大蒜提取物對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響

丁榮榮，陳貴堂，楊志萍，王海翔，綦國紅

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京，211198)

大蒜提取物對銅綠假單胞菌生物膜形成的影響

丁榮榮，陳貴堂，楊志萍，王海翔，綦國紅*

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院，江蘇 南京，211198)

研究了大蒜提取物對銅綠假單胞菌PAO1生物膜形成的影響。通過對銅綠假單胞菌PAO1生物膜以及與生物膜形成相關(guān)因素的測定，結(jié)果表明大蒜提取物在不影響PAO1生長的濃度條件下，能抑制其生物膜的形成、胞外多糖的產(chǎn)生以及浮游現(xiàn)象；與阿奇霉素具有協(xié)同作用。因此，大蒜提取物通過干擾銅綠假單胞菌PAO1群體感應(yīng)系統(tǒng)來抑制其生物膜的形成，降低與生物膜形成相關(guān)特性的表達(dá)。

銅綠假單胞菌；生物膜；大蒜提取物；群體感應(yīng)抑制

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，簡稱PA)廣泛分布于健康人體皮膚、呼吸道和消化道等部位，是人體常見條件致病菌。也是醫(yī)院間發(fā)生感染的第三大致病菌，可引起多種急性或慢性感染，如腸道慢性炎癥、泌尿系統(tǒng)感染、肺炎等疾病。特別是感染后產(chǎn)生的生物膜， 對PA菌本身產(chǎn)生保護(hù)作用，增加了治療難度，也促生大量耐藥菌株的出現(xiàn)[1]。由于PA菌對多種抗生素的高效耐藥性，對于免疫力低下或患有其他病癥的患者具有嚴(yán)重的危害。因此，對PA菌致病性和耐藥性的研究具有重要意義。

很多革蘭氏陰性菌通過群體感應(yīng)(Quorum sensing，簡稱QS)方式調(diào)控某些特定生理性狀的表達(dá)，如生物浮游、生物膜的形成、抗菌肽的產(chǎn)生、毒性因子等。即細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生、釋放特定的小分子物質(zhì)，并能感知其濃度變化，調(diào)節(jié)自身特定基因的表達(dá)，從而改變?nèi)后w行為[2]。PA菌的致病性受其QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，以擴(kuò)散性小分子為信號物質(zhì)調(diào)控特定基因表達(dá)，涉及細(xì)胞毒素、致病因子、生物被膜等一系列細(xì)菌特征性表型[3]。因此，通過群體感應(yīng)抑制(Quorum sensing inhibition，簡稱QSI)原理來控制PA菌致病性的研究具有廣闊的發(fā)展前景。其機(jī)制不同于目前抗生素控制細(xì)菌感染的機(jī)制，即不是以抑制或殺滅致病菌為目的，而是通過阻斷其群體感應(yīng)通路來減少致病因子的表達(dá)，不會對致病菌生長產(chǎn)生選擇壓力，不會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗藥性問題[4]。

群體感應(yīng)抑制劑廣泛分布于自然資源中，包括藥用植物、食用果蔬和海藻等。人們熟知大蒜具有抗腫瘤，提高機(jī)體免疫力，抗氧化等多種生理活性[5]。而且大蒜在抗感染以及抗菌方面有很好的應(yīng)用前景[6-8]。但大蒜在群體感應(yīng)抑制方面的研究目前在國內(nèi)鮮有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)擬研究大蒜提取物對PA菌生物膜形成以及生物膜形成相關(guān)因子產(chǎn)生的影響，研究視角不同于已有研究大蒜素對銅綠假單胞菌生物膜及毒力因子表達(dá)的影響，為大蒜的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

銅綠假單胞菌PAO1，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 材料與試劑

白皮大蒜購自于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；甲苯(分析純),上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；苯酚(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸(分析純)，南京化學(xué)試劑股份有限公司；胰蛋白胨(生物試劑)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；YEAST，EXTRACT Oxoid Ltd；吖啶橙(Acridine Orange)，Sigma；注射用阿奇霉素,南京海辰藥業(yè)股份有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司； Elx800多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Microscope、Eclipse 80i光學(xué)顯微鏡，日本Nikon；TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大蒜提取物的制備

選成熟、干燥的蒜頭，去蒂、分瓣、剝皮，用清水漂洗，除去雜質(zhì)。稱取 150 g 蒜粒，加300 mL甲苯，用粉碎機(jī)將蒜粒搗成糊狀，靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，得上清，加入150 mL無菌蒸餾水，攪拌混勻，室溫靜置24 h，得水相，無菌過濾，分裝，于-18 ℃保藏，備用。粗提物的質(zhì)量濃度為1 g/mL。

1.4.2 對銅綠假單胞菌最小抑菌濃度(MIC)的測定

按文獻(xiàn)[9]方法，銅綠假單胞菌PAO1活化后，按1%接種量接種于新鮮LB培養(yǎng)基，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4。按菌液:提取物比例為9∶1進(jìn)行混合，大蒜提取物最終質(zhì)量濃度分別為50、60、70、80 mg/mL。對照組為LB培養(yǎng)基。于37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，觀察抑制生長的最低濃度。

1.4.3 對銅綠假單胞菌生長的抑制作用

按1.4.2方法制備含有不同濃度大蒜提取物的菌液后，分別在0、2、4、6、8、10 h時(shí)取200 μL培養(yǎng)液加入96孔板中用酶標(biāo)儀測定OD630nm值，繪制成生長曲線。

1.4.4 對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用

1.4.4.1 光學(xué)顯微鏡對生物膜的定性觀察

按1.4.2方法制備含有不同濃度提取物的菌液，分裝于錐形瓶中，將1.5 cm×1.5 cm的無菌玻璃片置于錐形瓶內(nèi)， 37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液，添加新鮮LB培養(yǎng)基和提取物后繼續(xù)靜置培養(yǎng)48 h。

取出玻璃片，無菌水沖洗表面浮菌， 45 ℃干燥30 min。0.2 %的結(jié)晶紫溶液染色2 min。無菌水洗掉多余的染色劑，45 ℃干燥30 min。用光學(xué)顯微鏡觀察，拍照，具體參見文獻(xiàn)[10-12]。

1.4.4.2 對生物膜的定量測定

參照文獻(xiàn)[13]按1.4.4.1方法操作，無菌輸液管片代替玻璃片。45 ℃干燥后輸液管片用無水乙醇洗脫3 min, 取200 μL洗脫液加入96孔板中,酶標(biāo)儀測490 nm的吸光度。按式(1)計(jì)算抑制率:

(1)

1.4.5 對成熟生物膜的破壞作用

PAO1按1%比例接種于新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600nm值為0.4，分裝于錐形瓶中，將玻璃片置于其中， 37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，加入不同濃度的大蒜提取物。再置于37 ℃靜置培養(yǎng)8 h，取出，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察，方法同1.4.4.1。

1.4.6 與抗生素的協(xié)同作用

按文獻(xiàn)[14]，PAO1按1%接種量接種于新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600nm值為0.4后，進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，對照組不加阿奇霉素，不加提取物；實(shí)驗(yàn)組一組加阿奇霉素，加提取物，另一組加阿奇霉素，不加提取物。每組加入等體積菌液，阿奇霉素終質(zhì)量濃度為10 μg/mL或5 μg/mL。大蒜提取物終質(zhì)量濃度 60 mg/mL。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，測定OD值，按公式(1)計(jì)算抑制率。

1.4.7 對胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用

PAO1培養(yǎng)至OD600nm值為0.4。 分裝至錐形瓶里，加入不同濃度的提取物， 37 ℃培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)20 h。取菌液12 000 r/min離心10 min，得上清，用無菌水稀釋，用苯酚-硫酸法測定胞外多糖[15]。

1.4.8 對浮游的抑制作用

按文獻(xiàn)[14],在9 mL含有1.5%瓊脂的LB固體培養(yǎng)基中，加入1 mL不同濃度的提取物，混勻后傾注平板，在平板上滴加2 μL PAO1培養(yǎng)液，無菌風(fēng)吹干后于37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)

根據(jù)PAO1的生長情況，以及測定培養(yǎng)物的OD值，確定大蒜提取物對PAO1的最小抑菌濃度是為80 mg/mL。

2.2 對銅綠假單胞菌生長的抑制作用

為進(jìn)一步確定提取物在MIC濃度下對銅綠假單胞菌生長是否有抑菌作用，對生長曲線進(jìn)行了測定。由圖1可知，提取物在60、70 mg/mL質(zhì)量濃度時(shí)對PAO1的生長過程以及最大生長量均無抑制作用，因此選上述濃度進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖1 大蒜提取物對PAO1生長抑制作用Fig.1 The growth inhibition of garlic extract to PAO1

2.3 對銅綠假單胞菌生物膜形成的抑制作用

提取物對生物膜形成的抑制體現(xiàn)在細(xì)胞爬片上細(xì)胞密度的減少與膜厚度的降低。由圖2可知，隨著提取物濃度的升高，所形成的生物膜上的細(xì)胞密度隨之降低，細(xì)胞團(tuán)塊變小，團(tuán)塊數(shù)量也隨之減少。說明提取物的濃度在不抑制PAO1生長的條件下，對PAO1的生物膜的形成具有抑制作用。

a:對照；b:大蒜提取物濃度60 mg/mL；c:大蒜提取物濃度70 mg/mL圖2 大蒜提取物對PAO1生物膜形成的影響(400×)Fig.2 Influence of PAO1 biofilms grown in the absence and presence of garlic extract(400×)

為進(jìn)一步證明提取物對PAO1生物膜產(chǎn)生具有抑制作用，進(jìn)行了定量測定，由圖3可知，提取物濃度為60 mg/mL、70 mg/mL時(shí)，對生物膜形成的抑制率分別為15.2 %和24.1 %，而且濃度升高，抑制率隨之升高。

2.4 對成熟生物膜的破壞作用

由圖4可知，PAO1正常形成的生物膜經(jīng)大蒜提取物處理后，隨著提取物濃度的增大，生物膜上細(xì)胞密度隨之減少，特別是70 mg/mL處理組的生物膜，細(xì)胞之間不再連成一片，說明提取物對PAO1成熟生物膜具有破壞作用。

圖3 大蒜提取物對PAO1生物膜形成的抑制作用Fig.3 Inhibition of garlic extract on biofilm formation of PAO1

a:對照；b:大蒜提取物濃度60 mg/mL；c:大蒜提取物濃度70 mg/mL圖4 大蒜提取物對成熟生物膜的破壞作用(400×)Fig.4 Destruction of mature biofilms grown by garlic extract

2.5 對胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用

由于胞外多糖是生物膜結(jié)構(gòu)的重要成分，所以影響生物膜產(chǎn)生的因素也會影響胞外多糖的產(chǎn)生。根據(jù)PAO1胞外多糖產(chǎn)生量的測定結(jié)果(圖5)可知，在測定的濃度條件下，提取物對PAO1胞外多糖的產(chǎn)生均有抑制作用，且70 mg/mL的抑制率高于60 mg/mL。

圖5 大蒜提取物對PAO1胞外多糖產(chǎn)生的抑制作用Fig.5 Inhibition of EPS production to PAO1 by garlic extract

2.6 對浮游的抑制作用

細(xì)菌浮游特性也是生物膜形成的重要因素，通過對PAO1浮游特性測定結(jié)果(圖6)表明,提取物濃度在60 mg/mL、70 mg/mL時(shí)能明顯抑制PAO1浮游，抑制率分別為16.42 %,17.61 %。

圖6 大蒜提取物對PAO1浮游的抑制作用Fig.6 Inhibition of motility of PAO1 by garlic extract

2.7 與抗生素的協(xié)同作用

由于銅綠假單胞菌生物膜的形成對抗生素的抗性增強(qiáng)，給臨床治療帶來了困難，因此我們對大蒜提取物與抗生素的協(xié)同作用進(jìn)行了研究。由圖7可知，阿奇霉素濃度不管在10 μg/ mL還是5 μg/mL,添加提取物組比不添加提取物組對PAO1生長抑制率都高，說明阿奇霉素和大蒜提取物具有協(xié)同作用，二者共同作用能顯著抑制PAO1生長，而且阿奇霉素在10 μg/mL的抑菌率明顯高于5 μg/mL。因此在不改變抗生素濃度的條件下，通過使用大蒜提取物，增加了PAO1對抗生素的敏感性。

圖7 大蒜提取物處理PAO1與抗生素的協(xié)同作用Fig.7 Synergistic effect of garlic extract with antibiotics to PAO1

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了大蒜提取物對銅綠假單胞菌生物膜產(chǎn)生的抑制作用。通過對生物膜以及與生物膜形成相關(guān)的多個(gè)特性的測定來說明這個(gè)問題。

首先，大家熟知大蒜具有很強(qiáng)的抑菌作用，通過前期試驗(yàn)對比了水提法與甲苯、水兩步提取法的抑菌活性，水提取物的抑菌活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于甲苯、水兩步法提取物，群體感應(yīng)抑制活性的濃度范圍也很窄。此結(jié)果與文獻(xiàn)[4,8]的研究結(jié)果是一致的。通過甲苯、水兩步法提取，去除了大蒜中的部分抑菌物質(zhì)，同時(shí)保留了其中的群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)。根據(jù)文獻(xiàn)[4]分析，經(jīng)過上述處理后，群體感應(yīng)抑制活性物質(zhì)也存在于甲苯相中，但與水相中是不同的物質(zhì)，所以也就不難解釋本研究測定的各項(xiàng)參數(shù)抑制率不是特別高的原因。

本研究測定的2個(gè)濃度60 mg/mL和70 mg/mL，在不影響PAO1生長的情況下對其生物膜的形成具有抑制作用，對成熟生物膜具有破壞作用，說明此種作用不是抑制生長所致，而是由群體感應(yīng)抑制作用所致。

細(xì)菌被自身分泌的胞外多糖包裹，而胞外多糖對生物膜結(jié)構(gòu)的形成至關(guān)重要，所以測定胞外多糖也能印證生物膜。而且胞外多糖賦予細(xì)菌病原體耐藥性，作為保護(hù)屏障和防止抗生素進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞。與抗生素協(xié)同作用也能體現(xiàn)對生物膜的影響[16]。圖7表明了大蒜提取物和阿奇霉素具有協(xié)同作用。在不提高抗生素濃度的條件下，協(xié)同使用大蒜提取物能夠增強(qiáng)受試菌的敏感性。浮游與生物膜的聯(lián)系體現(xiàn)在吸附于細(xì)胞的能力上，而且對細(xì)菌毒力有一定的影響[17]。圖6表明處理組浮游直徑明顯小于對照組。因此，大蒜提取物通過對銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)的干擾，抑制了生物膜的形成以及相關(guān)因素的表達(dá)。

目前已知大蒜提取物中某些化合物其化學(xué)結(jié)構(gòu)與 QS 系統(tǒng)的信號分子相似[18]，可作為 QS 系統(tǒng)的抑制劑，競爭性地與 QS 系統(tǒng)信號分子受體結(jié)合，阻斷 QS 的網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致細(xì)菌毒力因子的表達(dá)下降。 如果能從大蒜提取物中提取出有效的單體，它將可作為抗感染治療的一種新型藥物，為臨床解決耐藥問題向前推進(jìn)一步。

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Effect of garlic extract on development of biofilm inPseudomonasaeruginosa

DING Rong-rong, CHEN Gui-tang, YANG Zhi-ping, WANG Hai-xiang, QI Guo-hong*

(School of Engineering, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198，China)

The effect of garlic extract on the development of biofilm inPseudomonasaeruginosaPAO1 was studied. The biofilm production and factors correlated with the biofilm formation in PAO1 were evaluated. The results showed that the garlic extract not only inhibited the development of biofilm, extracellular polysaccharide production, and motility characteristic, but also had synergistic effect with Azithromycin when the concentration of garlic extractdidn’t affect growth of PAO1. The results suggested that garlic extract could inhibit the development of biofilm and reduce the expression of factors correlated with the biofilm formation inP.aeruginosaPAO1 by interfering with their QS systems.

Pseudomonasaeruginosa；biofilm；garlic extract；quorum sensing inhibitor

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702015

碩士研究生(綦國紅副教授為通訊作者，E-mail：qghbox@ 163.com)。

細(xì)菌群體感應(yīng)對魚蝦腐敗過程的調(diào)控作用及其分子機(jī)制(30700627)

2016-08-03，改回日期：2016-09-13