大豆低聚肽中抗氧化肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

劉文穎，谷瑞增，魯軍，潘興昌，蔡木易

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

大豆低聚肽中抗氧化肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

劉文穎，谷瑞增，魯軍，潘興昌，蔡木易*

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

為考察大豆低聚肽中抗氧化肽的活性和結(jié)構(gòu)，以大豆分離蛋白為原料，采用兩步酶解法制備出大豆低聚肽，在對(duì)其理化成分進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：大豆低聚肽的DPPH自由基清除活性的IC50值約為2.6 mg/mL。利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對(duì)大豆低聚肽進(jìn)行分離純化，收集6個(gè)組分峰，對(duì)其DPPH自由基清除能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，6個(gè)組分的活性均比大豆低聚肽高。最后利用Q-TOF質(zhì)譜儀對(duì)活性最高的組分5#進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，并對(duì)鑒定出的6個(gè)肽段的DPPH自由基清除活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，6個(gè)肽段均有一定的DPPH自由基清除能力，其中Leu-Tyr(LY)、Leu-Ala-Gly-Arg(LAGR)、Phe-Ser-Arg(FSR)的清除率比大豆低聚肽高，是具有較高抗氧化活性的肽段。

大豆低聚肽；抗氧化肽；分離純化；結(jié)構(gòu)鑒定

自由基會(huì)引起DNA損傷和細(xì)胞損傷，導(dǎo)致多種疾病和衰老的發(fā)生[1]。抗氧化劑能夠清除體內(nèi)多余的自由基，維持體內(nèi)自由基的平衡，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力，延緩衰老。目前由于人工合成抗氧化劑如叔丁基-羥基-茴香醚(BHA)、丁羥基-甲苯(BHT)、特丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)等存在潛在的危害，尋找天然安全的抗氧化劑成為研究的熱點(diǎn)[2]。天然抗氧化肽因具有較強(qiáng)抗氧化活性和很高的安全性，在食品等領(lǐng)域展現(xiàn)出極好的應(yīng)用前景。

大豆低聚肽是大豆蛋白經(jīng)過(guò)酶解后得到的短肽混合物，分子質(zhì)量大多在1 000 u以下，氨基酸組成與大豆蛋白基本相同，還具有大豆蛋白所不具備的良好的溶解性、穩(wěn)定性等理化性質(zhì)[3-4]。大豆低聚肽具有抗氧化、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗疲勞等多種生理功能，其中抗氧化性是大豆低聚肽其他生理活性的基礎(chǔ)[5]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于大豆肽抗氧化性的研究報(bào)道較多，然而，關(guān)于大豆低聚肽的分離純化及其結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系缺少深入和系統(tǒng)的研究。本研究以大豆分離蛋白為原料，通過(guò)生物酶解法制備大豆低聚肽，同時(shí)對(duì)大豆低聚肽中的抗氧化肽段進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，研究大豆低聚肽中抗氧化肽的活性及其結(jié)構(gòu)，為大豆低聚肽的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

大豆分離蛋白，實(shí)驗(yàn)室堿提酸沉法制得；堿性蛋白酶(2.4 AU/g)和中性蛋白酶(2.4 AU/g)，諾維信生物技術(shù)有限公司；乙腈(色譜純)，美國(guó)Fisher公司；三氟乙酸(分析純)，英國(guó)Alfa Aesar公司；2, 2-二苯基-1-苦味肼基自由基(DPPH)(色譜純)，美國(guó)Sigma公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，普瑞斯機(jī)械有限公司；YG30噴霧干燥機(jī)，無(wú)錫市陽(yáng)光干燥設(shè)備廠；Spectra MR酶標(biāo)儀，美國(guó)DYNEX公司；LC-20AD型高效液相色譜儀、FRC-10A收集器，日本SHIMADZU公司；XBridge BEH130 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，美國(guó)Waters公司；TSK gel G2000 SWXL凝膠過(guò)濾柱(7.8 mm×300 mm)，日本TOSOH公司；Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀，英國(guó)Micromass公司；model 90多肽合成儀，美國(guó)AAPPTec公司；Voyager DE-Pro MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀，美國(guó)ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大豆低聚肽的制備

采用本中心前期優(yōu)化好的制備工藝[3]。將80 g大豆分離蛋白溶于1 000 mL蒸餾水中，混合均勻。90 ℃水浴10 min后，降溫至55 ℃，調(diào)節(jié)蛋白溶液的pH值至8.5，以每克蛋白質(zhì)2 500單位的酶量加入堿性蛋白酶，酶解2 h。調(diào)節(jié)pH值為7.0，降溫至50 ℃，以每克蛋白質(zhì)3 000單位的酶量加入中性蛋白酶，酶解2 h。在水浴鍋中100 ℃滅酶15 min。冷卻至室溫后，利用離心機(jī)離心30 min，10 000×g。取上清液，用截留分子質(zhì)量為1 000 u的超濾膜超濾，得到分子質(zhì)量小于1 000 u的濾過(guò)液，利用噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥，得到大豆低聚肽干粉20 g(得率為25%)。

1.3.2 基礎(chǔ)理化成分測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定參照GB 5009.5；脂肪含量測(cè)定參照GB/T 5009.6；水分含量測(cè)定參照GB 5009.3；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4[6-9]。

1.3.3 體外抗氧化活性測(cè)定

以清除DPPH自由基能力為指標(biāo)，采用酶標(biāo)儀法進(jìn)行測(cè)定。在96孔酶標(biāo)板中加入樣品溶液100 μL和0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液100 μL。振蕩30 s后，避光反應(yīng)30 min，于517 nm下測(cè)定吸光度AS，同時(shí)測(cè)定100 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液與100 μL乙醇混合液的吸光度AC，以及100 μL樣品溶液與100 μL乙醇混合液的吸光度AB。計(jì)算公式為：

(1)

1.3.4 RP-HPLC分離大豆低聚肽

大豆低聚肽采用分析型C18色譜柱進(jìn)行RP-HPLC分離。色譜條件為：流動(dòng)相A為水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸)，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的三氟乙酸)；梯度洗脫程序：0～50 min，流動(dòng)相B：0%～15%；50～120 min，流動(dòng)相B：15%～40%；120～140 min，流動(dòng)相B：40%～80%；樣品質(zhì)量濃度：10 mg/mL；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV 220 nm；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣體積：100 μL。分管收集主要的組分峰，利用氮吹儀除去收集液中的三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑，冷凍干燥備用[11]。

1.3.4 Q-TOF MS測(cè)定分子質(zhì)量及肽序列

采用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，質(zhì)譜條件為：離子化方式：納升電噴霧正離子；霧化氣體：N2；碰撞氣體：Ar；源溫：80 ℃；錐孔電壓：50 V；TOF加速電壓：9.1 kV；MCP檢測(cè)器電壓：2 150 V；毛細(xì)管電壓：800 V；MS和MS/MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度：0.1 u[11]。

1.3.5 肽段合成方法

肽段合成由北京中科亞光生物科技有限公司進(jìn)行。采用多肽固相合成法(Fmoc方法)，利用多肽合成儀合成粗肽。然后利用分析型HPLC對(duì)粗肽進(jìn)行檢測(cè)，純度為60%左右。用水將粗肽溶解，利用制備型HPLC進(jìn)行純化，凍干得到純品，再用分析型HPLC進(jìn)行檢測(cè)，純度為98%以上，利用質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，保證分子質(zhì)量正確。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有圖中誤差值采用SD值。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆低聚肽的基礎(chǔ)理化成分

大豆低聚肽中蛋白質(zhì)含量為(88.69±4.32)%，脂肪含量為(0.05±0.01)%，水分含量為(4.96±0.59)%，灰分含量為(5.23±0.68)%。這表明大豆低聚肽中蛋白質(zhì)含量較高，而其他成分含量較少，可作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)原料。因此，以大豆分離蛋白為原料，通過(guò)復(fù)合酶解法可以有效獲得大豆低聚肽產(chǎn)品。

2.2 大豆低聚肽的體外抗氧化作用

以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)評(píng)價(jià)大豆低聚肽的體外抗氧化作用。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液顯紫色，在517 nm處有最大吸收[12]。DPPH法是評(píng)價(jià)抗氧化物的自由基清除能力的常用方法，能比較全面地評(píng)價(jià)抗氧化活性[13]。當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑存在時(shí)(如酚類(lèi))，DPPH自由基溶液的顏色變淺，吸光度值變小，根據(jù)吸光度的變化可測(cè)得抗氧化劑的活性。

大豆低聚肽的DPPH自由基清除能力如圖1所示。

圖1 大豆低聚肽對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effects of SOP on DPPH radical

在實(shí)驗(yàn)濃度內(nèi)，大豆低聚肽對(duì)DPPH自由基清除率隨濃度的增大而不斷增強(qiáng)。在高濃度時(shí)，清除率上升趨勢(shì)減緩，這可能是由于低聚肽已經(jīng)趨于飽和的原因。濃度15 mg/mL時(shí)，大豆低聚肽的清除率為(90.10±3.79)%，半抑制濃度(IC50值)約為2.6 mg/mL。說(shuō)明大豆低聚肽具有供氫能力，從而起到清除DPPH自由基的作用。大豆低聚肽的供氫能力與其氨基酸組成有關(guān)，具有質(zhì)子供體特性的氨基酸殘基是其抗氧化活性的必要組成，能夠?qū)湓咏o予自由基，阻斷或減弱自由基反應(yīng)，從而達(dá)到抗氧化效果[14]。

2.3 大豆低聚肽的分離純化

大豆低聚肽是由多種肽段組成的低聚肽混合物，為了獲得單一肽段，需要對(duì)大豆低聚肽進(jìn)行分離純化。常用的分離方法有高效液相色譜、離子交換層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠過(guò)濾色譜、超濾等。蛋白質(zhì)及肽段分離中常常采用RP-HPLC法，具有操作簡(jiǎn)單、色譜過(guò)程穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種高效的短肽分離手段[15]。大豆低聚肽的分離色譜圖見(jiàn)圖2，收集6個(gè)主要的組分峰，經(jīng)冷凍干燥后，得到干粉狀樣品。6個(gè)組分的得率分別為1.84%、1.27%、1.35%、1.92%、2.25%、1.93%。

圖2 大豆低聚肽的RP-HPLC分離色譜圖Fig.2 RP-HPLC separation chromatogram of SOP

2.4 大豆低聚肽分離組分的體外抗氧化作用

濃度為2.0 mg/mL時(shí)，大豆低聚肽6個(gè)組分的DPPH自由基清除活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 大豆低聚肽中RP-HPLC組分對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of RP-HPLC fraction of SOP on DPPH radical

通過(guò)對(duì)DPPH自由基清除活性分析可知，大豆低聚肽的6個(gè)組分均具有一定DPPH自由基清除活性，并且所有組分的抗氧化能力均比總肽強(qiáng)。這可能由于C18柱能夠?qū)⑾嗤蛳嘟杷缘亩嚯母患谝黄穑@些肽段具有很多相同的氨基酸側(cè)鏈，而肽段的抗氧化活性與氨基酸側(cè)鏈上的某些基團(tuán)有關(guān)，例如組氨酸的吲哚基團(tuán)具有較強(qiáng)的抗氧化活性[16]，最終使得總體抗氧化能力增大。組分5#的活性最高((82.34±7.01)%)，清除率是大豆低聚肽((39.32±4.25)%)的2.1倍。進(jìn)一步對(duì)組分5#的DPPH自由基清除能力進(jìn)行IC50值分析，結(jié)果見(jiàn)圖4所示。經(jīng)計(jì)算，組分5#的IC50值為1.0 mg/mL，呈顯著的量效關(guān)系。因此，選擇組分5#進(jìn)行下一步的結(jié)構(gòu)鑒定。

圖4 大豆低聚肽中組分5#對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of faction 5# of SOP on DPPH radical

2.5 大豆低聚肽中抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定

蛋白質(zhì)和多肽序列分析的傳統(tǒng)方法是用氨基酸分析儀或埃德曼降解法，但這些方法存在樣品需要量多、樣品純度要求高、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。近年來(lái)，質(zhì)譜在蛋白質(zhì)和多肽領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展很快。其中，Q-TOF質(zhì)譜儀是采用電噴霧離子源(ESI)和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)，通過(guò)對(duì)各個(gè)組分二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子的質(zhì)譜圖解譜得到肽段的氨基酸序列結(jié)構(gòu)，樣品用量少，能夠?qū)ξ⒘炕旌隙嚯倪M(jìn)行序列分析及對(duì)新蛋白進(jìn)行序列分析。利用Q-TOF質(zhì)譜儀對(duì)組分5#進(jìn)行分析，共鑒定出6個(gè)肽段，肽段結(jié)構(gòu)如表1所示。

表1 Q-TOF MS鑒定出的大豆低聚肽組分5#的肽段結(jié)構(gòu)

濃度為2.0 mg/mL時(shí)，6個(gè)肽段的DPPH自由基清除活性如圖5所示。

從圖5中可知，6個(gè)肽段均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中，LY的清除能力最強(qiáng)((85.32±5.26)%)，LAGR((56.48±5.03)%)、FSR((49.87±3.62)%)次之，并且這3個(gè)肽段的清除能力均比同等濃度下的大豆低聚肽強(qiáng)((39.32±4.25)%)，因此，對(duì)大豆低聚肽的抗氧化活性起到了重要作用。進(jìn)一步對(duì)LY、LAGR、FSR進(jìn)行IC50值分析。經(jīng)計(jì)算，LY、LAGR、FSR清除DPPH自由基的IC50值分別為0.9、1.8、2.0 mg/mL，呈顯著的量效關(guān)系。

圖5 大豆低聚肽中肽段對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of peptides from SOP on DPPH radical

肽段的抗氧化活性與其氨基酸組成和一級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系[14](表1)。研究表明，抗氧化活性主要來(lái)源于具有抗氧化性的氨基酸，如Arg、Cys、His、Trp、Leu、Phe、Pro、Val、Tyr[17]。LY、LAGR、FSR中均含有抗氧化性氨基酸，這可能是3種肽段具有抗氧化活性的一個(gè)原因。Tyr是具有質(zhì)子供體特性的氨基酸，能夠通過(guò)其供氫能力將氫原子給予自由基后，形成的苯氧自由基借助共振而穩(wěn)定，從而導(dǎo)致自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的減慢或終止[18]。LY中有Tyr，這可能是其DPPH自由清除活性較高的原因。此外，肽鏈內(nèi)氨基酸之間的短程相互作用能夠強(qiáng)化作為質(zhì)子供體的氨基酸的抗氧化活性，單純的氨基酸的抗氧化活性低于其所組成的抗氧化作用[14]。除LY、LAGR、FSR外，其余3個(gè)肽段也具有一定的DPPH自由基清除能力，盡管比大豆低聚肽弱，但是肽段間的協(xié)同作用也會(huì)對(duì)整體原料肽的活性起到一定的作用[19]。

3 結(jié)論

本文通過(guò)兩步酶解法制備出大豆低聚肽，以DPPH自由基清除能力為指標(biāo)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。其DPPH自由基清除能力呈顯著的量效關(guān)系，IC50值約為2.6 mg/mL。經(jīng)RP-HPLC分離純化后，利用Q-TOF質(zhì)譜儀對(duì)抗氧化活性最高的組分5#進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定出的6個(gè)肽段均具有一定的DPPH自由基清除能力。其中LY、LAGR、FSR的DPPH自由基清除能力比大豆低聚肽高，是具有較高抗氧化活性的肽段，并且都是本研究新發(fā)現(xiàn)的大豆蛋白來(lái)源抗氧化肽。本研究明確了大豆低聚肽的抗氧化活性，并對(duì)其含有的抗氧化肽進(jìn)行了分離和結(jié)構(gòu)鑒定，為大豆低聚肽的開(kāi)發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Separation, purification and structural identification of antioxidant peptides derived from soybean oligopeptides

LIU Wen-ying, GU Rui-zeng, LU Jun, PAN Xing-chang, CAI Mu-yi*

(Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides,China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 100015, China)

In order to investigate the activity and structure of antioxidant peptides derived from soybean oligopeptides (SOP), SOP was prepared by two-step enzymolysis. On the basis of analysis of compositions, the antioxidant activity of SOP was evaluated by DPPH radical scavenging activity. The results showed that the half-inhibition concentration (IC50) of DPPH radical scavenging activity of SOP was approximately 2.6 mg/mL. Then, SOP was separated and purified by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The DPPH radical scavenging activity was evaluated in 6 collected fractions. The results indicated that all fractions had higher DPPH radical scavenging activity than SOP. Finally, Q-TOF mass spectrometer was applied in identification of peptides in fraction # 5 and its DPPH radical scavenging activity of 6 identified peptides was analyzed. The results indicated that all the peptides exhibited DPPH radical scavenging activity and Leu-Tyr (LY), Leu-Ala-Gly-Arg (LAGR) and Phe-Ser-Arg (FSR) showed stronger activities than SOP. And they all had higher antioxidant capacity.

soybean oligopeptides; antioxidant peptides; separation and purification; structural identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702008

碩士，工程師(蔡木易教授級(jí)高級(jí)工程師為通訊作者，E-mail：caimuyi@vip.sina.com)。

國(guó)家十三五重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0400604)；國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102205-02)

2016-06-20，改回日期：2016-07-19