不同發(fā)育階段延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達基因的篩選

田萬年，李香子，夏廣軍，金 鑫，嚴昌國*

（1．吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林 132101；2． 預防獸醫(yī)學吉林省重點實驗室，吉林吉林 132101；3． 延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133002）

不同發(fā)育階段延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達基因的篩選

田萬年1,2，李香子3，夏廣軍3，金 鑫3，嚴昌國3*

（1．吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物科技學院，吉林吉林 132101；2． 預防獸醫(yī)學吉林省重點實驗室，吉林吉林 132101；3． 延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133002）

應用引物退火控制技術（ACP）篩選8月齡和30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達基因，尋找與延邊黃牛生長發(fā)育相關的候選基因。相同飼養(yǎng)條件下，分別檢測3頭8月齡和30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌組織的mRNA表達水平變化。利用20對隨機引物差異顯示擴增，共獲得9條ESTs。對Telethonin、MYH7、MSTN、Camk2d和SPP1基因進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明：MYH7、 MSTN和SPP1基因在8月齡閹牛組背最長肌中的表達量顯著高于30月齡（P＜0．05）；Telethonin和Camk2d在30月齡閹牛背最長肌中的表達量顯著高于8月齡（P＜0．05）。結(jié)果提示，這些基因可能是影響延邊黃牛生長及肉質(zhì)性狀的重要調(diào)控基因。

延邊黃牛；引物退火控制技術；差異表達基因；熒光定量PCR

骨骼肌的發(fā)育調(diào)控是一個復雜基因調(diào)控，涉及到大量基因的表達及網(wǎng)絡調(diào)控，鑒定這些基因表達對闡明牛肌肉生長和肉質(zhì)性狀的分子機制以及提高牛肉質(zhì)量具有重要意義[1]。研究結(jié)果表明，動物生長發(fā)育的不同階段存在不同的基因表達機制，一些影響動物生長、肉質(zhì)性狀的候選基因具有表達的時序性。賀花[2]對秦川牛胚胎期（135 d）和成年期（30月齡）背最長肌差異基因進行了篩選，獲得了秦川牛背最長肌發(fā)育過程中肉質(zhì)、生長性狀差異表達基因。秦立紅[3]對草原紅牛初生公牛與成年公牛背最長肌組織差異表達基因進行了篩選，獲得了肉質(zhì)性狀、生長發(fā)育性狀以及抗病性狀差異基因。唐榮莉等[4]對16月齡和5歲齡蒙古牛臀肌組織差異表達基因進行了分析。恒聰聰?shù)萚5]報道，胎兒時期MyoD基因在肌肉中表達量較低，隨時間推移表達量逐漸增加，30月齡表達量達到最高。張小輝等[6]報道，18、24月齡IGF基因家族在南陽牛肌肉組織中的表達量與3月齡相比顯著降低。目前，有關延邊黃牛不同生長階段背最長肌差異表達基因研究，國內(nèi)尚未見報道。

延邊黃牛是我國五大良種黃牛之一。2008年，延邊黃牛（肉用）品種被評為東北第一個肉牛品種。延邊黃牛具有抗寒性能好、耐粗飼、抗病性強、容易育肥等特點。牛肉細嫩多汁，鮮美可口，深受消費者青睞。由于長期向役用方向選育，延邊黃牛與國外優(yōu)良肉牛品種相比，存在前軀發(fā)育較好但后軀發(fā)育偏弱、產(chǎn)肉性能較低等特點。目前，延邊黃牛分子遺傳資源研究主要從候選基因角度分析與生長、肉質(zhì)相關的分子遺傳標記[7-10]。利用分子生物學技術篩選影響生長、肉質(zhì)性狀的功能基因可以提高尋找候選基因的工作效率，對促進延邊黃牛選育改良具有重要意義。本試驗采用引物退火控制技術（Annealing Control Primer, ACP），對8月齡和30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達基因進行篩選，了解二者背最長肌基因差異表達概況，獲得影響生長、肉質(zhì)性狀候選基因，為延邊黃牛肉用改良提供理論基礎。

1 材料與方法

1．1 實驗材料 選擇6頭遺傳背景相同、健康且同一月齡、體重相近的延邊黃牛公犢牛，在相同環(huán)境條件下飼養(yǎng)，4月齡進行去勢，分別在8月齡和30月齡各屠宰3頭閹牛，屠宰后采集背最長肌，取樣后分裝到一次性手套中，紗布包緊后立即放入液氮凍存，運輸至實驗室后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 方法

1．2．1 總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法分別提取6頭牛背最長肌總RNA，溶于20 μL不含RNase的DEPC處理水中。分別取3 μL RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA的完整性，并用紫外分光光度計檢測其純度。對提取到的8月齡和30月齡閹?？俁NA（0．25 μg/μL）各取10 μL組成總RNA池30 μL，冰浴5 min。以Oligo（dT15）ACP為3′端引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。總反應體系為20 μL：總RNA 2 μg、10×Buffer 4 μL、dNTP（2．5 mmol/L）、dT-ACP1 2 μL、RNase Inhibitor 0．5 μL、SuperscriptⅡ反轉(zhuǎn)錄酶1 μL。置42℃ 60 min、94℃ 5 min、冰浴5 min終止反應。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用滅菌去離子水5倍稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?．2．2 背最長肌差異表達基因的篩選 應用GeneFishingTMDEG kit試劑盒（Seegene公司）20對隨機引物ACP同dT-ACP2組合分別對8月齡和30月齡閹牛cDNA進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL：dT-ACP2（1 μmol/L）2．5 μL、隨機引物（1 μmol/L）5 μL、dNTP（200 μmol/ L）4 μL、Taq（2．5 U）0．5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、cDNA模板5 μL、去離子水28 μL。PCR擴增反應程序：94℃變性5 min，50℃退火3 min，72℃延伸1 min，1個循環(huán)；94℃變性40 s，65℃退火40 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠分析系統(tǒng)掃描記錄，檢測擴增結(jié)果。

1．2．3 差異基因克隆與序列分析 根據(jù)電泳檢測結(jié)果，紫外燈下切割差異條帶，回收純化差異片段，進行連接和轉(zhuǎn)化，選取陽性克隆質(zhì)粒送往上海英俊生物有限公司測序。測序結(jié)果去除載體序列后在NCBI進行同源性比對。

1．2．4 實時定量PCR分析 以牛β-actin為內(nèi)參，應用Primer Premier 5．0軟件對獲得的差異基因序列設計引物（表1）。提取8月齡和30月齡閹?？俁NA后，采用Prime ScriptTMRT-PCR 試劑盒（TaKaRa 公司）制備cDNA，然后用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa 公司）進行實時定量PCR，每個樣品重復測定3次。計算各個樣品目的基因的Ct值和各自內(nèi)參β-actin的Ct值，基因表達水平以相對表達量的平均值±標準偏差來表示，并用SPSS13．0統(tǒng)計軟件對樣本進行單因素方差分析。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2．1 延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達基因 通過20對ACP引物PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳共獲得9條8月齡和30月齡閹牛個體背最長肌差異表達ESTs，結(jié)果見圖1。

2．2 差異片段的同源性比較分析 將差異片段回收后進行測序，將測序獲得的各個序列在NCBI網(wǎng)站上進行比對，共獲得9條牛的cDNA序列，與8月齡閹牛相比，有6個基因在30月齡閹牛背最長肌中表達水平下調(diào)，3個基因表達水平上調(diào)，見表2。

2．3 實時定量PCR檢測部分差異基因 以牛β-actin基因為對照，采用實時定量PCR檢測，結(jié)果見圖2。MYH7、MSTN和SPP1基因在8月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的mRNA表達豐度顯著高于30月齡個體（P＜0．05）。Telethonin和Camk2d基因在30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的mRNA表達豐度顯著高于8月齡個體（P＜0．05）。

圖1 差異表達基因片段篩選電泳圖結(jié)果

圖2 部分差異基因的實時定量PCR檢測結(jié)果

表2 延邊黃牛閹牛背最長肌部分差異表達基因

3 討 論

ACP技術是Hwang等[11]建立的一種鑒定差異表達基因的方法，已在動物發(fā)育和植物相關差異表達基因的克隆中得到廣泛應用。吳奎等[12]利用ACP技術對尼羅羅非魚雌雄魚肌肉組織差異表達基因進行了篩選，共獲得8條ESTs。賈錫偉等[13]利用ACP技術對日本囊對蝦性腺差異表達基因進行了篩選。本實驗通過ACP技術對2個發(fā)育階段（8月齡和30月齡）延邊黃牛閹牛肌肉組織中共篩選獲得9條表達序列標簽。應用熒光定量PCR方法對其中5個差異基因進行了鑒定，Telethonin、SPP1基因在30月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的表達量顯著高于8月齡。MYH7、MSTN和Camk2d基因在8月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中的表達量顯著高于30月齡。初步篩選到Telethonin、SPP1、MYH7、MSTN和Camk2d等基因可能是調(diào)控延邊黃牛閹牛肉質(zhì)、生長性狀的重要基因。

通過對篩選到的差異表達基因深入分析發(fā)現(xiàn)，參與細胞代謝的細胞因子信號負調(diào)控因子-8（ASB8）在8月齡延邊黃牛閹牛背最長肌中表達上調(diào)。楊忠誠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，咸寧黃牛SOCS4基因多態(tài)性與生長性狀存在關聯(lián)。本實驗結(jié)果提示，ASB8基因可能與延邊黃牛肌肉分化相關，該基因在延邊黃牛生長發(fā)育過程中具有重要作用。鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶Ⅱ（Calcium/Calmodulin-Dependent protein Kinase II,CAMK II）是一種體內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，由α、β、γ、δ4種亞基組成。目前已發(fā)現(xiàn)，CAMK II基因參與多種細胞活動的調(diào)控[15]。鈣/鈣調(diào)依賴性蛋白激酶Ⅱδ亞基（Camk2d）是該家族成員之一，在體內(nèi)廣泛表達[16]。劉勇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Camk2d基因在大鼠脂肪組織中表達，參與了脂肪細胞分化的調(diào)控。肌內(nèi)脂肪是影響牛肉品質(zhì)的重要因素之一，脂肪含量的多少將影響牛肉的風味和嫩度。本實驗發(fā)現(xiàn)，Camk2d基因在30月齡延邊黃牛背最長肌表達量顯著降低，提示該基因可能是影響延邊黃牛肉質(zhì)性狀的重要基因。

基因與骨骼肌的構(gòu)成密切相關。Telethonin是一種重要的肌節(jié)蛋白，在肌原纖維的組裝過程中發(fā)揮重要的作用[18]。肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）最顯著作用是對骨骼肌的生長具有負調(diào)控作用，通過抑制動物成肌細胞的增殖和分化抑制骨骼肌生長發(fā)育。MSTN基因已被證實與動物生長性狀密切相關。閔令江等[19]研究顯示，山羊MSTN基因多態(tài)性與山羊肉用性狀顯著相關。梁春年等[20]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛MSTN基因內(nèi)含子2多態(tài)性與生長性狀顯著相關。目前，MSTN基因在動物肌肉發(fā)育過程中表達的變化已有研究報道。劉丹等[21]研究發(fā)現(xiàn)隨著豬日齡增加，MSTN基因表達量顯著下降。Nicholas等[22]研究發(fā)現(xiàn)Telethonin能夠調(diào)節(jié)MSTN分泌，抑制MSTN的活性。本實驗中Telethonin在30月齡延邊黃牛閹牛肌肉中高表達，而MSTN基因低表達，提示以上2個基因在延邊黃牛生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但具體機制有待于進一步研究。在篩選到的差異表達基因中，將Telethonin和MSTN差異片段回收后進行測序，將測序獲得的各個序列在NCBI網(wǎng)站上進行比對，共獲得9條牛的cDNA序列，與8月齡閹牛相比，有6個基因在30月齡閹牛背最長肌中表達水平下調(diào)，3個基因表達水平上調(diào)。本研究對不同發(fā)育階段延邊黃牛閹牛背最長肌差異表達基因進行了初步篩選，為延邊黃牛分子育種提供了理論基礎。在實驗中只通過20對ACP引物進行了差異基因的初步篩選，獲得差異基因較少，下一步應進一步挖掘影響延邊黃牛生長、肉質(zhì)性狀的基因。

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Screening and Ιdentif i cation of the Dif f erentially Expressed Genes in Dif f erent Development Stages of Yanbian Steers Longissimus Dorsi Muscles

TⅠAN Wan-nian1,2, LⅠ Xiang-zi3, XⅠA Guang-jun3, JⅠN Xin3, YAN Chang-guo3*
(1. College of Animal Science, Jilin Agricultural Science And Technology College, Jilin Jilin 132101,China; 2. Key Lab of Preventive Veterinary Medicine in Jilin Province, Jilin Jilin 132101,China; 3. College of Agriculture, Yanbian University, Jilin Yanji 133002,China)

Annealing control primer (ACP) system was applied to find differentially expressed genes(DEGs) in the longissimus dorsi muscle between 8 and 30 months of age. Using 20 arbitrary ACP primers, we identif i ed and sequenced 9 DEGs. The expression patterns were conf i rmed for fi ve genes (Telethonin,MYH7, MSTN, Camk2dandSPP1) using realtime PCR. The expressions ofMYH7,MSTNandSPP1were higher in the 8 months old than that in 30 months (P＜0.05), The expressions of theCamk2dandTelethoninwere higher in the 30 months than that in 8 months (P＜0.05). All the DEGs were screened by ACP system, which may considered as the most important genes involved in growth and meat quality traits.Key words: Yanbian yellow cattle; Annealing control primer (ACP) system; Differential expression genes(DEGs); Real-time quantitative PCR

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-040

2016-07-06；

2016-07-28

吉林省科技發(fā)展計劃項目（20150623004TC）；吉林省重點學科培育項目（吉農(nóng)院合字[2015]第x030號）；吉林農(nóng)業(yè)科技學院種子基金項目（吉農(nóng)院合字[2014]第Z07號）

田萬年（1980-），男，吉林長春人，講師，博士，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail:wannian2000@hotmail．com

* 通訊作者：嚴昌國（1960-），男，吉林延吉人，教授，主要從事黃牛育種研究，E-mail: ycg@ybu．edu．cn