蒙醫(yī)不同針刺法對慢性應(yīng)激抑郁大鼠額葉神經(jīng)元形態(tài)及NO—cGMP信號通路的影響

賽音朝克圖+趙賢芳+那順+景泉凱+陳福玉+黃金剛

摘要：目的 觀察蒙醫(yī)不同針刺法對抑郁模型大鼠額葉神經(jīng)元及NO-cGMP信號通路的影響，探討蒙醫(yī)不同針刺法抗抑郁作用的生物學(xué)機制。方法 雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、百憂解組、蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組、針?biāo)幗Y(jié)合組，每組8只。除正常組外，其余各組大鼠孤養(yǎng)，不可預(yù)知的應(yīng)激刺激前1 h，接受不同方式的治療。28 d后觀察大鼠行為學(xué)改變，斷頭取大鼠海馬及額葉組織，不同染色觀察額葉神經(jīng)元形態(tài)改變，應(yīng)用硝酸還原酶法和放射免疫法檢測海馬及額葉NO-cGMP含量。結(jié)果 尼氏染色結(jié)果顯示，模型組大鼠額葉神經(jīng)元錐體細胞形態(tài)不完整、排列紊亂、數(shù)量明顯減少，尼氏體變淺、大部分模糊不清；蒙醫(yī)三根平衡針組、蒙醫(yī)銀針組大鼠額葉神經(jīng)元形態(tài)尚可，尼氏體呈深藍色。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠額葉神經(jīng)元胞膜破裂、結(jié)構(gòu)不清楚，部分細胞脫落而形成空泡；蒙醫(yī)三根平衡針組、蒙醫(yī)銀針組大鼠額葉細胞排列較規(guī)則，細胞層次較豐富，神經(jīng)元胞膜較完整。與正常組比較，模型組額葉及海馬NO-cGMP含量明顯升高，各治療組均能不同程度逆轉(zhuǎn)此變化。結(jié)論 蒙醫(yī)不同針刺法可能通過調(diào)控NO-cGMP的表達而達到治療抑郁癥的目的。

關(guān)鍵詞：抑郁癥；額葉；神經(jīng)元；NO-cGMP信號通路；蒙醫(yī)針刺；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.011

中圖分類號：R245 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）04-0040-05

Effects of Different Mongolian Acupuncture Methods on Neurons Form in Frontal Lobe and NO-cGMP Signaling Pathways in Rats with Chronic Stress Depression SAI Yinchaoketu1， ZHAO Xian-fang2， NA Shun2， JING Quan-kai3， CHEN Fu-yu1， HUANG Jin-gang1 （1. Inner Mongolia International Mongolian Hospital， Hohhot 010065， China； 2. Inner Mongolia University for Nationalities， Tongliao 028000， China； 3. School of Acupuncture-moxibustion and Tuina， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract： Objective To observe the effects of different Mongolian acupuncture methods on neurons form in frontal lobe and NO-cGMP signaling pathways in rats with chronic stress depression； To explore biological mechanism of different Mongolian acupuncture methods for depression. Methods The male SD rats were randomly divided into control group， model group， fluoxetine group， Mongolian silver acupuncture group， Mongolian acupuncture “three modulation methods” group， and the combination of acupuncture with fluoxetine group （8 rats in each group）. Except for control group， other rats were kept alone. Rats receive different treatment 1 hour before stimulations. Behavior changes were observed after 28 days. Hippocampus and frontal lobe tissues were collected. Frontal lobe neurons form changes were observed through different dyeing methods. The content of NO-cGMP was detected by radioimmunoassay and nitrate reductase method. Results Results of Nissl's staining showed that the neuronal pyramidal cells in the frontal lobe of model group rats arranged disorderedly， morphology was not intact and the number was obviously reduced. Nissl's staining got shallow and the most were blurry. The form of the frontal lobe neurons in Mongolian acupuncture “three modulation methods” group and Mongolian acupuncture group were good， Nissl's staining was dark blue. HE staining results showed that cytomembrane of frontal lobe neurons in model group rats ruptured， and structure was not clear. some cells fell off and formed into cavities. In Mongolian acupuncture “three modulation methods” group and Mongolian silver acupuncture group， the frontal lobe cells arranged regularly， cellular level was rich， and the nerve cell membrane was complete. The content of NO-cGMP in frontal lobe and hippocampus tissues was significantly elevated in model group. Mongolian acupuncture， Mongolian acupuncture "three modulation methods"， fluoxetine， and the combination of acupuncture with fluoxetine treatments all could reverse the changes. Conclusion Different Mongolian acupuncture methods may treat depression through regulating and controlling the expression of NO-cGMP.endprint

Key words： depression； frontal lobe； neurons； NO-cGMP signaling pathways； Mongolian acupuncture； rats

抑郁癥作為一種心境或情感障礙性疾病，嚴重損害人類軀體多種生理指標(biāo)。目前對抑郁癥發(fā)病機制尚認識不足，因此尚缺乏有效的治療方法。蒙醫(yī)文獻記載和現(xiàn)代臨床研究顯示，蒙醫(yī)針刺療法在改善抑郁患者持續(xù)低落、興趣缺乏、樂趣喪失等核心癥狀方面療效確切[1-2]。NO-cGMP信號通路與抑郁發(fā)作密切相關(guān)[3]，一氧化氮（NO）是調(diào)控血管舒張反應(yīng)的關(guān)鍵因素，但它作為神經(jīng)系統(tǒng)重要的信使分子和神經(jīng)遞質(zhì)，參與學(xué)習(xí)、記憶在內(nèi)的多種生理過程?？赡茉谝钟舭Y的發(fā)病機制和病程中起重要作用[4-5]。環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）是一種具有細胞內(nèi)信息傳遞作用的第二信使，可被G蛋白偶聯(lián)受體激活的蛋白激酶活化，進而將胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核。在細胞凋亡、血管重塑、神經(jīng)傳遞等方面發(fā)揮著重要的生理功能[6]。本實驗通過建立慢性應(yīng)激抑郁大鼠模型，探討蒙醫(yī)不同針刺法對抑郁模型大鼠神經(jīng)元及不同腦區(qū)NO-cGMP信號通路的影響，為蒙醫(yī)針刺治療抑郁癥提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級成年雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量（200±10）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，自由飲水?dāng)z食。

1.2 主要試劑與儀器

尼氏染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），濕轉(zhuǎn)緩沖液和麗春紅染色液（北京賽諾博公司），蘇木精染液、伊紅染液和1%鹽酸乙醇分化液（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司），NO試劑盒（南京建成生物工程研究所），cGMP試劑（Biovision cGMP Direct Immunoasssay kit）。蒙醫(yī)RZ-I型電熱銀針治療儀（內(nèi)蒙古元陽中蒙科技開發(fā)有限公司），電動組織勻漿器（美國Fluka公司），F(xiàn)resco低溫冷凍離心機（美國Thermo公司），MultiSkan3酶標(biāo)儀（Thermo公司），可見分光光度計（上海光學(xué)儀器公司），37 ℃恒溫水浴鍋（廊坊市中儀國科器儀表有限公司）。

1.3 分組及造模

通過開野實驗將水平運動次數(shù)加垂直運動次數(shù)不足30次或超過120次的大鼠剔除。選取符合條件的大鼠48只，隨機分為正常組、模型組、蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組、百憂解組和針?biāo)幗Y(jié)合組，每組8只。參照文獻[7-8]方法，造模大鼠全部孤養(yǎng)，隨機接受28 d 7種不同的應(yīng)激刺激（4 ℃游泳5 min，晝夜顛倒24 h，禁食24 h，禁水24 h，夾尾3 min，水平搖晃30 min，潮濕環(huán)境24 h），以上刺激每日1種，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，且每種刺激最少3次。

1.4 處理方法

正常組：每籠飼養(yǎng)4只，正常飲水?dāng)z食，不給任何刺激。模型組：孤養(yǎng)，并接受7種不可預(yù)知的應(yīng)激刺激28 d。蒙醫(yī)銀針組：孤養(yǎng)，每日接受各種不同的應(yīng)激刺激前1 h，進行蒙醫(yī)銀針（長度：3 cm、直徑0.65 mm）刺激“巴達干穴”（位于第三胸椎下凹中）、“心穴”（位于第7胸椎下凹正中）和“黑白際穴（位于前正中線，兩乳正中的心窩處）”。針刺方法：“巴達干穴”“心穴”針尖向上斜刺0.5～1 cm，“黑白際穴”針尖向下斜刺0.5～1 cm，每次留針20 min。蒙醫(yī)三根平衡針組：孤養(yǎng)，針刺和選穴同上，每日選取1個穴位，針柄接蒙醫(yī)RZ-I型電熱銀針治療儀加溫刺激，加熱溫度為（40±1）℃，每次加溫時間20 min，防止灼傷針刺部位。第1日“巴達干穴”，第2日為“心穴”，第3日為“黑白際穴”，依次循環(huán)刺激。百憂解組：孤養(yǎng)，每日應(yīng)激刺激前1 h，將百憂解以生理鹽水配制成1 mg/mL，按照2 mg/kg體質(zhì)量灌胃給藥。針?biāo)幗Y(jié)合組：孤養(yǎng)，每日應(yīng)激刺激前1 h，行蒙醫(yī)三根平衡針組同樣方法刺激，刺激后將百憂解以生理鹽水配制成1 mg/mL，按照2 mg/kg體質(zhì)量灌胃給藥。

1.5 標(biāo)本制備

實驗第29日，大鼠開胸暴露心臟，生理鹽水灌流10 min，4%甲醛急灌10 min，慢灌20 min。斷頭取腦，去除顱骨，充分暴露腦組織，將兩側(cè)頂葉掀起，分離、剝離，取出海馬，切下額葉。上述操作均在冰盤上3 min內(nèi)完成，制作石蠟切片。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 尼氏染色 常規(guī)脫蠟，染色8 min，染色時溫度為37～50 ℃，蒸餾水洗滌2次，95%乙醇約5 s，95%乙醇脫水2 min，換用新鮮95%乙醇再脫水2 min，二甲苯透明5 min，換用新鮮的二甲苯，再透明5 min，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.6.2 HE染色 常規(guī)烤片，切片脫蠟至水，蘇木精液染色10 min，自來水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水洗1 min，0.2%氨水返藍30 s，自來水洗1 min，伊紅染色3～5 min，自來水速洗，脫水，透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.6.3 硝酸還原酶法測定海馬及額葉皮層一氧化氮含量 按試劑盒說明書制備試劑，空白管放入雙蒸水0.l mL，標(biāo)準管放入100 μmo1/L標(biāo)準應(yīng)用液0.l mL，測定管放入樣本0.1 mL?？瞻坠?、標(biāo)準管及測定管各加入混合試劑0.2 mL，混勻，37 ℃水浴60 min?？瞻坠?、標(biāo)準管及測定管各加入試劑0.2 mL，混勻，室溫靜置10 min，3500～4000 r/min離心10 min，取上清液顯色?？瞻坠?、標(biāo)準管及測定管各加入上清液0.5 mL，顯色劑0.6 mL，混勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，于550 nm波長處、0.5 cm光徑下測定各管光密度（OD）值，計算NO含量[（測定管OD值-空白管OD值）÷（標(biāo)準管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準品濃度÷待測樣本蛋白濃度]。endprint

1.6.4 放免法檢測海馬及額葉皮層cGMP含量 取適量額葉或海馬，放入盛有2 mL預(yù)冷的50 mmol/L醋酸緩沖液（pH 4.75）試管中，用勻漿器將組織粉碎研磨，將懸浮液倒入離心管中。用2 mL無水乙醇沖洗勻漿器后倒入懸浮液中，混勻，靜置5 min，3500 r/min離心15 min，收集上清液。再用75%乙醇2 mL清洗勻漿器1次，倒入同一離心管，3500 r/min離心15 min，合并上清液，于80 ℃烤箱中烘干后，4 ℃保存待測。cGMP含量測定操作按試劑盒說明進行。于酶標(biāo)儀波長450 nm處測量各孔OD值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗，若方差不齊，組間用獨立樣本的非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蒙醫(yī)不同針刺法對模型大鼠額葉神經(jīng)元病理形態(tài)的影響

尼氏染色結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠額葉神經(jīng)元錐體細胞形態(tài)不完整、排列紊亂、數(shù)量明顯減少，尼氏體變淺、大部分模糊不清；與模型組比較，百憂解組、蒙醫(yī)三根平衡針組、蒙醫(yī)銀針組大鼠額葉神經(jīng)元形態(tài)細胞形態(tài)尚可，尼氏體呈深藍色，數(shù)量較多，但與針?biāo)幗Y(jié)合組比較還有部分尼氏體溶解。結(jié)果見圖1。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠額葉神經(jīng)元胞膜破裂、結(jié)構(gòu)不清楚，胞核變小，較多細胞核固縮，部分細胞脫落而形成空泡；蒙醫(yī)三根平衡針組、蒙醫(yī)銀針組、百憂解組大鼠額葉細胞排列較規(guī)則，細胞層次較豐富，神經(jīng)元胞膜較完整，但與正常組、針?biāo)幗Y(jié)合組比較仍有部分細胞萎縮、胞核變小和核固縮。結(jié)果見圖2。

2.2 蒙醫(yī)不同針刺法對模型大鼠海馬和額葉一氧化氮的影響

與正常組比較，模型組海馬和額葉皮層NO含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，蒙醫(yī)三根平衡針組、百憂解組、針?biāo)幗Y(jié)合組海馬NO含量明顯降低（P<0.05），蒙醫(yī)銀針組NO含量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；百憂解組和針?biāo)幗Y(jié)合組額葉皮層NO含量明顯降低（P<0.05），蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組NO含量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

2.3 蒙醫(yī)不同針刺法對模型大鼠海馬和額葉環(huán)磷酸鳥苷的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬和額葉皮層組織cGMP含量明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組、百憂解組、針?biāo)幗Y(jié)合組海馬cGMP含量明顯降低（P<0.05），百憂解組、蒙醫(yī)銀針組與蒙醫(yī)三根平衡針組cGMP含量相當(dāng)，針?biāo)幗Y(jié)合組cGMP含量明顯低于蒙醫(yī)三根平針組（P<0.05）；蒙醫(yī)三根平衡針組、百憂解組、針?biāo)幗Y(jié)合組額葉皮層cGMP含量明顯降低（P<0.05），蒙醫(yī)銀針組cGMP含量降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表2。

3 討論

抑郁癥是病因不明的情感障礙性疾病。目前，NO介導(dǎo)的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體-NO-cGMP信號通路與抑郁癥的發(fā)病機制假說很受關(guān)注。NO是一種非經(jīng)典的新型遞質(zhì)和信息傳遞分子，與腦血管結(jié)構(gòu)、血管通透性、微循環(huán)、神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)元興奮及炎性損害有關(guān)，既可作為神經(jīng)遞質(zhì)直接傳遞信息，也可作為神經(jīng)調(diào)質(zhì)影響其他神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，或作為第二信使傳遞細胞信息。但過量的NO卻會引起神經(jīng)毒性作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血漿NO濃度與抑郁癥狀嚴重程度顯著相關(guān)[10]。既往研究表明，NO-cGMP通路與抑郁發(fā)作的大致過程，除了NO直接參與學(xué)習(xí)、記憶在內(nèi)的多種生理過程外，通過谷氨酸-NMDA受體-NOS-NO-cGMP通路誘發(fā)抑郁發(fā)作。即突觸前部位釋放的谷氨酸結(jié)合到NMDA受體，增加Ca2+內(nèi)流和膜的去極化，激活NO合酶NOS，使NO合成增多，NO擴散到臨近細胞與鳥苷酸環(huán)化酶（GC）中Fe的結(jié)合，改變酶結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)化成cGMP，形成NO-cGMP通路，從而加大對神經(jīng)元的毒性，導(dǎo)致抑郁發(fā)作[11-12]。另外，NO直接影響NMDA受體的激活[13]。NMDA受體過度激活，同樣導(dǎo)致抑郁樣行為發(fā)生[14]。慢性應(yīng)激可能激活海馬內(nèi)谷氨酸- Ca2+-NMDA受體-NOS-NO-cGMP途徑，生成過量的NO，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。

蒙醫(yī)學(xué)“心思病”“悲傷狂”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)抑郁癥有共同之處。蒙醫(yī)學(xué)認為，人體是由三根、七素、三穢構(gòu)成。人體之所以能維持正常的生理活動，主要是體內(nèi)具有三根，即赫依、希拉、巴達干。機體三根中，若赫依的功能失調(diào)，則人的思辨能力、精神、神志出現(xiàn)異常。臨床上表現(xiàn)為情緒低落、精力減退、失眠健忘、疲乏、游離性疼痛等癥狀。當(dāng)巴達干功能紊亂時，則出現(xiàn)記憶力減退、思維遲鈍、意識模糊等癥狀。希拉功能失調(diào)，則出現(xiàn)口干、狂躁等癥狀。故蒙醫(yī)學(xué)認為，抑郁癥是體內(nèi)三根中赫依偏盛，并與希拉、巴達干相搏侵襲心，從而心腦血行障礙，阻塞白脈之傳導(dǎo)所致。蒙醫(yī)學(xué)中白脈類似于神經(jīng)系統(tǒng)，大腦是白脈之海，脊髓像樹根一樣向下延伸，分出司管臟器19條白脈，其中1條赫依性白脈延伸到第7椎與心臟相連。因此，與心相連的赫依性白脈之傳導(dǎo)受阻，心主神明的生理功能發(fā)生異常，則會出現(xiàn)抑郁樣行為。因此，抑郁癥的治療以鎮(zhèn)赫依、調(diào)理三根、寧心安神、促進白脈傳導(dǎo)為主要治療原則，根本在于調(diào)節(jié)體內(nèi)三根的相對平衡狀態(tài)。本實驗選取的“巴達干穴”“心穴”“黑白際穴”具有調(diào)節(jié)三根、安神作用，蒙醫(yī)銀針、蒙醫(yī)三根平衡針均有疏通白脈作用[15]。本研究尼氏染色顯示，模型組大鼠額葉神經(jīng)元與正常組比較，尼氏體變淺、大部分模糊不清；百憂解組、蒙醫(yī)三根平衡針組、蒙醫(yī)銀針組大鼠額葉神經(jīng)元形態(tài)較模型組細胞形態(tài)尚可，但與正常組和針?biāo)幗Y(jié)合組比較還有部分尼氏體溶解。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠額葉神經(jīng)元胞膜破裂、結(jié)構(gòu)不清楚；百憂解組、蒙醫(yī)三根平衡針組、蒙醫(yī)銀針組大鼠額葉細胞排列較規(guī)則，細胞層次較豐富，神經(jīng)元胞膜較完整，但與正常組和針?biāo)幗Y(jié)合組比較仍有部分細胞萎縮、胞核變小和核固縮。endprint

慢性應(yīng)激28 d后，額葉和海馬NO-cGMP的含量明顯增加，蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組、百憂解組和針?biāo)幗Y(jié)合組均能逆轉(zhuǎn)此變化，說明蒙醫(yī)不同針刺療法均有抗抑郁作用，但在海馬組織，針?biāo)幗Y(jié)合組cGMP含量明顯低于蒙醫(yī)銀針組、蒙醫(yī)三根平衡針組和百憂解組，說明針?biāo)幗Y(jié)合治療抑郁癥療效更好。與針刺聯(lián)合鹽酸帕羅西汀片治療輕中度抑郁癥臨床研究結(jié)果相似[16]。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，接受不同的針刺干預(yù)后NO-cGMP在海馬和額葉的表達有所不同，海馬中表達變化較額葉組織更明顯，表明對針刺刺激海馬神經(jīng)元較額葉敏感。本實驗結(jié)果顯示，蒙醫(yī)不同針刺法在對抑郁樣行為干預(yù)過程中均能調(diào)控NO-cGMP表達，這可能也是蒙醫(yī)針刺治療抑郁癥的作用機制之一。另一方面，NO-cGMP表達各組間有明顯的差異，說明蒙醫(yī)不同針法對抑郁癥的療效有所不同。

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