15N自然豐度法分析甘蔗及近緣屬野生種固氮效率

羅 霆，李長寧，李毅杰，謝金蘭，梁強(qiáng)，劉曉燕，王維贊，周忠鳳，李楊瑞

15N自然豐度法分析甘蔗及近緣屬野生種固氮效率

羅 霆，李長寧，李毅杰，謝金蘭，梁強(qiáng)，劉曉燕，王維贊，周忠鳳*，李楊瑞*

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)試驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)試驗(yàn)室，南寧530007）

利用15N同位素自然豐度法，在連續(xù)兩年不施氮肥條件下，對(duì)甘蔗及近緣屬野生種（材料）的固氮效率進(jìn)行對(duì)比分析，同時(shí)篩選出適宜本試驗(yàn)研究的參比植物。試驗(yàn)結(jié)果表明，河八王及其后代材料表現(xiàn)出明顯的高固氮能力，最高固氮率達(dá)到36.13%，最低的為甘蔗栽培種ROC22，固氮率僅為5.72%。銀膠菊、勝紅薊和狗尾草與河八王1-1號(hào)的δ15N值之差為3.13～3.50，是分析甘蔗及近緣屬野生種固氮效率較理想的參比植物。

甘蔗近緣屬；15N自然豐度法；河八王；固氮效率

甘蔗是重要的糖料和能源作物。廣西是僅次于巴西圣保羅的世界第二大產(chǎn)糖?。▍^(qū)），甘蔗栽培面積占全國的65%以上，年產(chǎn)糖8500萬噸左右。氮是甘蔗的重要元素，甘蔗植株氮含量占干重的0.3%～2%，每生成1t蔗糖需氮7 kg。廣西每年氮肥投入約55萬噸，折合人民幣9.3億元。在產(chǎn)量相當(dāng)?shù)那闆r下，廣西氮肥用量為100～755 kg/hm2，是巴西的6～10倍，超過世界平均水平的3倍以上，而收獲物中肥料氮含量僅為7.5萬噸，氮肥利用效率不到15%[1]。大量、單一的化學(xué)氮肥施用使得甘蔗生產(chǎn)成本居高不下，同時(shí)造成硝酸鹽累積和土壤理化性質(zhì)破壞[2-3]。在持續(xù)提高甘蔗產(chǎn)量的同時(shí)，控制或降低氮肥的施用量，已經(jīng)成為甘蔗種植國面臨的重要科學(xué)問題[4-5]。

研究報(bào)道指出，一些甘蔗品種通過與內(nèi)生細(xì)菌聯(lián)合固氮，能為植株提供大量的氮素，但不同甘蔗基因型在氮肥利用效率上有較大差異，巴西甘蔗品種通過固氮提供所需氮素的25%～85%[6]；墨西哥的甘蔗品種固氮率在10%～67%[7]；泰國品種約30%[8]；我國報(bào)道的甘蔗品種固氮率在10%~30%之間[9-10]。甘蔗的聯(lián)合固氮是一個(gè)受環(huán)境條件、固氮菌種類、甘蔗基因型等多因素影響的復(fù)雜生理生化過程，但基因型的差異是其中的最主要原因。為此，甘蔗高固氮及氮高效品種選育是解決我國甘蔗大量施用氮肥和氮肥利用效率低的最重要途徑。

甘蔗遠(yuǎn)緣雜交是將野生種屬中的有利基因轉(zhuǎn)入甘蔗品種（系），從而創(chuàng)造變異，是獲得優(yōu)良新品種或育種中間材料的有效途徑。河八王屬河八王（Narenga porphyrocoma）、蔗茅屬斑茅[Erianthus arundinacius（Retz.）Jesws.]和甘蔗屬野生種割手密（Saccharum spontaneum L.），在常年低氮條件下不表現(xiàn)缺氮癥狀并保持高生物量的氮高效特性，同時(shí)兼具抗逆性、適應(yīng)性、分蘗及宿根性等方面的優(yōu)勢，使其成為國內(nèi)外甘蔗種質(zhì)資源創(chuàng)新研究利用的熱點(diǎn)。但目前還沒有將甘蔗及近緣屬野生基因資源應(yīng)用于甘蔗氮高效育種并建立有效的育種技術(shù)體系的研究報(bào)道，且對(duì)其氮高效的生理生態(tài)機(jī)制也缺乏深入研究。本研究通過在低氮條件下對(duì)甘蔗近緣屬斑茅和河八王以及甘蔗屬野生種割手密固氮效率的研究，探討斑茅、河八王和割手密在甘蔗氮高效基因型選育中的利用價(jià)值，以期為甘蔗野生基因資源應(yīng)用于甘蔗氮高效育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

參試材料來自廣西甘蔗資源圃，包括河八王、桂糖系列新品種（系）、新臺(tái)糖、斑茅、割手密、斑茅割手密復(fù)合體及其與甘蔗的雜交后代。用于同位素自然豐度法測定的參比植物為木薯及農(nóng)田中自然生長的銀膠菊、勝紅薊、狗尾草和抓根草。參試材料見表1。

1.2 方法

1.2.1 種植和取樣方法 試驗(yàn)材料于4月5日種植于廣西農(nóng)科院甘蔗研究所試驗(yàn)場，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3個(gè)重復(fù)。全生育期不施肥，不除草。在伸長期（7月2日）取樣測定。取甘蔗及近緣屬材料+2葉，取參比植物第2張成熟葉，放入通風(fēng)干燥器內(nèi)，在70℃以下烘干48h，將葉片用粉碎機(jī)粉碎后過0.5mm細(xì)篩，裝入密封塑料袋備用。

1.2.2 固氮效率測定方法 甘蔗及近緣屬材料伸長期固氮能力測定采用15N自然豐度法[11]。將備用樣品送上?；ぱ芯吭?，利用比例同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行同位素測定。

固氮效率計(jì)算：%Nfixed=（15Nref-15Nfield）/（15Nref-15Nhydro）

其中15Nref代表參比植物，即與固氮植物生長在相同環(huán)境下的非固氮植物組織的δ15N值，δ15Nfield代表野外固氮植物組織的δ15N值，15Nhydro代表在無氮溶液中水培生長的固氮植物組織的δ15N值（本研究中15Nhydro以δ15Nfield-0.002的差值代替）。

15N原子百分超計(jì)算：

其中 δ15N為樣品的15N與大氣15N的千分差，atom%15N（sample）為樣品15N原子豐度，atom%15N（standard）為大氣標(biāo)準(zhǔn)15N原子豐度。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析方法 數(shù)據(jù)整理、分析用Excel軟件和SPSS14.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 參比植物選擇

利用15N自然豐度法計(jì)算植物固氮效率，對(duì)參比植物的要求較高。本試驗(yàn)參比植物有木薯、銀膠菊、勝紅薊、狗尾草和抓根草。一般來說，固氮植物和非固氮植物的atom%15N之差約為3～5δ15N值[12]，本試驗(yàn)所用參比植物的atom%15N及與所有參試材料中atom%15N較小的河八王1號(hào)的atom%15N之差列于表2。結(jié)果表明，供試參比植物的atom%15N介于0.36984～0.37249之間，與河八王1號(hào)的atom%15N之差介于2.42～8.50之間，說明在本試驗(yàn)中，以勝紅薊、狗尾草和銀膠菊為非固氮的參比植物，能計(jì)算出較合理的固氮效率。

2.2 甘蔗及近緣屬材料固氮能力比較

選取銀膠菊為參比的非固氮植物，計(jì)算出參試材料的固氮效率（表3）。在本試驗(yàn)連續(xù)兩年不施氮肥和以銀膠菊為參比的情況下，固氮效率最高的是NSF110，達(dá)到36.13%，其次是河八王1-1號(hào)和河八王2-6號(hào)，固氮率分別為26.64%和25.25%。其中NSF110為河八王1-1號(hào)與甘蔗栽培種的雜交F1。ROC22固氮效率最低，僅為5.72%。ROC22為當(dāng)前廣西的甘蔗主栽品種，其具有高產(chǎn)高糖等優(yōu)良特性，但在栽培上對(duì)氮肥的需求量較大。

3 討論

利用15N自然豐度法估計(jì)固氮植物的生物固氮比例，一般要求參比植物與固氮植物有相似的物候特征、根系分布特征、形態(tài)特征，并且參比植物利用與固氮植物相似的土壤氮源，反映出固氮植物所利用的土壤氮素的15N豐度，否則會(huì)產(chǎn)生很大誤差[13]。為了減少測量結(jié)果的誤差，本研究選取與參試植物在同一地塊生長的木薯及一些草本植物作為參比，并最終選擇δ15N差值為3.50的銀膠菊作為參比植物計(jì)算固氮效率，得到的固氮效率在5.72%～36.13%之間，說明所選參比植物是合理的。

參試的甘蔗及近緣屬材料中，河八王及其部分后代材料表現(xiàn)出明顯的高固氮能力，說明其體內(nèi)很可能存在高效的氮轉(zhuǎn)化利用機(jī)制。而在當(dāng)前的甘蔗選育中，對(duì)河八王的研究和利用鮮見報(bào)道，對(duì)其高固氮生理機(jī)制的研究更是空白，本項(xiàng)目組計(jì)劃在下一步開展相關(guān)研究。本研究中斑茅和割手密及其后代材料沒有表現(xiàn)出明顯的固氮優(yōu)勢，但在實(shí)際中，斑茅和割手密對(duì)貧瘠缺氮環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，有可能本研究僅分別選擇了1個(gè)斑茅和1個(gè)割手密及其后代，研究對(duì)象太少，故此不能真實(shí)反映出不同基因型的斑茅和割手密的真實(shí)固氮能力和氮利用效率。

表1 參試材料

表2 參比植物的atom%15N及與河八王1-1 號(hào)的atom%15N 之差

表3 苷蔗及近緣屬材料固氮效率

[1]Robinson N,Brackin R,Vinall K,Soper F,Holst J,Gamage H,Paungfoo Lonhienne C,Rennenberg H,Lakshmanan P,Schmidt S. Nitrate paradigm does not hold up for sugarcane[J].PloS One,2011,6(4):e19045.

[2]Ju X,Xing G,Chen X,Zhang S,Zhang L,Liu X,Cui Z,Yin B,Christie P,Zhu Z,Zhang F.Reducing environmental risk by improving N management in intensive Chinese agricultural systems[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 2009,106(9):3041-3046.

[3]Guo J,Liu X,Zhang Y,Shen J,Han W,Zhang W,Chrisie P,Goulding K,Vitousek P,Zhang F.Significant acidification in major Chinese croplands[J].Science 2010,327(5968):1008-1010.

[4]Woolf D,Amonette J E,Street-Perrott F A,Lehmann J,Joseph S.Sustainable biochar to mitigate global climate change[J].Nature Communications,2010,1(3):118-124.

[5]Thorburn P,Biggs J,Webster A,Biggs I.An improved way to determine nitrogen fertilizer requirements of sugarcane crops to meet global environmental challenges[J].Plant and Soil,2011,339(1):51-67.

[6]Boddey R M,Polidoro J C,Resende A S,Alves B J R,Urquiaga S.Use of the15N natural abundance technique for the quantification of the contribution of N2fixation to sugar cane and other grasses[J].Australian Joumal of Plant Physiology,2000,28(9):889-895.

[7]Fuentes-Ramirez LE,Bustillos-Cristales R,Tapia-Hernandez A,Jimenez-Salgado T,Wang ET,Martinez-Romero E,Caballero-Mellado J.Novel nitrogen-fixing acetic acid bacteria,Gluconacetobacter johannae sp.nov.and Gluconacetobacter azotocaptans sp. nov.,associated with coffee plants[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2001,51(4):1305-1314.

[8]Ando S,Meunchang S,Thippayarugs S,Prasertsak P,.Matsumoto N,Yoneyama T.Evaluation of sustainability of sugarcane production in Thailand based on nitrogen fixation,efficiency of nitrogen fertilizer and flow of organic matters[J].JIRCAS Working Report,2002,30:61-64.

[9]Luo T,Ou-Yang X Q O-Y,Yang L T,Li Y R,Song X P,Zhang G M,Gao Y J,Duan W X,An Q L.Raoultella sp.strain L03 fixes N2in association with micropropagated sugarcane plants[J].Journal of Basic Microbiology,2016,56(8):934-940.

[10]Lin Li,Zhengyi L,Chunjing H,Xincheng Z,Siping C,Litao Y,Yangrui L,and Qianli A.Plant growth-promoting nitrogen-fixing enterobacteria are in association with sugarcane plants growing in Guangxi,China[J].Microbes&Environ.,2012,27(4):391-398.

[11]何道文，孫輝，黃雪菊.利用15N自然豐度法研究固氮植物生物固氮量[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2004，21（1）：132-137.

[12]Amarger N,Mariotti A,Mariotti F,Curr J C,Bourguignon C,Lagacherie B.Estimate of symbiotically fixed nitrogen in field grown soybeans using variations in15N Natural abundance[J].Plant and soil,1979,52(2):269-280.

[13]Rennie D A,Paul E A,Johns L E.Natural nitrogen-15 abundance of soil and plant samples[J].Canadian Journal of Soil Science, 1976,56(1):43-50.

Identification of Biological Nitrogen Fixation Efficiency in Sugarcane and its Related Genera by15N Natural Abundance Method

LUO Ting,LI Chang-ning,LI Yi-jie,XIE Jin-lan,LIANG Qiang,LIU Xiao-yan, WANG Wei-zan,ZHOU Zhong-feng*,LI Yang-rui*

(Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Science/Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement(Guangxi),China Ministry of Agriculture,Nanning 530007)

The nitrogen fixation efficiency of sugarcane and its related genera were analyzed by15N natural abundance method for two consecutive years without nitrogen fertilizer application.The results showed that the Narenga porphyrocoma(Hance)Bor.and it's progeny had relatively higher nitrogen fixation rate(NFR)compared with other sugarcane and related genera,the highest NFR reached 36.13%,and the lowest was commercial varieties ROC22 of 5.72%.The differences of δ15N between the Narenga porphyrocoma (Hance)Bor and the reference plants(guayule,tropic ageratum herb and green bristlegrass)ranged from 3.13 to 3.50,which were ideal reference plants to calculate nitrogen fixation efficiency in sugarcane and its related genera.

related genera of sugarcane;15N natural abundance method;Narenga porphyrocoma (Hance)Bor.; nitrogen fixation efficiency

S566.103

A

1007－2624（2017）01－0004－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.002

2016-11-04

廣西農(nóng)科院科技發(fā)展基金“斑割復(fù)合體雜交利用過程中特異性基因遺傳重組研究”（桂農(nóng)科2016YM04）和甘蔗新品種桂糖47號(hào)中試與示范（農(nóng)成轉(zhuǎn)2016001）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目“河八王片段代換系構(gòu)建及特異基因遺傳分析”（2014GXNSFBA118115）；廣西“八桂學(xué)者”專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)。

羅 霆（1980-），女（壯族），廣西鹿寨人，副研究員，研究方向：甘蔗生理，郵箱：seafair@163.com

李楊瑞（1957-），男，廣西北流人，教授，研究方向：甘蔗生理，郵箱：liyr@gxaas.net周忠鳳（1974-），女，高級(jí)農(nóng)藝師，研究方向：甘蔗新品種選育及栽培生理，郵箱：445708586@qq.com