(shù)至少增加了20倍。但是,其抗性在后代的遺傳具有非常高的不確定性。因此,科學家不得不放棄用這種策略來培育抗草甘膦植物,并認為這種抗性機制不可能在田間發(fā)生[18,49-50]。然而,Gaines等在研究草甘膦抗性長芒莧A.palmeri時發(fā)現(xiàn),抗性和敏感型植株的EPSPS對草甘膦都非常敏感,沒有明顯差異。但抗性植株的EPSPS基因拷貝數(shù)增加了100倍,導致EPSPS表達量增加了40倍。EPSPS基因的表達量、蛋白的增加水平與基因組中EPSPS基因的拷貝數(shù)呈正相關(guān)。來自熒光原位雜交(FISH)證據(jù)進一步顯示,每條染色體上均存在EPSPS基因。可見,EPSPS基因的擴增不可能是由染色體的不均等交換引起的。長芒莧的這種擴增特性在后代是可以遺傳的,并符合擬F2群體的抗性[35,50-53]。而且,這種抗性機制可以部分傳遞給近緣種刺莧A.spinosus[54]。最近,EPSPS基因擴增引起草甘膦抗性的產(chǎn)生在意大利黑麥草L.perennessp.multiflorum[55]、糙果莧A.tuberculatus[56-57]、地膚Kochiascoparia[58-59]和牛筋草E.indica[60]中也相繼被確認。今天,靶基因EPSPS擴增已成為一類普遍的草甘膦抗性機制[37]。

3.2 非靶點抗性機制

草甘膦的非靶點抗性機制主要包括吸收障礙、傳導受阻、屏蔽作用或隔離作用、氧化代謝和其他解毒代謝作用。

①吸收障礙。草甘膦主要通過植物葉片表皮組織被快速吸收而進入體內(nèi),這可能和植物細胞內(nèi)存在特殊的草甘膦載體有關(guān)[61]。與敏感性相比,除草劑抗性生物型植物可能具有不同的葉表面超微結(jié)構(gòu)和組織解剖結(jié)構(gòu)特征,如葉面積減小、蠟質(zhì)層增厚、表皮氣孔數(shù)減少等,因而造成對除草劑吸收的減少。最近有研究表明葉片吸收量減少是假高粱S.halepense和硬直黑麥草對草甘膦產(chǎn)生抗性的原因之一,且這種抗性機制容易受溫度的影響[62-63]。

②傳導受阻。草甘膦通過植物葉片吸收后,伴隨光合產(chǎn)物蔗糖的運輸通過韌皮部運到分生組織,這對草甘膦發(fā)揮毒性至關(guān)重要[1]。然而,草甘膦傳導到韌皮部的生化和分子機制仍不清楚。推測可能是先通過擴散或滲透作用進入葉肉細胞,然后通過胞間連絲運動到木質(zhì)部或韌皮部。一旦進入篩管,草甘膦獨特的化學結(jié)構(gòu)和特性使它能順利傳導到分生組織[18]。因此,降低草甘膦向分生組織的傳導能夠增加植物的抗性。Lorraine-Colwill等發(fā)現(xiàn)一個抗草甘膦生物型硬直黑麥草EPSPS 序列與敏感生物型的完全相同,葉片對草甘膦的吸收也沒有明顯不同[64]。兩者之間最大的差異是草甘膦在體內(nèi)的傳導速度不同,敏感型體內(nèi)的草甘膦匯聚在植物的根部,而抗性生物型體內(nèi)的草甘膦則匯聚在葉尖[65]。隨后,同樣的抗性機制在幾個草甘膦抗性假高粱生物型中也得到證實[1,62]。

③屏蔽作用或隔離作用。指的是在除草劑到達作用靶點前被固定在植物組織或細胞內(nèi)某個特殊區(qū)域,從而“失去”毒性。Ge等利用31P核磁共振(NMR)技術(shù)研究草甘膦在細胞內(nèi)的分布時發(fā)現(xiàn),草甘膦快速在液泡中隔離是小蓬草Conyzacanadensis和澳大利亞黑麥草Loliumspp.產(chǎn)生抗性的主要原因[66-69]。分子證據(jù)表明,液泡膜相關(guān)蛋白如ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白和液泡膜內(nèi)在蛋白(TIP)可能參入了這種抗性機制的形成[37,69]。

④氧化代謝。在植物體內(nèi)除草劑的氧化作用是非常普遍的,常是導致除草劑解毒或活化的主要代謝反應。在草甘膦氧化酶(GOX)的作用下,草甘膦氧化產(chǎn)生磷酸和肌氨酸,或者形成氨甲基磷酸(AMPA)和乙醛酸,從而失去除草活性[70]。在轉(zhuǎn)基因油菜中就成功應用了GOX來增加對草甘膦的抗性[6,71]。最近,一個來自黃素蛋白家族的氨基乙酸氧化酶(GO)也被證實能夠?qū)⒉莞熟⒀趸葾MPA和乙醛酸,但是代謝途徑和GOX有所不同[37,39,72]。

⑤其他解毒代謝作用。2004年,Castle和他的合作者從土壤微生物地衣芽胞桿菌Bacilluslicheniformis體內(nèi)分離到一種草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT),該酶能有效地將草甘膦乙酰化生成無細胞毒性的N-乙酰草甘膦。轉(zhuǎn)入gat基因的大腸桿菌、擬南芥、煙草和玉米對草甘膦有明顯的抗性。這個發(fā)現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因抗草甘膦植物的開發(fā)提供了一個全新的思路[39,73-75]。此外,細胞色素P450s能通過羥基化或脫烷基化來代謝乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)、乙酰乳酸合成酶(ALS)和光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)抑制劑類除草劑,達到解除細胞毒性的目的[76]。谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)也被證明參入了除草劑的解毒代謝過程[77-78]。目前,對細胞色素P450s和GSTs解除除草劑毒性的分子機制仍然知之甚少,在草甘膦抗性植物中還沒有關(guān)于此類抗性機制的報道。不過,越來越多的研究表明在自然界中任何抗性機制都是可能發(fā)生的[35]。

事實上,非靶點抗性機制比靶點抗性機制更為普遍,容易產(chǎn)生更高的抗性水平,而且不同植物間抗性機制存在差異,有些植物還具有多抗性機制。非靶點抗性機制已成為當前除草劑抗性研究的前沿問題[1]。

4 草甘膦抗性基因的研究現(xiàn)狀及展望

將草甘膦抗性基因通過生物技術(shù)手段轉(zhuǎn)入作物中培養(yǎng)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物,已經(jīng)成為目前全球播種面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。但抗草甘膦基因(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶EPSPS)的核心技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化應用的絕大部分專利由孟山都、拜耳、先鋒、先正達、巴斯夫等跨國公司擁有[79]。更嚴峻的事實是,這些跨國公司一直通過對基因序列進行小范圍改動和修飾的手段對其核心專利進行延長保護,使其變?yōu)椤靶隆睂＠?從而有效規(guī)避所謂的“20年專利使用期”,試圖達到獨占這些功能基因和轉(zhuǎn)化技術(shù)的目的。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)部的統(tǒng)計,EPSPS基因已在50多個國家和地區(qū)被授予140多件專利(截止到2013年),而且,近幾年申請數(shù)量仍在迅速增加。其中,中國已獲得14件EPSPS基因?qū)＠跈?quán),位于美國、法國之后。但是,我們的專利總量仍然較少,保護范圍也太窄。并且我們多數(shù)專利都是建立在國外核心專利的基礎(chǔ)之上,如果想要使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化,國外掌握的“專利使用權(quán)”是一道繞不過去的坎。因此,加強除草劑作用機理和植物抗性機制的研究、發(fā)掘新的具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的除草劑抗性基因資源,對于推動我國雜草科學進步和保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全具有十分重要的意義。我國是草甘膦生產(chǎn)和應用大國,從20世紀80年代開始,草甘膦在我國的茶園、桑園、果園得到了廣泛使用。目前,我國正處在農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化和實現(xiàn)社會可持續(xù)發(fā)展的重要時期,經(jīng)濟、高效、環(huán)保型除草劑的推廣和應用是其中的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。如果轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物在我國被批準商業(yè)化,草甘膦在我國將有著良好的發(fā)展前景和巨大的產(chǎn)業(yè)潛力。

20年來,由于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物的成功商業(yè)化應用而使草甘膦一躍成為全球最主要的除草劑品種。同時,關(guān)于草甘膦抗性的研究也已成為國際上植物科學和雜草科學研究的熱點之一。我國對草甘膦抗性的研究才剛起步。因此,在生產(chǎn)實踐中發(fā)掘新的抗草甘膦材料,全面、系統(tǒng)地闡明其對草甘膦產(chǎn)生抗性的機制具有重要的理論和現(xiàn)實意義。一方面,草甘膦抗性機制的闡明有助于我們對基礎(chǔ)植物生化過程和植物對有毒化學物質(zhì)防衛(wèi)機制的理解;另一方面,為將來克服雜草抗性的發(fā)生和雜草的科學管理提供堅實的理論依據(jù);同時,具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)抗性新基因的發(fā)掘,將為開發(fā)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因植物提供新的研究思路和方法。

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(責任編輯：田 喆)

Mechanism of action of glyphosate and research advances in glyphosate resistance

Chen Shiguo, Qiang Sheng, Mao Chanjuan

(CollegeofLifeScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

Glyphosate has become one of the most important, dominant and perfect herbicide for world agriculture so far. However, the overreliance and intensive use of glyphosate alone to manage weeds has selected populations that are glyphosate-resistant. This threatens not only efficacy and future sustainability of glyphosate as a precious herbicide, but also the safety of modern agricultural production. In this review, we focus on the action mechanism of glyphosate, the current status of evolved glyphosate-resistant weeds worldwide and resistance mechanisms in different weeds. This will provide useful references for Chinese researchers in the study of glyphosate resistance and sustainable use of glyphosate in the future.

herbicide; glyphosate; mechanism of action; resistance

2016-04-12

2016-06-09

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2016ZX08011-001);中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(KYZ201530)

S 482.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.003

Reviews

* 通信作者 E-mail:chenshg@njau.edu.cn