半胱氨酸鏈蛋白及其在聽覺形成中的作用

張世麗 郭維維 喬月華，3 楊仕明

1 半胱氨酸鏈蛋白（cysteine string protein，CSP）的發(fā)現(xiàn)和基本概述

CSP首次發(fā)現(xiàn)于果蠅中，因該蛋白存在由11個連續(xù)的半胱氨酸形成的半胱氨酸串狀結(jié)構(gòu)，因此發(fā)現(xiàn)者將其命名為半胱氨酸鏈蛋白[1]。隨后，在太平洋電鰩[2]和哺乳動物（如大鼠、小鼠、牛等）中也證實有CSP的存在[3，4]，并發(fā)現(xiàn)CSP位于突觸囊泡上[5]。早期研究認(rèn)為CSP僅存在于神經(jīng)元細胞，但隨后的研究證實CSP也表達于一些非神經(jīng)元細胞的分泌顆粒中，包括內(nèi)分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌以及外分泌細胞[3，4]。哺乳動物有3個CSP編碼基因，分別編碼CSPα，β，γ3個亞型，CSPα是最主要的一個亞型，在許多細胞特別是幾乎所有的神經(jīng)元細胞中均有表達。與此CSPα不同的是CSPβ和CSPγ的表達范圍較局限，目前報道，CSPβ表達于睪丸組織、腦組織以及耳蝸毛細胞中[6]，而CSPγ只在睪丸組織中表達[7]。雖然CSPβ的生物學(xué)功能尚不清楚，但它與CSPα具有高度的同源性，因此猜測兩者具有相似的生物學(xué)功能，然而，研究者對CSPγ氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)其與CSPα氨基酸序列差異較大，故分析其功能可能與其他2個亞型存在較大差異[8]。

2 CSP的蛋白質(zhì)序列

對CSP進行序列分析發(fā)現(xiàn)該蛋白包含4個結(jié)構(gòu)域，見圖1。①N-端J結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域高度保守，為酵母菌DnaJ/Hsp分子伴侶家族的特征性結(jié)構(gòu)域，因此，CSP是DnaJ/HSP分子伴侶家族的一員。在CSP的J結(jié)構(gòu)域具有特征性的HPD模體結(jié)構(gòu)，與Hsp 70/Hsc 70相結(jié)合，并激活Hsp 70/Hsc 70的ATP酶以及改變結(jié)合Hsc 70的底物的聚合[9]；②疏水中心半胱氨酸串區(qū)域，該區(qū)域高度棕櫚酰化，與CSP的膜黏附有關(guān)；③保守的連接結(jié)構(gòu)域，連接J結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸串結(jié)構(gòu)域，高度保守，有研究認(rèn)為該結(jié)構(gòu)域?qū)SP參與胞外分泌過程具有重要作用；④多樣性的C端結(jié)構(gòu)域，DnaJ的C端結(jié)構(gòu)域可連接CSP的底物蛋白[10]。

圖1 人類CSPα的結(jié)構(gòu)域。從左到右依次為絲氨酸磷酸化位點、J結(jié)構(gòu)域上的HPD模體、連接結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸串結(jié)構(gòu)域、C端結(jié)構(gòu)域[11]

3 CSP的功能

在對果蠅CSP無義突變體進行研究時發(fā)現(xiàn)，CSP具有重要的功能。這種突變導(dǎo)致大部分果蠅在未發(fā)育成熟時就已經(jīng)死亡，只有小部分能存活到成年，但往往發(fā)育成溫度敏感型癱瘓表型并且壽命較野生型明顯縮短[12，13]。對存活突變果蠅幼體的神經(jīng)肌肉連接進行研究發(fā)現(xiàn)，CSP缺失嚴(yán)重降低正常溫度范圍內(nèi)誘發(fā)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，果蠅在高于正常溫度時的神經(jīng)遞質(zhì)釋放幾乎停止[7]?；谝陨涎芯砍晒?，研究者對CSP在突觸囊泡中的具體功能進行了更為深入的研究。

3.1 CSP調(diào)節(jié)鈣離子通道

有學(xué)者認(rèn)為CSP通過增加鈣離子通道的活性促進遞質(zhì)釋放[14]，然而，在tsa-201細胞，CSP與瞬時表達的N型鈣離子通道共表達產(chǎn)生一種由Gβγ介導(dǎo)的鈣離子通道緊張性抑制[15]。因此，鈣離子通道的調(diào)控模式或許依賴于蛋白環(huán)境。

目前為止，CSP敲除小鼠和果蠅并沒有就CSP介導(dǎo)調(diào)控突觸前膜鈣離子通道提供直接的證據(jù)[16]。盡管如此，CSP突變果蠅表現(xiàn)為突觸前膜鈣離子水平升高[17]，CSPα敲除小鼠的神經(jīng)肌肉連接處也可能表現(xiàn)出鈣離子水平增高[16]。CSPα很可能調(diào)節(jié)異三聚體G蛋白與Hsc 70和SGT（small glutamine-rich tetratricopeptide repeatcontaining protein）結(jié)合，CSPα通過單獨的連接位點與G蛋白的α-和βγ亞基相連，并與任一連接位點相互作用引出N型鈣離子通道的緊張性抑制[15]。CSP與P/Q型鈣離子通道之間的相互作用也被注意到，但這種作用的功能尚不清楚。

3.2 CSP的分子伴侶功能

果蠅CSP突變可產(chǎn)生溫度誘發(fā)性表型，而CSP是DnaJ分子伴侶家族的一員，具有典型的J結(jié)構(gòu)域，能與Hsp 70/Hcs 70結(jié)合[18]，由此人們做出假設(shè)，認(rèn)為CSP具有分子伴侶的功能。為了證明這一假設(shè)，研究者進行了相關(guān)實驗[19，20]。

最初研究發(fā)現(xiàn)，CSP像其他DnaJ蛋白一樣，可以與變性的蛋白質(zhì)結(jié)合。此外，CSP與Hsc 70協(xié)同作用防止變性蛋白質(zhì)聚集，顯示這兩個蛋白能夠發(fā)揮分子伴侶的功能[10]。Tobaben等人證明CSP/SGT/Hsc 70復(fù)合體構(gòu)成了一個位于突觸囊泡表面的突觸伴侶結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可使鄰近突觸囊泡表面的錯誤折疊的蛋白質(zhì)重新折疊，從而使變性失活的蛋白質(zhì)恢復(fù)活性[20]。

3.3 CSP與SNARE蛋白相互作用

目前的數(shù)據(jù)表明，雖然CSP或許具有調(diào)節(jié)鈣離子通道的功能，但它一定也在胞吐機制中發(fā)揮直接作用。CSPα過表達提高PC12細胞的胞吐功能[21]，但抑制胰島素分泌細胞的胞外分泌功能[22]。腎上腺嗜鉻細胞中過表達CSPα通過減少釋放次數(shù)以及減緩釋放動力學(xué)，破壞兒茶酚胺的分泌，說明CSP調(diào)節(jié)涉及膜融合步驟的蛋白質(zhì)[23]。

小泡締合性膜蛋白（vesicle-associated membrane protein，VAMP)和突觸融合蛋白（syntaxin-1）以及SNAP-25（soluble attachment proteins-25）相互作用，組成一個非常穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體[27]。SNARE蛋白復(fù)合體是突觸前囊泡釋放運動的基本蛋白質(zhì)，也因此被認(rèn)為可能是CSP的作用底物。在果蠅體內(nèi)，當(dāng)只有CSP的過表達時對果蠅幼體神經(jīng)肌肉接頭處的囊泡釋放遞質(zhì)活動沒有明顯的影響，但能抑制因突觸融合蛋白1A（syntaxin-1A）過表達導(dǎo)致的囊泡釋放遞質(zhì)活動下降，表明CSP調(diào)節(jié)突觸融合蛋白（syntaxin-1）之間的相互作用[25]。在CSPα基因敲除小鼠，SNAP-25、SNAP-23、α-synuclein（α-突觸核蛋白）、Hsp 70，Hsc 70以及聚合的SNARE復(fù)合體的水平下降[29]。SNARE同時與Hsc 70和CSP相連，共同調(diào)節(jié)突觸囊泡的胞吐過程。

4 CSP對突觸的神經(jīng)保護作用

通過對CSP突變果蠅進行研究發(fā)現(xiàn)，CSP具有重要的神經(jīng)保護作用。隨后對CSPα敲除小鼠進行分析，CSP的神經(jīng)保護作用表現(xiàn)更為突出。在敲除鼠出生后2周內(nèi)，表現(xiàn)正常，并沒有出現(xiàn)任何神經(jīng)遞質(zhì)缺失癥狀[7]，但是，在2～4周敲除鼠即出現(xiàn)進行性致命性感覺運動功能損傷，并且在大約出生后8周死亡[7]。這些CSPα敲除小鼠還表現(xiàn)出廣泛迅速的視網(wǎng)膜感光細胞退行性病變[27]，對敲除小鼠進行更為詳細的分析顯示，神經(jīng)肌肉接頭處的突觸囊泡循環(huán)遭到破壞[28]。

目前，尚不清楚為何完全缺乏CSP會導(dǎo)致果蠅有大約95%的胚胎死亡，而對CSP敲除線蟲和小鼠的生育和早期生存能力卻沒有影響，這可能反映了CSP在果蠅發(fā)育過程中發(fā)揮特殊的功能。老年秀麗隱桿線蟲dnj-14突變體神經(jīng)退行性病變首先影響感覺神經(jīng)元，而且實際上在神經(jīng)退行性病變明顯之前這些動物就表現(xiàn)出嚴(yán)重的化學(xué)感覺神經(jīng)元功能損壞[29]。

5 CSP與神經(jīng)退行性疾病

近年人們逐漸發(fā)現(xiàn)CSP與人類一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病有直接關(guān)系。有報道稱編碼CSPα蛋白的DNAJC5基因發(fā)生突變，導(dǎo)致成年神經(jīng)元蠟質(zhì)樣脂褐素沉積?。╝dult-onset neuronal ceroid lipofuscinosis，ANCL）[30]。研究者發(fā)現(xiàn)在DNAJC5基因中有兩個致病突變位點c.346_348delCTC和c.344T＞G，這兩個突變分別導(dǎo)致半胱氨酸串結(jié)構(gòu)域中的p.Leu116del缺失和p.Leu116del改變，從而影響CSPα的棕櫚?；约癈SPα在神經(jīng)元細胞中的數(shù)量。這些改變導(dǎo)致突觸前膜功能破壞，神經(jīng)進行性退變，錯誤折疊的蛋白質(zhì)和不能水解的蛋白質(zhì)以脂質(zhì)沉積的形式在溶酶體內(nèi)蓄積[30]。在ANCL臨床早期階段，神經(jīng)纖維沒有或僅有很少的CSPα表達減少，而在該疾病晚期病例的腦組織勻漿樣本中CSPα，SNAP-25表達量明顯下降[31]。還有報道稱CSPα在阿爾茨海默病中也發(fā)揮保護作用[32]。在疾病的早期，前腦中的CSPα表達量減少，這種改變可能影響突觸退變的早期階段。然而有趣的是，患者小腦組織中的CSPα的表達量上調(diào)，甚至能達到年輕人健康水平，這或許是一種保護腦組織的機制[32]。

6 CSP與聽覺產(chǎn)生

傳入到內(nèi)耳的聲音信號是通過對毛細胞產(chǎn)生機械刺激，引起其釋放神經(jīng)遞質(zhì)，從而造成傳入神經(jīng)元興奮而引發(fā)動作電位，而將興奮傳入聽覺中樞系統(tǒng)。毛細胞的纖毛受到機械刺激后，可打開其機械換能通道，鉀離子和鈣離子在電壓差的作用下由中階（內(nèi)淋巴液，高鉀）進入毛細胞，使毛細胞電位升高，引起電壓依賴性鈣通道的打開，使毛細胞去極化。與其他神經(jīng)細胞和感受器不同，毛細胞本身不產(chǎn)生動作電位，而是產(chǎn)生感受器電位，促進毛細胞底部的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。用熒光標(biāo)記的實驗方法發(fā)現(xiàn)這些鈣通道分布在內(nèi)毛細胞側(cè)底部稱為突觸前膜興奮區(qū)的部位[33]。

內(nèi)毛細胞的電壓依賴性鈣通道對產(chǎn)生毛細胞感受器電位至關(guān)重要。內(nèi)毛細胞的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)為谷氨酸，在毛細胞內(nèi)有許多谷氨酸的突觸囊泡。內(nèi)毛細胞內(nèi)存在一種稱為突觸帶的獨特結(jié)構(gòu)，突觸帶是一橢圓的電子密集體，直徑小于1μm，可附著約100個突觸囊泡[34]。耳蝸內(nèi)神經(jīng)纖維按功能可分為傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)纖維，其中的傳入神經(jīng)是將聽覺信息傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的唯一通道。內(nèi)毛細胞直接與所有的Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形成突觸并組成輻射狀傳入神經(jīng)纖維進入腦干的蝸核，外毛細胞的傳入神經(jīng)起源于為數(shù)不多的Ⅱ型螺旋神經(jīng)節(jié)細胞。外側(cè)橄欖耳蝸系統(tǒng)起源于同側(cè)上橄欖復(fù)合體外側(cè)，對內(nèi)毛細胞與Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細胞形成的傳入突觸進行反饋調(diào)節(jié)；內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸系統(tǒng)起源于上橄欖復(fù)合體的內(nèi)側(cè)核，其神經(jīng)纖維大部分交叉到對側(cè)，對外毛細胞的活動進行負反饋調(diào)節(jié)。

傳統(tǒng)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸囊泡中含有突觸蛋白（synapsin），突觸小泡蛋白（synaptophysin），突觸結(jié)合蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ（synaptotagminⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ），突觸融合蛋白（syntaxin-1）以及SNAP-25和VAMP，這些蛋白之間相互作用共同調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)胞吐過程。已有研究者報道在中樞神經(jīng)系統(tǒng)CSP與突觸融合蛋白（syntaxin-1）、VAMP 2相互作用并直接或間接作用于鈣離子通道[35]。其中，突觸融合蛋白（syntaxin-1）、SNAP-25和VAMP 1在毛細胞中也有表達并組成一個重要的復(fù)合體(SNARE復(fù)合體)參與神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐過程[35]。

6.1 CSP在內(nèi)毛細胞中表達

Eybalin等對CSP在耳蝸發(fā)育成熟過程中的表達和調(diào)控情況進行了研究，發(fā)現(xiàn)CSP及其mRNA在螺旋神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)毛細胞中均有表達[35]。Schmitz等用CSPα敲除鼠對視網(wǎng)膜和內(nèi)耳中的帶狀突觸進行研究發(fā)現(xiàn)，敲除CSPα導(dǎo)致小鼠視網(wǎng)膜感光細胞帶狀突觸在幼鼠睜眼之前就發(fā)生嚴(yán)重的快速的神經(jīng)退行性變，這種病變導(dǎo)致小鼠進行性眼盲[21]。相反，聽覺內(nèi)毛細胞的帶狀突觸并未出現(xiàn)類似的突觸前膜病變，聽力也未受到任何影響。這是因為內(nèi)毛細胞帶狀突觸還表達另一CSP亞型-CSPβ，可能是這一亞型代償了CSPα的功能[27]。另有研究者分離CBA小鼠的耳蝸基底膜內(nèi)外毛細胞分別進行基因測序發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細胞上表達Dnajc5b基因[36]，而這個基因正是CSPβ的編碼基因。這些研究報道說明CSP在內(nèi)毛細胞上有表達，且表達的亞型至少有1種。敲除CSPα只對視網(wǎng)膜感光細胞的帶狀突觸產(chǎn)生影響，對視網(wǎng)膜其他細胞突觸沒有明顯影響[27]。比前有研究者發(fā)現(xiàn)CSP位于內(nèi)毛細胞突觸帶的突觸囊泡上[35]。

6.2 CSP在橄欖耳蝸束神經(jīng)纖維末端表達

CSP在外側(cè)橄欖耳蝸束和內(nèi)側(cè)橄欖耳蝸束神經(jīng)纖維末端的突觸前分布存在差異[35]。大鼠出生當(dāng)天（P0）在基底膜底回內(nèi)毛細胞下的神經(jīng)纖維內(nèi)就有微弱的CSP免疫反應(yīng)，并且在此時就可觀察到CSP與突觸小泡蛋白（synaptophysin）共定位的實驗結(jié)果。大鼠出生后2天，在底回和中回的內(nèi)毛細胞以及底回第一排外毛細胞下的神經(jīng)纖維內(nèi)有這兩者的共定位免疫反應(yīng)。到出生后第四天，底回的所有外毛細胞之下的神經(jīng)纖維內(nèi)都檢測到這種共定位現(xiàn)象。出生后第8天，CSP和突觸小泡蛋白（synaptophysin）共定位于整個基底膜的所有內(nèi)外毛細胞之下[35]。

6.3 CSP與內(nèi)毛細胞動作電位的關(guān)系

首次記錄到微音電位和聽神經(jīng)復(fù)合動作電位是耳蝸功能開始出現(xiàn)的指標(biāo)。微音電位發(fā)生在聽神經(jīng)活動之前，而復(fù)合動作電位（compound action potential，CAP）為聽神經(jīng)的同步化反應(yīng)，是數(shù)根傳入神經(jīng)纖維動作電位的空間總和，大約在大鼠出生后11～12天出現(xiàn)。與此相對應(yīng)的是，在出生12天之前的大鼠耳蝸內(nèi)毛細胞內(nèi)沒有CSP的表達，直到出生后第12天，才在基底膜底回的內(nèi)毛細胞底部檢測到微弱的CSP免疫熒光。此免疫熒光信號主要位于內(nèi)毛細胞核之下，靠近蝸軸的質(zhì)膜側(cè)。到出生后14天，內(nèi)毛細胞內(nèi)免疫熒光信號密度增強，而且中回的內(nèi)毛細胞也出現(xiàn)了CSP的表達。到出生后16天，CSP的免疫熒光信號密度達成年鼠水平[35]。

與內(nèi)毛細胞相反，在出生后大鼠耳蝸Corti氏器發(fā)育成熟的整個時期外毛細胞都不表達CSP或CSP mRNA，這可能與Ⅱ型螺旋神經(jīng)節(jié)樹突形成的突觸有關(guān)。比如，Ⅱ型神經(jīng)元不能向大腦傳遞聽覺信息或者Ⅱ型神經(jīng)元只能對非常高頻的噪聲刺激做出反應(yīng)。外毛細胞中缺乏CSP的表達表明外毛細胞進行神經(jīng)遞質(zhì)釋放的機制與內(nèi)毛細胞不同[35]。

總之，雖然CSP在內(nèi)毛細胞中的功能和作用機制尚不明確，但它與帶狀突觸的突觸囊泡關(guān)系密切，并且CSP在內(nèi)毛細胞的表達與耳蝸電位的出現(xiàn)和成熟保持同步，這表明CSP參與內(nèi)毛細胞由聲音誘發(fā)的谷氨酸釋放，進一步說明CSP與神經(jīng)遞質(zhì)釋放有關(guān)，無論是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)還是在耳蝸內(nèi)毛細胞的帶狀突觸。同時，CSP不在外毛細胞表達，說明外毛細胞神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與內(nèi)毛細胞不同[35]。

7 總結(jié)與展望

CSP作為DnaJ/Hsp 40分子伴侶家族的一員，具有重要的分子伴侶功能，能通過調(diào)節(jié)Ca2+通道以及直接與突觸囊泡膜上的SNARE復(fù)合體相互作用等方面調(diào)控突觸囊泡的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，具有重要的神經(jīng)保護功能。近來發(fā)現(xiàn)CSP與一些神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、ANCL有關(guān)。但關(guān)于CSP在耳科領(lǐng)域的研究較少，根據(jù)目前僅有的幾篇研究報道，發(fā)現(xiàn)在耳蝸基底膜內(nèi)毛細胞中至少有1種CSP亞型，且其表達情況與聽力發(fā)育相關(guān)，這說明CSP極有可能在耳科領(lǐng)域也發(fā)揮著重要的作用。但CSP在內(nèi)毛細胞中的具體功能及作用機制仍不明確，接下來仍需要大量的研究來明確CSP在內(nèi)毛細胞中的功能，并探索其與內(nèi)耳相關(guān)疾病，如聽神經(jīng)病的關(guān)系，為人類進一步認(rèn)識聽力發(fā)育以及相關(guān)疾病打下基礎(chǔ)。

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